本發(fā)明屬于生物醫(yī)學技術領域，尤其涉及一種治療脊髓損傷肌肉萎縮的藥物及其使用方法。

背景技術：

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種嚴重的中樞系統(tǒng)疾患，導致不可逆的運動及感覺功能障礙。脊髓損傷導致的肌肉萎縮，是臨床常見脊髓損傷后并發(fā)癥，將會導致運動功能進一步喪失，影響康復治療，降低恢復機會，增加臥床時間以及其他并發(fā)癥發(fā)生概率。目前針對脊髓損傷后肌肉萎縮的治療主要局限在恢復晚期的康復治療，此時肌肉中的基因表達和蛋白表型往往已經發(fā)生改變，另外已經萎縮的肌肉往往進一步影響患者的康復進程，產生惡性循環(huán)，因此，找到一種早期可以在分子水平維持肌肉狀態(tài)的藥物是一種具有臨床應用前景的修復策略，以往研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素II受體阻斷劑能夠緩解馬凡綜合征和杜氏肌營養(yǎng)不良以及由于廢用導致的肌肉萎縮，因此本研究探討血管緊張素II受體阻斷劑能否緩解脊髓損傷導致的骨骼肌萎縮，以及探索其可能的作用機制。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種治療脊髓損傷肌肉萎縮的藥物及其使用方法，旨在解決血管緊張素II受體阻斷劑能否緩解脊髓損傷導致的骨骼肌萎縮的問題。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種治療脊髓損傷肌肉萎縮的藥物，所述治療脊髓損傷肌肉萎縮的藥物為氯沙坦。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述治療脊髓損傷肌肉萎縮的藥物的使用方法，所述治療脊髓損傷肌肉萎縮的藥物的使用方法為氯沙坦激活IGF1/Akt/mTOR信號通路并抑制MAFbx和MuRF-1表達；血管緊張素II受體阻斷劑通過激活IGF-1/Akt/mTOR通路和抑制泛素-蛋白酶體系統(tǒng)產生作用。

本發(fā)明提供的治療脊髓損傷肌肉萎縮的藥物及其使用方法，證實了氯沙坦可以激活IGF1/Akt/mTOR信號通路并抑制MAFbx和MuRF-1表達，一定程度上緩解肌肉萎縮，但無論肌肉重量還是肌纖維粗細均始終未能達到正常水平；未能觀察到運動功能的明顯改善。血管緊張素II受體阻斷劑可以一定程度上改善大鼠脊髓損傷后骨骼肌萎縮并可能通過激活IGF-1/Akt/mTOR通路和抑制泛素-蛋白酶體系統(tǒng)產生作用，為后期臨床應用和聯(lián)合治療提供了部分依據(jù)。通過脊髓損傷早期應用氯沙坦，可以幫助患者在脊髓損傷早期集中精力救治生命及處理致命的并發(fā)癥的同時維持肌肉狀態(tài)，避免萎縮，為后期的康復訓練爭取條件，避免進入“肌肉萎縮-康復訓練困難-肌肉進一步萎縮”的惡性循環(huán)，最終為患者的臨床神經功能改善創(chuàng)造條件。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例提供的血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑治療脊髓損傷肌肉萎縮的模型的構建方法流程圖。

圖2是本發(fā)明實施例提供的氯沙坦抑制脊髓損傷誘導的肌肉萎縮示意圖；

圖中：(A)脊髓損傷后14天腓腸肌重量相對損傷前的百分比(％of pre-operative body weight)；(B)HE染色示脊髓損傷后肌纖維變圓，變小，且異質性增加，而氯沙坦治療后部分緩解；(C)最小Feret直徑(minimal Feret’s diameter)示脊髓損傷后細肌纖維比例增加，而氯沙坦治療后部分緩解；(D)平均值計算氯沙坦治療組確實增加肌纖維最小Feret直徑。Scale bars,200μm；

Sham空白對照組；SCI脊髓損傷組；SCI+LOS脊髓損傷聯(lián)合氯沙坦治療組；*相對Sham組P<0.05；#相對SCI組P<0.05。

圖3是本發(fā)明實施例提供的BB評分對脊髓損傷后后肢行為學功能評價示意圖；脊髓損傷后各組大鼠BBB評分均逐漸上升；從BBB評分上看，未反映氯沙坦治療組運動功能得到明顯改善；

Sham空白對照組；SCI脊髓損傷組；SCI+LOS脊髓損傷聯(lián)合氯沙坦治療組；*相對Sham組P<0.05；#相對SCI組P<0.05。

圖4是本發(fā)明實施例提供的血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1)阻滯劑激活IGF1/Akt/mTOR信號通路在脊髓損傷誘導的大鼠骨骼肌中示意圖；

圖中：(A)IGF-1的mRNA在大鼠腓腸肌中的定量分析可見,氯沙坦顯著增加IGF-1在大鼠腓腸肌中的表達；(B)Western blot分析提示氯沙坦激活IGF1/Akt/mTOR信號傳遞通路；(C和D)pAkt和p-mTOR的相對表達水平使用標準化后的單位(arbitrary units，AUs)評估示磷酸化比例增加，通路激活；

Sham空白對照組；SCI脊髓損傷組；SCI+LOS脊髓損傷聯(lián)合氯沙坦治療組；*相對Sham組P<0.05；#相對SCI組P<0.05。

圖5是本發(fā)明實施例提供的氯沙坦下調腓腸肌中MAFbx和MuRF-1表達水平示意圖；

圖中：MAFbx(A)和MuRF-1(B)的表達水平在脊髓損傷后顯著增加,而氯沙坦的治療則顯著降低其相應表達；Sham空白對照組；SCI脊髓損傷組；SCI+LOS脊髓損傷聯(lián)合氯沙坦治療組；*相對Sham組P<0.05；#相對SCI組P<0.05。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結合附圖對本發(fā)明的應用原理作詳細的描述。

如圖1所示，本發(fā)明實施例提供的血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑治療脊髓損傷肌肉萎縮的模型的構建方法包括以下步驟：

S101：體積分數(shù)10％水合氯醛腹腔麻醉后，大鼠取俯臥位固定于小動物手術臺，以T10為中心背部正中縱行切口，逐層分離皮膚及皮下組織，暴露并咬除T10棘突及椎板，顯露硬膜；

S102：Impactor Model II脊髓打擊器制作中度打擊模型(25mm，10g)，打擊后實驗動物出現(xiàn)鼠尾擺動和后肢痙攣，關閉傷后；

S103：手術后每日采用盲法使用BBB評分對大鼠后肢運動功能進行評估，早期運動功能明顯偏離恢復曲線的大鼠視為造模失敗并予以排除出組。

下面結合實驗對本發(fā)明的應用原理作進一步的描述。

1材料和方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物

健康雌性Wistar成年大鼠30只，8周齡，體重(220±10)g，中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所供。

1.1.2主要試劑及儀器

兔抗大鼠多克隆抗體(CST，美國)；辣根過氧化物標記山羊抗兔IgG(碧云天，中國)；Trizol reagent(Invitrogen，美國)；cDNA Synthesis Kit(BioRad，美國)；Impactor ModelⅡ打擊器；恒溫冰凍切片機(LEUCER，USA)。

1.2實驗方法

1.2.1SCI動物模型的制備

體積分數(shù)10％水合氯醛腹腔麻醉滿意后，大鼠取俯臥位固定于小動物手術臺，以T10為中心背部正中縱行切口，逐層分離皮膚及皮下組織，暴露并咬除T10棘突及椎板，顯露硬膜。Impactor Model II脊髓打擊器制作中度打擊模型(25mm，10g)，打擊后實驗動物出現(xiàn)鼠尾擺動和后肢痙攣，小心關閉傷后，手術后每日采用盲法使用BBB評分對大鼠后肢運動功能進行評估，早期運動功能明顯偏離恢復曲線的大鼠視為造模失敗并予以排除出組。

1.2.2實驗動物分組

空白對照組(Sham group)采用僅行椎板去除暴露硬膜，不進行打擊損傷；脊髓損傷組(SCI group)僅行脊髓打擊，無藥物干預；脊髓損傷聯(lián)合氯沙坦治療組(SCI+LOS group)與脊髓損傷造模后即每天給予氯沙坦(5mg/kg)飲用，每組實驗動物10只。

1.2.3取材

術后14天脫頸處死大鼠，迅速暴露大鼠小腿后側腓腸肌，小心暴露小腿近端內外側頭附著點及遠端附著點，完整分離后去除腱性組織和周圍附著軟組織后稱重，行形態(tài)學檢查標本置入10％中性甲醛固定，其余標本迅速置入-80℃儲存后準備下一步實驗。

1.2.4HE染色

采用常規(guī)HE染色方法：標本固定完成后，常規(guī)脫水，石蠟包埋，取腓腸肌靠近中部位置，5μm厚度切片。切片完成后烘烤晾干，常規(guī)二甲苯、乙醇梯度脫蠟，清洗后蘇木精染色，沖洗后乙醇梯度脫水伊紅染色，脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察形態(tài)。肌纖維橫截大小采用最小Feret直徑(minimal Feret’s diameter，MFD)作為檢測指標以最小化切割角度等因素造成的誤差。比較不同肌纖維橫截面大小的分布以及計算均值，來評估和比較腓腸肌萎縮變化程度。

1.2.5Western blot檢測

取冰凍標本，按比例加入細胞裂解液(50mM Tris，pH 7.4，150mM NaCl，1％Triton X-100，1％sodium deoxycholate，0.1％SDS)及蛋白酶和磷酸酶抑制劑。勻漿置于離心機12000轉20分鐘后收集上清，BCA法測定蛋白濃度并調一致，進行SDS凝膠電泳后轉至硝酸纖維素膜。5％脫脂奶粉或5％BSA封閉，一抗4℃過夜，一抗包括：p-Akt(Ser473)，total Akt，p-mTOR(Ser2448)，total mTOR(CST，美國)，and total GAPDH(碧云天，中國)。二抗采用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔室溫孵育。化學增強發(fā)光法(ECL)曝光顯影定影，定量數(shù)據(jù)分析采用Image J軟件(National Institutes of Health，美國)。

1.2.6Real-time PCR檢測

Trizol冰上提取腓腸肌總RNA，檢測確定RNA質量良好無降解，逆轉錄為cDNA。以大鼠GAPDH為內參分析IGF-1，MAFbx，MuRF-1。引物由Invitrogen公司合成，相對定量法2^-△△Ct計算各基因表達。各引物序列如下：

IGF-1(FW:5’-GCACTCTGCTTGCTCACCTTTA-3’，

REV:5’-TCCGAATGCTGGAGCCATA-3’)，

MAFbx(FW:5’-AGAAAAGCGGCACCTTCGT-3’，

REV:5’-CTTGGCTGCAACATCGTAGTTC-3’)，

MuRF-1(FW:5’-GAGAACCTGGAGAAGCAGCTCAT-3’，

REV:5’-CCGCGGTTGGTCCAGTAG-3’)，

GAPDH(FW:5’-TCACCACCATGGAGAAGGC-3’，

REV:5’-GCTAAGCAGTTGGTGGTGCA-3’)，

1.2.7統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0軟件包進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用Student-Newman-Keuls方法，免疫組化染色的數(shù)字圖像采用Image pro plus 6.0軟件進行圖像分析，設P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1氯沙坦對脊髓損傷后肌肉萎縮的抑制作用

目前認為脊髓損傷后肌肉萎縮程度可能受肌纖維類型影響，因此作為探索性研究，我們選則快慢肌纖維構成比相對適中的腓腸肌作為研究對象。結果顯示，脊髓損傷后腓腸肌萎縮程度較重，2周時可降低約27.7％-51.7％。而通過氯沙坦干預，能夠一定程度恢復肌肉質量。而肌纖維橫截面大小從HE染色上可見在脊髓損傷后2周時，腓腸肌肌纖維橫截面部分變小變圓且變異程度變大，而氯沙坦治療后形態(tài)有所恢復。通過不同肌纖維橫截面分布分析，單純脊髓損傷后較細的肌纖維所占比例增多，而統(tǒng)計學計算均值結果一致。盡管氯沙坦治療后肌肉萎縮程度有所改善(P<0.05)，但未能恢復至空白對照組水平(P<0.05)。

2.2氯沙坦對脊髓損傷大鼠運動功能的作用

通過動態(tài)觀察不同組之間BBB評分，大鼠脊髓損傷后，BBB評分在術后當天為0，此后逐漸恢復，至術后第14天，恢復至8左右水平，氯沙坦治療組未能提高脊髓損傷大鼠行為學評分(P>0.05)。

2.3氯沙坦激活IGF1/Akt/mTOR信號通路

Real-time PCR的結果顯示脊髓損傷后IGF-1水平在術后14天時，基本不變，而通過氯沙坦干預后表達顯著上升(P<0.05)。而Western blot結果顯示，氯沙坦治療后腓腸肌中磷酸化Akt和mTOR蛋白表達明顯增加，提示該通路激活。

2.4氯沙坦抑制MAFbx和MuRF-1表達

脊髓損傷后2周，MAFbx和MuRF-1表達明顯上調，而聯(lián)合氯沙坦治療組，，MAFbx和MuRF-1則下調至接近正常水平，相比單純脊髓損傷組差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

本實驗證實了氯沙坦可以激活IGF1/Akt/mTOR信號通路并抑制MAFbx和MuRF-1表達，一定程度上緩解肌肉萎縮，但無論肌肉重量還是肌纖維粗細均始終未能達到正常水平。本實驗未能觀察到運動功能的明顯改善。

圖2是本發(fā)明實施例提供的氯沙坦抑制脊髓損傷誘導的肌肉萎縮示意圖；

圖中：(A)脊髓損傷后14天腓腸肌重量相對損傷前的百分比(％of pre-operative body weight)；(B)HE染色示脊髓損傷后肌纖維變圓，變小，且異質性增加，而氯沙坦治療后部分緩解；(C)最小Feret直徑(minimal Feret’s diameter)示脊髓損傷后細肌纖維比例增加，而氯沙坦治療后部分緩解；(D)平均值計算氯沙坦治療組確實增加肌纖維最小Feret直徑。Scale bars,200μm；

Sham空白對照組；SCI脊髓損傷組；SCI+LOS脊髓損傷聯(lián)合氯沙坦治療組；*相對Sham組P<0.05；#相對SCI組P<0.05。

圖3是本發(fā)明實施例提供的BB評分對脊髓損傷后后肢行為學功能評價示意圖；脊髓損傷后各組大鼠BBB評分均逐漸上升；從BBB評分上看，未反映氯沙坦治療組運動功能得到明顯改善；

Sham空白對照組；SCI脊髓損傷組；SCI+LOS脊髓損傷聯(lián)合氯沙坦治療組；*相對Sham組P<0.05；#相對SCI組P<0.05。

圖4是本發(fā)明實施例提供的血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1)阻滯劑激活IGF1/Akt/mTOR信號通路在脊髓損傷誘導的大鼠骨骼肌中示意圖；

圖中：(A)IGF-1的mRNA在大鼠腓腸肌中的定量分析可見,氯沙坦顯著增加IGF-1在大鼠腓腸肌中的表達；(B)Western blot分析提示氯沙坦激活IGF1/Akt/mTOR信號傳遞通路；(C和D)pAkt和p-mTOR的相對表達水平使用標準化后的單位(arbitrary units，AUs)評估示磷酸化比例增加，通路激活；

Sham空白對照組；SCI脊髓損傷組；SCI+LOS脊髓損傷聯(lián)合氯沙坦治療組；*相對Sham組P<0.05；#相對SCI組P<0.05。

圖5是本發(fā)明實施例提供的氯沙坦下調腓腸肌中MAFbx和MuRF-1表達水平示意圖；

圖中：MAFbx(A)和MuRF-1(B)的表達水平在脊髓損傷后顯著增加,而氯沙坦的治療則顯著降低其相應表達；Sham空白對照組；SCI脊髓損傷組；SCI+LOS脊髓損傷聯(lián)合氯沙坦治療組；*相對Sham組P<0.05；#相對SCI組P<0.05。

綜上所述，血管緊張素II受體阻斷劑可以一定程度上改善大鼠脊髓損傷后骨骼肌萎縮并可能通過激活IGF-1/Akt/mTOR通路和抑制泛素-蛋白酶體系統(tǒng)產生作用，為后期臨床應用和聯(lián)合治療提供了部分依據(jù)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。