本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明涉及一種膽綠素制劑及其應(yīng)用和檢測方法，具體涉及一種膽綠素制劑及其在抗PRRSV中的應(yīng)用和檢測方法。

背景技術(shù)：

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)又稱豬藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的對全球養(yǎng)豬業(yè)危害極大的豬重要傳染病。PRRS主要引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、弱仔以及各年齡段豬特別是仔豬呼吸道癥狀，特征性病變?yōu)殚g質(zhì)性肺炎，死亡率極高。

PRRSV的防控是目前我國乃至世界的難題。PRRSV難于防控主要表現(xiàn)在以下幾方面：

(1)嗜巨噬細(xì)胞性和免疫抑制性疾病，PRRSV主要感染豬肺泡巨噬細(xì)胞(Porcine alveolar macrophages,PAMs),PAMs是免疫細(xì)胞，破壞PAMs，從而破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)，引起免疫抑制；

(2)抗原變異性，目前PRRSV變異較快，弱毒疫苗的使用是促使病毒變異的一個(gè)原因，疫苗沒有交叉保護(hù)力；

(3)抗體依賴性增強(qiáng)，PRRSV的感染會刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，但低效價(jià)的抗體不但不能中和病毒，反而對病毒的增殖有促進(jìn)作用；

(4)病毒持續(xù)性感染，PRRSV感染后，能夠長時(shí)間在豬體內(nèi)檢測到病毒血癥；

(5)混合感染，目前臨床上混合感染，特別是圓環(huán)病毒、副豬嗜血桿菌等與PRRSV的混合感染使PRRSV防控難上加難。

因此，急需開發(fā)新的抗PRRSV感染的藥物，有效防治豬藍(lán)耳病的發(fā)生。

膽綠素的英文名稱是Biliverdin，其結(jié)構(gòu)式如式Ⅰ所示。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，提供一種膽綠素制劑，以克服現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述缺點(diǎn)和不足。本發(fā)明為了克服現(xiàn)有防控PRRSV的疫苗存在的問題，尋找一種對PRRSV有很好抗病毒效果的藥物，以更好的防治豬藍(lán)耳病。

本發(fā)明的目的在于，提供一種膽綠素制劑在防治豬繁殖與呼吸綜合征中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的在于，提供一種抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒藥物制劑。

本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問題，可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

首先檢測膽綠素對PRRSV感染Marc-145細(xì)胞的影響。不同濃度的膽綠素處理PRRSV感染后的Marc-145細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和western blot檢測結(jié)果表明，膽綠素呈現(xiàn)濃度梯度依賴性的抑制PRRSV ORF7mRNA和核衣殼蛋白(N)表達(dá)。通過TCID₅₀檢測了PRRSV感染后細(xì)胞培養(yǎng)上清中子代病毒滴度，結(jié)果表明，隨著膽綠素濃度的升高，上清中PRRSV病毒滴度顯著降低。

進(jìn)一步，檢測膽綠素對PRRSV感染PAM細(xì)胞的影響。采用western blot、TCID₅₀檢測了膽綠素對PRRSV感染的影響。結(jié)果表明，膽綠素處理抑制了PRRSV核衣殼蛋白(N)的表達(dá)、顯著的降低了細(xì)胞培養(yǎng)上清中PRRSV子代病毒滴度。

最后，采用間接免疫熒光(IFA)檢測了其對PRRSV感染PAM細(xì)胞的影響。結(jié)果和前面的一致，表明膽綠素呈現(xiàn)濃度梯度依賴性的抑制PRRSV的復(fù)制。

綜上所述，膽綠素對PRRSV感染有抑制活性，可開發(fā)成防治PRRSV感染的藥物。從而為PRRS的防治提供了一個(gè)全新的思路，對實(shí)際生產(chǎn)有著重要的意義。

本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明采用了膽綠素生產(chǎn)工藝成熟，可以為抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的藥物制備提供充足的原料。

2、膽綠素抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的效果明顯，本發(fā)明通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，膽綠素能顯著抑制PRRSV在Marc-145細(xì)胞和PAM細(xì)胞中復(fù)制與增殖。

3、本發(fā)明使用方便，藥品為粉末制劑，2-8℃密封保存即可保存，易于運(yùn)輸，且即溶即用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖1為qPCR檢測不同濃度膽綠素處理后PRRSV ORF7 mRNA表達(dá)。

圖2為western blot檢測不同濃度膽綠素處理對PRRSV感染Marc-145細(xì)胞的影響。

圖3為不同濃度膽綠素處理后Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)上清PRRSV TCID₅₀的測定。

圖4為western blot檢測不同濃度膽綠素處理對PRRSV感染PAM細(xì)胞的影響。

圖5為不同濃度膽綠素處理后PAM細(xì)胞培養(yǎng)上清PRRSV TCID₅₀的測定。

圖6位間接免疫熒光檢測不同濃度膽綠素處理對PAM細(xì)胞中PRRSV N蛋白表達(dá)的影響

附圖標(biāo)記：圖6為合并綠光和藍(lán)光的結(jié)果，其中中間藍(lán)色部分為細(xì)胞核部分，由DAPI染色；上面綠色熒光為標(biāo)記了FITC的病毒N蛋白。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。除非特別說明，本發(fā)明采用的試驗(yàn)方法、試劑以及設(shè)備均為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)方法、試劑和設(shè)備。

實(shí)施例1膽綠素的配制

將膽綠素(購自美國Sigma公司)溶解于0.1mol/L的NaOH，用1mol/L的HCL調(diào)pH值至7.4，再用PBS倍比稀釋，用0.2μM的濾膜過濾除菌，分裝后用錫箔紙包裹，貯存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例2膽綠素處理PRRSV感染的Marc-145細(xì)胞

Marc-145細(xì)胞以1×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml的密度培養(yǎng)于含DMEM培養(yǎng)基(含青霉素100U/ml，鏈霉素50μg/ml，10％胎牛血清)的六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃，5％CO₂的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至70％～80％匯合度，棄去培養(yǎng)基。每孔接入0.1MOI的PRRSV，37℃孵育1h，棄去未吸附的病毒液，用1ml PBS/孔洗滌3次。每孔分別加入2ml含上述實(shí)施例1稀釋好的不同濃度(10μM、20μM、50μM、100μM、150μM)膽綠素的培養(yǎng)基，置于37℃，5％CO₂的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。病毒感染后48h，分別收集細(xì)胞上清和細(xì)胞。

實(shí)施例3qPCR檢測不同濃度膽綠素處理后PRRSV ORF7 mRNA表達(dá)

胰酶消化實(shí)施例2處理的細(xì)胞后，收集于1.5ml的離心管內(nèi)，4℃，500g，離心10min，棄去上清。每管加入1ml TRIzol(購自Invitrogen公司)，參照說明書抽提總RNA。用PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time試劑盒(購自TAKARA公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

最后應(yīng)用SYBR GREEN試劑盒(購自Roche公司)和上述反轉(zhuǎn)錄的cDNA模版及設(shè)計(jì)好的PRRSV ORF7基因的上下游引物，在Applied Biosystems的StepOnePlus Real-Time PCR System上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。

反應(yīng)條件為：95℃10min進(jìn)行變性；95℃15sec，60℃1min，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)；95℃15sec，60℃1min，95℃15sec進(jìn)行溶解曲線分析。

圖1結(jié)果表明，膽綠素以濃度梯度依賴性方式抑制PRRSV ORF7 mRNA表達(dá)。

實(shí)施例4Western blot檢測不同濃度膽綠素處理對PRRSV感染Marc-145細(xì)胞的影響。

胰酶消化實(shí)施例2處理的細(xì)胞后，收集于1.5ml的離心管內(nèi)，4℃，500g，離心10min，棄去上清。沉淀用200μl NP40裂解液冰上裂解30min；12000g離心10min，除去細(xì)胞碎片，取上清，5μl裂解樣品+45μl PBS，Pierce BCA protein Assay Kit測定總蛋白濃度，進(jìn)行western blot檢測。每個(gè)泳道40μg總蛋白，在Bio-Lab電泳儀上以150V電壓進(jìn)行SDS-PAGE；轉(zhuǎn)膜后，將膜小心取出，封閉液4℃封閉過夜；棄封閉液，用洗脫液洗膜，每次5min共洗4次；加入一抗：anti-N蛋白抗體，anti-α-tubulin抗體室溫孵育2h；棄一抗，用PBST洗膜，5min×4次；加入二抗：HRP-Goat@Mouse IgG，室溫孵育1h；棄二抗，用PBST洗膜，5min×4次；PBS洗膜，5min×4次；最后進(jìn)行ECL發(fā)光顯色。

如圖2的檢測結(jié)果表明，膽綠素呈現(xiàn)濃度梯度依賴性的抑制PRRSV N蛋白表達(dá)。

實(shí)施例5不同濃度膽綠素處理后Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)上清PRRSV TCID₅₀的測定

將實(shí)施例2中收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清，用無血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基作10倍系列稀釋10^-1至10^-8，接種在Marc-145細(xì)胞匯合度為70％～80％的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每稀釋度接種8孔，每孔0.1ml，37℃孵育1h后每孔再加入175μl含3％FBS的DMEM維持液，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-7d，每天觀察細(xì)胞病變(CPE)。

PRRSV感染細(xì)胞所致的CPE表現(xiàn)為細(xì)胞表面粗燥，折光性強(qiáng)，最后細(xì)胞脫落。按Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID₅₀。

檢測結(jié)果如圖3所示，膽綠素呈現(xiàn)濃度梯度依賴性的降低Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)上清中PRRSV的病毒滴度。

實(shí)施例6膽綠素處理PRRSV感染的PAM細(xì)胞

PAM以1×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml的密度培養(yǎng)于含RPMI-1640培養(yǎng)基(含青霉素100U/ml，硫酸鏈霉素50μg/ml 10％胎牛血清)的六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃孵育1h，吸棄病毒液，分別加入含有不同濃度膽綠素(20μM、50μM、100μM)的3％FBS的RPMI-1640維持液培養(yǎng)基于37℃，5％CO₂的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時(shí)用不含膽綠素的3％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基作為對照，24hpi收集細(xì)胞及上清。

實(shí)施例7Western blot檢測不同濃度膽綠素處理對PRRSV感染PAM細(xì)胞的影響

Western blot檢測樣品來自實(shí)施例6所收集的細(xì)胞樣品。

Western blot檢測方法同實(shí)施例4中所描述的方法。

Western blot檢測結(jié)果如圖4所示，與未經(jīng)膽綠素處理對照組相比，膽綠素以濃度依賴性方式抑制PRRSV N蛋白表達(dá)。

實(shí)施例8不同濃度膽綠素處理后PAM細(xì)胞培養(yǎng)上清PRRSV TCID₅₀的測定

TCID₅₀測定上清樣品來自實(shí)施例6所收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清。

TCID₅₀測定方法同實(shí)施例5中所描述的方法。

TCID₅₀測定結(jié)果如圖5所示，膽綠素濃度梯度依賴性降低PAM細(xì)胞培養(yǎng)上清中子代病毒滴度。

實(shí)施例9間接免疫熒光檢測不同濃度膽綠素處理對PAM細(xì)胞中PRRSV N蛋白表達(dá)的影響

(1)鋪板：將PAM細(xì)胞以1×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml的密度加到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔500μl，大約24h達(dá)到80％匯合度。

(2)接毒：PRRSV接毒量為0.1MOI，37℃孵育1h，棄掉病毒液，1×PBS洗3次，加入含不同濃度膽綠素的3％FBS+RPMI-1640維持液后繼續(xù)培養(yǎng)。

(3)固定：培養(yǎng)約24h等細(xì)胞稍出現(xiàn)CPE現(xiàn)象，將毒液棄掉，加入400μl/孔的75％乙醇(需事先放在-20℃預(yù)冷)，4℃固定30min。

(4)洗板：棄掉固定液，400μl/孔PBS洗5min/次×4次，在生物安全柜中將24孔板吹干。

(5)孵育一抗：每孔加入150μl用PBS稀釋好的抗PRRSV N蛋白的單抗6D10(1:300稀釋)，37℃孵育1h。

(6)洗板：400μl/孔PBS洗5min/次×4次。

(7)孵育二抗：每孔加入150μl用PBS稀釋好的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG熒光二抗(1:300稀釋)，37℃避光孵育1h。

(8)染細(xì)胞核：在熒光二抗孵育將要結(jié)束的最后5min，加入100μl/孔的4’,6’-diamidino-2-phenylindole(DAPI)，染色細(xì)胞核(DAPI用PBS按1:10000比例稀釋)。

(9)洗板：400μl/孔PBS洗5min/次×4次。

(10)觀察熒光：加入一定量PBS后直接鏡檢。

從圖6可以看出，隨著膽綠素濃度的增加，標(biāo)記了FITC的N蛋白表達(dá)(綠色熒光)在減少，且呈劑量依賴性。從而更加確認(rèn)膽綠素在PRRSV感染PAM細(xì)胞過程中可以發(fā)揮抗病毒作用。

以上對本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行了說明，但本發(fā)明并不以此為限，只要不脫離本發(fā)明的宗旨，本發(fā)明還可以有各種變化。