本發(fā)明屬于天然藥物化學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種以苦石蓮為原料得到的預(yù)防和治療慢性前列腺炎的含二萜的提取物及提取方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

(一)前列腺炎研究進(jìn)展

慢性前列腺炎(chronic prostatitis，CP)是男性泌尿外科最常見的一種疾病，據(jù)報(bào)道在我國的發(fā)病率為6.0％～32.9％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國外2.0％～16.0％的發(fā)病率。CP病因復(fù)雜、病程遷延、癥狀多變，嚴(yán)重影響患者的身心健康。美國國立衛(wèi)生研究院(National institute of health,NIH)將其列為影響居民生活質(zhì)量最為嚴(yán)重的慢性疾病之一。1995年，NIH將前列腺炎分為4種類型，分別為：I型：急性細(xì)菌性前列腺炎(acute bacterial prostatitis,ABP)；Ⅱ型：慢性細(xì)菌性前列腺炎(chronic bacterial prostatitis,CBP)；Ⅲ型：慢性非細(xì)菌性前列腺炎(chronic antibacterial prostatitis，CABP)/慢性骨盆疼痛綜合征(chronic pelvic pain syndrome，CPPS)；Ⅳ型，無癥狀炎癥性前列腺炎(asymptomatic inflammatory prostatitis,AIP)。其中Ⅲ型前列腺炎(CABP/CPPS)，即占CP總發(fā)病率的90％以上。

CABP/CPPS的病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其發(fā)生和發(fā)展是由多因素共同作用的結(jié)果。近年來認(rèn)為，CABP/CPPS與自身免疫因素密切相關(guān)。在機(jī)體的免疫過程中，各種炎性細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)共同作用的網(wǎng)絡(luò)和級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)了CABP/CPPS的發(fā)病與發(fā)展。研究表明在CABP/CPPS患者的前列腺組織、精漿和血清中，促炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α等)、抗炎性因子(IL-10等)以及COX-2、iNOS、PGE₂等炎癥介質(zhì)都發(fā)生明顯變化。炎癥因子和炎癥介質(zhì)水平的檢測可以作為CABP/CPPS診斷或治療的重要指標(biāo)。此外，微生物感染、氧化應(yīng)激、神經(jīng)生長因子、前列腺內(nèi)尿液返流、基因缺陷、鋅水平降低以及一些物理和化學(xué)等因素都有可能導(dǎo)致CABP/CPPS的發(fā)病。

環(huán)氧合酶(cyclooxygenase,COX)是一種限速酶，主要包括COX-1和COX-2兩種同工酶，可以調(diào)控花生四烯酸合成前列腺素和血栓素的速度。COX-1為人體內(nèi)的固有酶，維持前列腺素的基礎(chǔ)水平，在許多組織細(xì)胞的正常生理過程中發(fā)揮重要作用；而COX-2為誘生酶，在炎性應(yīng)答反應(yīng)中，受到炎癥細(xì)胞因子、生長因子和細(xì)胞內(nèi)毒素等誘導(dǎo)后迅速表達(dá)，在炎癥病灶的前列腺素E2(PGE₂)的上升中起著非常關(guān)鍵的作用。

近年的研究發(fā)現(xiàn)，COX-2在CABP/CPPS患者的前列腺組織和血清中高度表達(dá)。一些典型的COX-2抑制劑如尼美舒利(nimesulide，主要用來治療慢性關(guān)節(jié)炎疼痛和原發(fā)性痛經(jīng))和羅非昔布(rofecoxib,主要用來治療關(guān)節(jié)炎)等藥物在臨床上常被用來治療CABP/CPPS，但這些藥物對(duì)胃腸道和心血管方面有不可忽視的副作用，且它們對(duì)CABP/CPPS的治療作用仍處在研究階段^[22,23]。因此，尋找和開發(fā)安全有效的基于COX-2抑制作用的預(yù)防治療CABP/CPPS的藥物仍具有重要的臨床意義。

目前臨床上用于治療CABP/CPPS的主要為化學(xué)藥物，包括抗生素類藥物、α-還原酶抑制藥，α-受體阻斷藥，非甾體類抗炎藥，神經(jīng)調(diào)節(jié)類藥物、免疫抑制劑、維生素和一些微量元素等，但這些藥物都有一定的副作用，臨床作用效果也難以令人滿意。近年來的一些研究表明，一些植物制劑，如舍尼通(純裸麥花粉提取物)、諾伯特(沙巴棕果提取物)和前列康(花粉制劑)等藥物治療CABP/CPPS有明顯的效果，并能很好的緩解排尿困難等癥狀，提示在植物中尋找治療效果顯著、毒性低和不良反應(yīng)少的天然藥物應(yīng)用于該疾病的治療中，將有廣闊的發(fā)展前景。

(二)苦石蓮的研究概況

1、概述

苦石蓮(CaesalpiniaminaxHance)，又名石蓮子、廣石蓮子、貓兒核等，系豆科(Leguminosae)云實(shí)屬植物(Caesalpinia L.)啄莢云實(shí)種仁，分布較廣泛,主要生長于廣西、廣東、福建、貴州、云南、四川等地，在民間為治療肝炎和流感的常用藥。本品性苦寒，有止痛、散瘀、清熱、解毒、祛濕的功效，主治風(fēng)熱感冒、跌打損傷、痢疾、癤腫、淋濁等癥，并被四川、廣西、貴州等省區(qū)的中藥材標(biāo)準(zhǔn)收錄。

2、化學(xué)成分研究

對(duì)本屬植物的研究可以追溯到1930年，當(dāng)時(shí)Tummin KMC^[5]等人就對(duì)本屬植物的化學(xué)成分進(jìn)行研究，至今已有80多年的歷史。據(jù)國內(nèi)外的報(bào)道^[6]，云實(shí)屬植物中主要含有以下幾種類型化合物：呋喃二萜類、黃酮類、三萜類、倍半萜類以及其他類(甾醇、脂肪酸類等)化合物，其中二萜類化合物為其主要成分。

3、藥理作用研究

本屬植物在溫?zé)釒Х植驾^廣，在世界上許多地方和地區(qū)都具有廣泛的應(yīng)用。在我國西南廣東、廣西、貴州、云南和四川等地，本屬植物苦石蓮常被用來治療感冒發(fā)燒，痢疾，肺炎，腎炎，前列腺炎等癥?，F(xiàn)代藥理研究表明云實(shí)屬植物具有抗炎止痛，抗虐、抗微生物、抗癌、抗過敏、DNA修復(fù)以及植物生長調(diào)節(jié)等活性。呋喃二萜類化合物為其主要活性成分，目前有關(guān)該屬植物的活性報(bào)道主要集中在對(duì)二萜類化合物的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種預(yù)防和治療慢性前列腺炎的含二萜提取物的提取方法。該提取方法以苦石蓮為原料。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種苦石蓮含二萜提取物的提取方法，包含以下步驟：

所述的苦石蓮含二萜提取物的制備方法，優(yōu)選包含如下步驟：將苦石蓮粉碎過篩，用醇溶液提取，過濾，得到醇總提取液，濃縮，得到苦石蓮含二萜提取物；所述得苦石蓮含二萜提取物至少含有化合物1-6。

所述的醇溶液優(yōu)選為乙醇溶液或甲醇溶液。

所述的乙醇溶液優(yōu)選的濃度為體積百分比為50％～100％。

所述的甲醇溶液優(yōu)選的濃度為體積百分比為50％～100％。

所述的提取的方式為超聲、滲漉或加熱回流中的一種。

所述加熱回流的條件優(yōu)選為在70～80℃進(jìn)行。

所述的提取優(yōu)選至少提取3次，每次提取1～2h。

所述的苦石蓮含二萜提取物的制備方法中濃縮步驟：將醇總提取液依次用環(huán)己烷、乙酸乙酯萃取，將乙酸乙酯提取液濃縮。

本發(fā)明還提供一種上述方法獲得的苦石蓮含二萜提取物，所述得苦石蓮含二萜提取物至少含有化合物1-6。

本發(fā)明還提供一種所述的苦石蓮含二萜提取物在預(yù)防和治療慢性前列腺炎藥物中的應(yīng)用；所述苦石蓮二萜提取物具有抑制大鼠慢性非細(xì)菌性前列腺炎的活性。

本發(fā)明還提供一種苦石蓮含二萜提取物的提取方法，具體為將苦石蓮原藥材干燥、粉碎、過100目篩，用體積百分比為95％的乙醇于室溫下進(jìn)行滲漉提取3次，每次2小時(shí)，過濾，得到總提取液：將總提取液減壓蒸餾至干燥得到總提物，將此總提物混懸于去離子水中，依次用環(huán)己烷、乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯提取液，然后將乙酸乙酯提取液減壓濃縮至恒重，得到漿狀物，即乙酸乙酯提取物。

所述的苦石蓮含二萜提取物具有抑制大鼠慢性非細(xì)菌性前列腺炎的活性，可用于制備預(yù)防和治療慢性前列腺的藥物。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果：

(1)苦石蓮(CaesalpiniaminaxHance)，主要生長于廣西、廣東、福建、貴州、云南、四川等地，分布較廣泛，易于得到；

(2)發(fā)明人發(fā)現(xiàn)苦石蓮提取物具有較好的抗炎作用，特別是含二萜的乙酸乙酯提取部位具有強(qiáng)大的抗慢性非細(xì)菌性前列腺炎的作用。本發(fā)明所述的苦石蓮含二萜提取物制備方法簡單，成本較低；

(3)將苦石蓮含二萜提取物應(yīng)用于制備預(yù)防和治療慢性前列腺炎藥物，高效低毒，符合藥物發(fā)展的要求。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1得到的苦石蓮含二萜提取物的HPLC色譜圖。

圖2是化合物1-6的結(jié)構(gòu)圖。

圖3是乙酸乙酯提取物(含二萜提取物)抑制大鼠慢性非細(xì)菌性前列腺炎大鼠模型前列腺組織中COX-2表達(dá)的示意圖，其中

a為空白組大鼠前列腺組織中COX-2表達(dá)的示意圖；

b為模型組大鼠前列腺組織中COX-2表達(dá)的示意圖；

c為前列康組大鼠前列腺組織中COX-2表達(dá)的示意圖；

d為高劑量給藥組大鼠前列腺組織中COX-2表達(dá)的示意圖；

e為高劑量給藥組大鼠前列腺組織中COX-2表達(dá)的示意圖；

f為低劑量給藥組大鼠前列腺組織中COX-2表達(dá)的示意圖。

圖4是對(duì)比實(shí)施例1得到的苦石蓮甲醇總提取物和乙醇總提取物的HPLC譜圖。其中：

A為苦石蓮乙醇總提取物的HPLC譜圖；

B為苦石蓮甲醇總提取物的HPLC譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1

(1)苦石蓮含二萜提取物的制備

將苦石蓮原藥材(5kg，市售)干燥，粉碎，過100目篩，用體積百分比為95％的乙醇于室溫下進(jìn)行滲漉提取3次，每次2小時(shí)，過濾，得到總提取液：將總提取液減壓蒸餾至干燥得到總提物(664g)，將此總提物混懸于去離子水中，依次用環(huán)己烷、乙酸乙酯萃取，最終得到乙酸乙酯提取液。然后將乙酸乙酯提取液減壓濃縮至恒重，得到漿狀物，即乙酸乙酯提取物(含二萜提取物，67.5g)。先用環(huán)己烷進(jìn)行萃取的目的是減少總提取物中的小極性雜質(zhì)。

(2)對(duì)步驟(1)得到的含二萜提取物進(jìn)行分析

將步驟(1)得到的含二萜提取物溶于甲醇，配成20mg/ml的溶液，用HPLC進(jìn)行色譜分析，分析條件是：C18反相半制備柱(5μm,9.4×250mm)，紫外檢測波長為235nm，流速為1ml/min，梯度系統(tǒng)為：A:水，B:乙腈；0～10min：10％(v/v)的乙腈溶液；10～50min：10％(v/v)→100％(v/v)的乙腈溶液；50～55min：100％(v/v)的乙腈溶液；55～60min:100％(v/v)→10％(v/v)的乙腈溶液，得到乙酸乙酯部位的指紋圖譜(見圖1)。用波譜分析法對(duì)苦石蓮總二萜的主要成分進(jìn)行分析和鑒定，確定其二萜主要為：caesalmin I(化合物1)，caesalmin O(化合物2)，caesalmin P(化合物3)，caesalmin B(化合物4)，caesalpinin B(化合物5)，norcaesalpinin MC(化合物6)?；衔?～6的結(jié)構(gòu)如式1～6所示，波譜數(shù)據(jù)如下：

化合物1：無色晶體，[α]_30D+23.5°(c 0.1,CHCl₃)；濃硫酸-香草醛反應(yīng)顯紅色；IR(KBr)ν_max:3567,1739cm^-1；ESI-MS:m/z 457.5[M+Na]⁺；891.3[2M+Na]⁺，HR-ESI-MS:m/z 435.2017[M+H]⁺(calcd for C₂₃H₃₁O₈:435.2013)。

化合物2：白色粉末，[α]_30D+57.3°(c 0.1,CHCl₃)；濃硫酸-香草醛反應(yīng)顯紅色；IR(KBr)ν_max:3575,1733cm^-1；ESI-MS:m/z 441.4[M+Na]⁺,859.3[2M+Na]⁺；HR-ESI-MS:m/z 419.2073[M+H]⁺(calcd for C₂₃H₃₁O₇:419.2064。

化合物3：無定形粉末，[α]_30D+17.8°(c 0.05,CHCl₃)；濃硫酸-香草醛反應(yīng)顯紅色；IR(KBr)ν_max:3575,1725cm^-1；ESI-MS:m/z 473.5[M+Na]⁺,923.5[2M+Na]⁺；HR-ESI-MS:m/z 473.2152[M+Na]⁺(calcd for C₂₄H₃₄O₈Na:473.2146)。

化合物4：白色粉末，[α]_30D+18.7°(c 0.1,CHCl₃)；濃硫酸-香草醛反應(yīng)顯紅色；IR(KBr)ν_max:3597,1719cm^-1；ESI-MS:m/z 389.1[M+H]⁺,411.3[M+Na]⁺,799.2[2M+Na]⁺。

化合物5：白色粉末，[α]_30D+31.7°(c 0.05,CHCl₃)；濃硫酸-香草醛反應(yīng)顯紅色；IR(KBr)ν_max:3492,1735cm^-1；ESI-MS:m/z 447.2[M+H]⁺,469.3[M+Na]⁺,915.2[2M+Na]⁺。

化合物6：白色粉末，[α]_30D+28.7°(c 0.1,CHCl₃)；濃硫酸-香草醛反應(yīng)顯紅色；IR(KBr)ν_max:3600,1740cm^-1；ESI-MS:m/z 477.2[M+H]⁺,499.3[M+Na]⁺,975.1[2M+Na]⁺。

化合物1-6的結(jié)構(gòu)圖如圖2。

(3)對(duì)步驟(1)得到的含二萜提取物對(duì)大鼠慢性非細(xì)菌性前列腺炎的影響

建立大鼠CABP/CPPS模型：取170-210g雄性SD大鼠，隨機(jī)分組，10只為假手術(shù)組，其余為模型組。以2.5％戊巴比妥鈉腹腔注射(0.3ml/100g)麻醉后，無菌條件下做去勢手術(shù)，縫合皮膚，消毒包扎，自由飲食。模型組第二天于背部皮膚下注射苯甲酸雌二醇(0.25g/kg)，連續(xù)30天，假手術(shù)組大鼠皮下注射蒸餾水0.125mg/kg，連續(xù)30天。

分組和給藥方法：將模型組大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為給藥組(高、中、低劑量)、陽性對(duì)照組、空白對(duì)照組。給藥組分別按照高、中、低劑量(0.8g/kg，0.4g/kg、0.1g/kg)給予不同濃度的含二萜提取物；陽性對(duì)照組給予前列康溶液0.2g/kg；假手術(shù)組和空白組給予等量PBS。灌胃每天1次，連續(xù)30天。

動(dòng)物取材：末次給藥結(jié)束2h后，摘眼球取血，4℃低溫3000r/min離心20min后取血清，分裝于EP管中，-20℃保存。取血后立即脫臼處死大鼠，無菌條件下解剖，切開腹部，剪開趾骨聯(lián)合，取出前列腺組織，將其分為左右兩部分，稱重。將左側(cè)前列腺組織在冰水浴上用玻璃勻漿器使之勻漿，3000r/min離心20min后，取出上清液，分裝于EP管中，-20℃保存，沉淀細(xì)胞用于流式檢測COX-2的表達(dá)。

檢測方法：取組織研磨后的細(xì)胞沉淀，制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)PBS洗2次，加入抗鼠Cox-2的一抗，4℃孵育40min，PBS洗滌二次，沉淀加FITC標(biāo)記二抗20μl混勻，4℃暗盒孵育60min，PBS洗滌一次，沉淀加PBS 400μL混勻后上樣。流式細(xì)胞儀檢測熒光標(biāo)記細(xì)胞的熒光。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：如圖3所示，高、中、低劑量的苦石蓮乙酸乙酯部位(含二萜提取物)對(duì)CABP/CPPS前列腺組織中COX-2的表達(dá)均有明顯的抑制作用，并且其抑制作用具有劑量依賴性。

對(duì)比實(shí)施例1

苦石蓮乙醇提取物和甲醇提取物的比較

(1)樣品制備

取2份苦石蓮原藥材各5g，粉碎，過100目篩，分別用10ml甲醇和乙醇超聲提取1小時(shí)，提取液用0.22μm微孔濾膜過濾，濾液取20μL注入HPLC進(jìn)行分析。

(2)分析條件

采用HP1100儀器系統(tǒng)，反相色譜柱(150×4.6mm，3μm；Al ltech，USA)，流動(dòng)相：水(A)和乙腈(B)。梯度洗脫系統(tǒng)：0～20min：10％→30％B；20～50min：30％→100％B；50～55min：100％B；55～60min:100％→10％B。流速：1ml/min，檢測波長：254nm。

(3)分析結(jié)果

結(jié)果如圖4所示，苦石蓮甲醇提取物和乙醇提取物的主要色譜峰保留時(shí)間基本一致，說明它們的化學(xué)成分非常接近。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。