本發(fā)明涉及一種藍(lán)莓葉提取物及其提取方法，該藍(lán)莓葉提取物具有抗氧化活性劑、抑制絡(luò)氨酸酶的活性。

背景技術(shù)：

藍(lán)莓(Blueberry)，屬杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium.spp)多年生落葉或常綠灌木。除果實(shí)風(fēng)味獨(dú)特營養(yǎng)豐富外，藍(lán)莓葉也可入藥。藍(lán)莓葉性溫、味苦，有利尿、解毒之功效，研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓葉中存在大量黃酮類物質(zhì)。黃酮類化合物分子中含有多電子的羥基部分，使其具有良好的抗氧化性能。最近日本研究人員又報道藍(lán)莓葉中存在一種黃酮類物質(zhì)即原花青素，是一種高活性、無毒副作用天然物質(zhì)，具有較強(qiáng)清除自由基、抗氧化能力。

擁有白皙亮麗的皮膚，是現(xiàn)今社會大多數(shù)人對的追求。人們希望通過物理或化學(xué)方法達(dá)到美白的效果，但隨著美白化妝品中曲酸的泛濫使用出現(xiàn)的一系列問題，美白產(chǎn)品的安全性引起了廣大研究者的重視。而從天然植物中提取美白劑成為尋求新型美白劑的重要方向之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在從藍(lán)莓葉中提取抗氧化物質(zhì)，就可更好地實(shí)現(xiàn)藍(lán)莓葉的存在價值。本發(fā)明公開了一種提取藍(lán)莓葉中的抗氧化物質(zhì)的提取工藝，尋求新型、高效低毒的天然抗氧化劑的制備方法，提高藍(lán)莓種植的經(jīng)濟(jì)效益。

酪氨酸酶廣泛存在于生物體內(nèi)，具有許多重要的生理功能。在人體中，酪氨酸酶是黑色素生物合成途徑中的主要限速酶。因此，本發(fā)明的另一目的在于提供一種藍(lán)莓葉中具有抑制酪氨酸酶的活性成分的物質(zhì)，對于藍(lán)莓葉的深度開發(fā)利用具有重要意義。具體如下：

一種藍(lán)莓葉提取物，該提取物包括如下5種主要化合物，具體為3,3’,4’,6,7-五羥基黃酮-5-O-木糖、5-羥基-4’-甲氧基黃酮-3,7-二鼠李糖、3,3’,4’-三羥基黃酮-7-O-鼠李糖(1-6)-O-葡萄糖、3,3’,4’,6,7-五羥基黃酮-5-O-鼠李糖(1-6)-O-木糖、4’,5-二羥基-2’,7-二甲氧基-8-異戊烯基黃酮。

一種藍(lán)莓葉提取物，該提取物在上述主要化合物的基礎(chǔ)上還包括如下10種主要化合物，具體為綠原酸、3,3’,4’,6,7-五羥基黃酮-5-O-木糖、5-羥基-4’-甲氧基黃酮-3,7-二鼠李糖、蘆丁、異槲皮素、3,3’,4’-三羥基黃酮-7-O-鼠李糖(1-6)-O-葡萄糖、3,3’,4’,6,7-五羥基黃酮-5-O-鼠李糖(1-6)-O-木糖、槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、4’,5-二羥基-2’,7-二甲氧基-8-異戊烯基黃酮。

所述的藍(lán)莓葉提取物為0.2％醋酸-乙醇提取物，0.2％醋酸-乙醇提取物的提取方法如下：

(1)取藍(lán)莓鮮葉于鼓風(fēng)干燥箱50℃烘干至恒重，粉碎得藍(lán)莓葉備用；

(2)取粉碎的藍(lán)莓葉于錐形瓶中，按料液比1:10加入為0.2％醋酸-乙醇的混合溶液，50℃水浴加熱提取1h，重復(fù)2次，過濾，合并濾液并濃縮干燥得到為0.2％醋酸-乙醇提取物；

(3)將0.2％醋酸-乙醇提取物用DMSO配制成0.1g·mL^-1供試液，即為0.2％醋酸-乙醇提取物。

0.2％醋酸-乙醇的混合溶液是指100mL乙醇溶液中含有0.2mL的醋酸溶液的混合溶液。

所述的藍(lán)莓葉提取物為95％的乙醇提取物，體積濃度為95％的乙醇提取物的提取方法如下：

(1)取藍(lán)莓鮮葉于鼓風(fēng)干燥箱50℃烘干至恒重，粉碎得藍(lán)莓葉備用；

(2)取藍(lán)莓葉于錐形瓶中，按料液比1：10加入體積濃度為95％乙醇；500W超聲提取0.5h，重復(fù)2次，過濾，合并濾液并濃縮干燥得到體積濃度為95％的乙醇提取物；

(3)將體積濃度為95％的乙醇提取物用DMSO配制成0.1g·mL^-1供試液，即為95％乙醇提取物。

所述的藍(lán)莓葉提取物還可以為水提取物，水提取物的提取方法如下：

(1)取藍(lán)莓鮮葉于鼓風(fēng)干燥箱50℃烘干至恒重，粉碎得藍(lán)莓葉備用；

(2)取藍(lán)莓葉于錐形瓶中，按料液比1：10加入水，500W超聲提取0.5h，重復(fù)2次，過濾，合并濾液并濃縮干燥得到水提取物；

(3)將水提取物用DMSO配制成0.1g·mL^-1供試液，即為水提取物。

本發(fā)明將藍(lán)莓葉的95％乙醇提取物、藍(lán)莓葉的水提取物、藍(lán)莓葉的0.2％醋酸-乙醇提取物在制備抗氧化活性的藥物上的應(yīng)用。

本發(fā)明進(jìn)一步將藍(lán)莓葉的95％乙醇提取物、藍(lán)莓葉的水提取物、藍(lán)莓葉的0.2％醋酸-乙醇提取物在制備抑制絡(luò)氨酸酶活性的藥物上的應(yīng)用。

本發(fā)明提取工藝簡單，在藍(lán)莓葉的95％乙醇提取物、藍(lán)莓葉的水提取物、藍(lán)莓葉的0.2％醋酸-乙醇提取物中首次發(fā)現(xiàn)了化合物3,3’,4’,6,7-五羥基黃酮-5-O-木糖、5-羥基-4’-甲氧基黃酮-3,7-二鼠李糖、3,3’,4’-三羥基黃酮-7-O-鼠李糖(1-6)-O-葡萄糖、3,3’,4’,6,7-五羥基黃酮-5-O-鼠李糖(1-6)-O-木糖、4’,5-二羥基-2’,7-二甲氧基-8-異戊烯基黃酮，藍(lán)莓葉提取的化合物中對L929細(xì)胞均沒有毒性，對DPPH具有顯著的清楚作用，且能顯著抑制絡(luò)氨酸酶活性。

附圖說明

圖1為不同藍(lán)莓樣品對L929細(xì)胞的細(xì)胞毒性檢測，其中，1為藍(lán)莓葉的0.2％醋酸-乙醇提取物，2為藍(lán)莓葉的95％乙醇提取物，3為藍(lán)莓葉的水提取物。

圖2為不同藍(lán)莓樣品對DPPH自由基清除能力，其中，1為藍(lán)莓葉的0.2％醋酸-乙醇提取物，2為藍(lán)莓葉的95％乙醇提取物，3為藍(lán)莓葉的水提取物。

圖3為不同藍(lán)莓樣品的抑制絡(luò)氨酸酶活性，其中，1為藍(lán)莓葉的0.2％醋酸-乙醇提取物，2為藍(lán)莓葉的95％乙醇提取物，3為藍(lán)莓葉的水提取物。

圖4為藍(lán)莓葉的0.2％醋酸-乙醇提取物的液相色譜圖。

圖5為藍(lán)莓葉的0.2％醋酸-乙醇提取物的質(zhì)譜圖。

圖6為藍(lán)莓葉的95％乙醇提取物的液相色譜圖。

圖7為藍(lán)莓葉的水提取物的液相色譜圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1、樣品的制備

藍(lán)莓鮮葉1.3Kg于鼓風(fēng)干燥箱50℃烘干至恒重，粉碎得580g藍(lán)莓葉備用。2、提取

0.2％醋酸-乙醇提取物的提?。?/p>

取粉碎的藍(lán)莓葉1g于錐形瓶中，按料液比1:10加入體積濃度為0.2％醋酸-乙醇，50℃水浴加熱提取1h，重復(fù)2次，過濾，合并濾液并濃縮干燥得到體積濃度為0.2％醋酸-乙醇提取物；

將體積濃度為0.2％醋酸-乙醇提取物用DMSO配制成0.1g·mL^-1供試液，

即為0.2％醋酸-乙醇提取物(樣品1)。

95％乙醇提取物：

取藍(lán)莓葉1g于錐形瓶中，按料液比1：10加入體積濃度為95％乙醇；500W超聲提取0.5h，重復(fù)2次，過濾，合并濾液并濃縮干燥得到體積濃度為95％的乙醇提取物；

將體積濃度為95％的乙醇提取物用DMSO配制成0.1g·mL^-1供試液，即為95％乙醇提取物(樣品2)。

水提取物：

取藍(lán)莓葉1g于錐形瓶中，按料液比1：10加入水，500W超聲提取0.5h，重復(fù)2次，過濾，合并濾液并濃縮干燥得到水提取物；

將水提取物用DMSO配制成0.1g·mL^-1供試液，即為水提取物(樣品3)。

本實(shí)驗(yàn)考察了不同的提取溶劑(0.2％醋酸-乙醇、95％乙醇、水)和不同的提取方法(加熱回流提取和超聲提取)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取溶劑和提取方法對藍(lán)莓葉的提取率影響不大，3個樣品的提取率分別為19.3％、19.9％和26.1％。

針對上述活性的應(yīng)用，本申請進(jìn)行了細(xì)胞毒活性、抗氧化活性、抑制絡(luò)氨酸酶活性實(shí)驗(yàn)，具體如下：

細(xì)胞毒活性

細(xì)胞毒活性

取對數(shù)生長期的成纖維L929細(xì)胞，以2×10³個/ml細(xì)胞濃度接種于96孔板中，每孔100μl，培養(yǎng)24h后加分別加藍(lán)莓提取物100μl，根據(jù)預(yù)試結(jié)果共設(shè)10、1、0.1mg·ml^-13個濃度，每個濃度均設(shè)3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)72h。用翻板法棄上清液，每孔加0.5mg·ml^-1的MTT溶液100μl，培養(yǎng)4h后每孔加DMSO 100μl，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀測其在492nm下的吸光度。

細(xì)胞生長抑制率(％)＝[1-(實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD均值)/(對照組OD均值-空白組OD均值)]×100％。

上述中分別檢測了24小時、48小時和72小時藍(lán)莓樣品1、2、3對L929細(xì)胞的毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在本實(shí)驗(yàn)的藥物濃度下藍(lán)莓樣品對L929細(xì)胞均沒有毒性(結(jié)果見圖1)。

抗氧化活性

用無水乙醇定容VC，配成1.58mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并用乙醇稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。取100μL待測液(0.01mg·ml^-1)/標(biāo)準(zhǔn)溶液，加2mL 0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液，充分混合，室溫避光靜置20min，于517nm處測其吸光度(A_{實(shí)驗(yàn)})。對照組用60μL的無水乙醇代替DPPH溶液(A_對照)，空白組用60μL無水乙醇代替樣品(A_空白)，各組平行測定3次，按下式計算清除率。

DPPH·清除率/％＝[1－(A_{實(shí)驗(yàn)}－A_對照)/A_空白]×100％

對藍(lán)莓樣品清除DPPH自由基的能力進(jìn)行研究，結(jié)果表明，藍(lán)莓葉對DPPH自由基具有顯著的清除作用(結(jié)構(gòu)見圖2)。

抑制酪氨酸酶活性

將底物L(fēng)-DOPA溶解在磷酸緩沖液(25mM，pH 6.8)中達(dá)到0.1mg·mL^-1濃度。向96孔板中分別加入40μL上述底物溶液，80μL磷酸緩沖液(25mM，pH 6.8)。樣品孔加入40μL待測樣品，空白孔加入40μL的磷酸緩沖溶液(pH 6.8)，陽性對照孔中加入40μL曲酸溶液?；靹?，加入40μL酪氨酸酶的磷酸緩沖溶液(500U·mL^-1，25mM，pH 6.8)。在25℃下溫孵10min，然后在490nm下測定每孔的吸光度。根據(jù)在490nm下的吸光度計算化合物對酪氨酸酶的抑制率(％)：

抑制率(％)＝[(A_testsample-A_blank)/A_control)×100]％

上式中，A_control表示模型組(底物中加入了酪氨酸酶，而沒有加待測樣品)在490nm下的吸光度；A_blank表示空白組(底物中加入了待測樣品，而沒有加酪氨酸酶)在490nm下的吸光度；A_testsample表示樣品組(底物中加入了待測樣品和酪氨酸酶)在490nm下的吸光度。

上述3種藍(lán)莓葉提取物均能顯著抑制酪氨酸酶活性，分別為56.61％、73.31％和75.82％，結(jié)果見圖3。

LC及LC-MS分析藍(lán)莓提取物主要化學(xué)成分分析

將以上活性比較好的三個樣品利用高效液相色譜(LC)分析其化學(xué)成分分析，其液相色譜條件為：色譜柱Waters BEH C18(4.6mm×250mm，2μm)；檢測器PDA。流動相乙腈(A)－水(B)，線性梯度洗脫:0min～5min，5％～5％A；5min～10min，5％～20％A；10min～20min，20％～60％A。流速0.6mL/min；柱溫40℃；檢測波長375nm；進(jìn)樣量5μL。結(jié)果發(fā)現(xiàn)三個樣品的主要化學(xué)成分一樣。

為了進(jìn)一步鑒定這些化學(xué)成分，利用液質(zhì)聯(lián)用色譜LC-MS對樣品1進(jìn)行化學(xué)成分鑒定。液相色譜條件同上，采用電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子MRM模式測定，離子源噴霧電壓4.5kV，干燥氣溫度350℃，碰撞氣壓力60kPa，霧化氣壓力40kPa。

通過質(zhì)譜給出的分子量，液相色譜提供的紫外吸收特征，對本實(shí)驗(yàn)中藍(lán)莓葉的0.2％醋酸-乙醇提取物的主要10個化學(xué)成分進(jìn)行了初步指認(rèn)，均為黃酮及其苷類。各峰的分子量依次為：354，478，592，610，464，594，624，434，448，382道爾頓，分別為綠原酸(1)、3,3’,4’,6,7-五羥基黃酮-5-O-木糖(2)、5-羥基-4’-甲氧基黃酮-3,7-二鼠李糖(3)、蘆丁(4)、異槲皮素(5)、3,3’,4’-三羥基黃酮-7-O-鼠李糖(1-6)-O-葡萄糖(6)、3,3’,4’,6,7-五羥基黃酮-5-O-鼠李糖(1-6)-O-木糖(7)、槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷(8)、槲皮素-3-O-鼠李糖苷(9)、4’,5-二羥基-2’,7-二甲氧基-8-異戊烯基黃酮(10)。其中化合物2，3，6，7，10均為首次在藍(lán)莓中發(fā)現(xiàn)。