本發(fā)明涉及醫(yī)藥，特別是一種杜仲葉總黃酮在制備治療圍絕經(jīng)期綜合征藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
杜仲葉不僅與杜仲皮有相同的有效成分和藥理作用，而且來源更豐富，成本更低。具有較好的開發(fā)利用前景，微辛，溫。歸肝、腎經(jīng)，補肝腎；強筋骨；降血壓，用于肝腎不足，頭暈?zāi)垦＃ニ嵬?，筋骨痿軟，腰背疼痛；足膝酸軟乏力；高血壓病?/p>
圍絕經(jīng)期綜合征是指婦女絕經(jīng)前后的一段時期(從45歲左右開始至停經(jīng)后12個月內(nèi)的時期)，包括從接近絕經(jīng)出現(xiàn)與絕經(jīng)有關(guān)的內(nèi)分泌、生物學(xué)和臨床特征起至最后1次月經(jīng)后1年，也就是卵巢功能衰退的征兆，一直持續(xù)到最后1次月經(jīng)后1年，是正常的生理變化時期。但在圍絕經(jīng)期易發(fā)生不適，臨床表現(xiàn)為月經(jīng)改變，面部潮紅、陣陣發(fā)熱、出汗等血管舒張癥狀。情緒不穩(wěn)定、激動易怒、抑郁多煩、記憶力減退、工作能力下降等，皮膚皺紋逐漸增多，有的出現(xiàn)瘙癢、毛發(fā)開始變白脫落。腹部和臀部脂肪增多，容易發(fā)胖，血壓易波動，常出現(xiàn)高血壓、心前區(qū)悶痛不適、心悸、氣短，動脈硬化發(fā)生率增加，冠心病發(fā)病率也上升，骨質(zhì)疏松，上述癥狀被稱為圍絕經(jīng)期綜合征。
現(xiàn)雖有治療圍絕經(jīng)期綜合征的多種藥物，但至今未見有從杜仲葉中提取的杜仲葉總黃酮在制備治療圍絕經(jīng)期綜合征藥物中的應(yīng)用。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種杜仲葉總黃酮在制備治療圍絕經(jīng)期綜合征藥物中的應(yīng)用，可有效解決杜仲葉總黃酮作為唯一活性成分在制備圍絕經(jīng)期綜合征藥物中的應(yīng)用問題。
本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，杜仲葉總黃酮作為唯一活性部位(成分)在制備治療圍絕經(jīng)期綜合征藥物中的應(yīng)用，該杜仲葉總黃酮是將杜仲葉粉碎成粗粉，先用石油醚回流提取，脫脂，杜仲葉藥渣揮干石油醚，加乙醇浸泡，回流提取，過濾，減壓回收乙醇至無醇味，加蒸餾水分散，得藥液；藥液上AB-8型大孔吸附樹脂，先用蒸餾水洗脫，棄去水洗脫液；再用質(zhì)量濃度10％乙醇洗脫，棄去洗脫液；再用質(zhì)量濃度80％乙醇洗脫，收集80％乙醇洗脫液，減壓回收乙醇至無醇味，冷凍干燥，粉碎，得杜仲葉總黃酮。
本發(fā)明制備的杜仲葉總黃酮作為唯一活性成分在制備治療圍絕經(jīng)期綜合征藥物中的應(yīng)用，原料豐富，制備方法簡單，易操作，生產(chǎn)效率高，有效用于制備治療圍絕經(jīng)期綜合征的藥物，開拓了杜仲葉的新用途，是中藥上的創(chuàng)新，有顯著的經(jīng)濟和社會效益。
具體實施方式
以下結(jié)合具體情況對本發(fā)明的具體實施方式作詳細(xì)說明。
本發(fā)明在具體實施中，杜仲葉總黃酮作為唯一活性部位(成分)在制備治療圍絕經(jīng)期綜合征藥物中的應(yīng)用，該杜仲葉總黃酮是將杜仲葉粉碎成過20-30目篩的粗粉，先加粗粉10倍重量的石油醚回流提取1h，脫脂，杜仲葉藥渣揮干石油醚，加粗粉10倍重量、質(zhì)量濃度80％乙醇浸泡0.5h，回流提取1h，過濾，得第一次濾液；藥渣再加粗粉10倍重量、質(zhì)量濃度80％乙醇回流提取1h，過濾，得第二次濾液，合并兩次濾液，減壓回收乙醇至無醇味，加蒸餾水分散至相當(dāng)于含生藥量0.3g/ml，得藥液；藥液上AB-8型大孔吸附樹脂，先用2倍柱體積蒸餾水洗脫，棄去水洗脫液；再用4倍柱體積的質(zhì)量濃度10％乙醇洗脫，棄去洗脫液；再用6倍柱體積的質(zhì)量濃度80％乙醇洗脫，收集80％乙醇洗脫液，減壓回收乙醇至無醇味，冷凍干燥，粉碎，得杜仲葉總黃酮。
本發(fā)明經(jīng)試驗，杜仲葉總黃酮作為唯一活性成分，可有效用于制備治療圍絕經(jīng)期綜合征的藥物，有關(guān)試驗資料如下：
1實驗材料
1.1實驗動物
KM小鼠，SPF級；性別：雌性；體重：23-25g，提供單位：山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司；動物合格證號：37005400000020；實驗倫理編號：DWLL16020050；河南中醫(yī)學(xué)院動物實驗中心許可證號：SYXK(豫)2015-0005。
1.2實驗藥物
本發(fā)明杜仲葉總黃酮，含量>55％。更年安膠囊(地黃、熟地黃、澤瀉、麥冬、玄參、牡丹皮、茯苓、珍珠母、仙茅、五味子、磁石、首烏藤、鉤藤、浮小麥、制何首烏。輔料為空心膠囊。性狀：本品為膠囊劑，內(nèi)容物為黑褐色的顆粒；氣微香，味微甜而后苦。功能主治：滋陰潛陽，除煩安神。用于更年期潮熱汗出，眩暈耳鳴，煩躁失眠。規(guī)格：每粒裝0.3g；用法用量：口服，一次3粒，一日3次,山西黃河中藥有限公司生產(chǎn)。
1.3實驗試劑
水合氯醛，天津市科密歐化學(xué)制劑開發(fā)中心；羧甲基纖維素鈉，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；注射用青霉素鈉，華北制藥股份有限公司；0.9％氯化鈉注射液，河南科倫藥業(yè)有限分司；甲醛溶液(分析純)，煙臺市雙雙化工有限公司；酒精：新鄉(xiāng)市三偉消毒制劑有限公司；小鼠E2ELISA檢測試劑盒，R&D公司；小鼠T ELISA檢測試劑盒，R&D公司；小鼠LH ELISA檢測試劑盒，R&D公司；小鼠FSH ELISA檢測試劑盒，R&D公司；小鼠IL-2ELISA 檢測試劑盒，R&D公司。
1.4實驗儀器
電子稱，上海民橋醫(yī)療器械有限公司，型號JY601；電子分析天平，奧豪斯(上海)公司，型號AR1140/C；高速臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠，型號TGL-168；電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司，型號HWS12；高速冷凍離心機，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司，型號KDC-160HR；可調(diào)式移液器，上海雷勃分析儀器有限公司；小鼠自主活動測試儀，成都泰盟科技有限公司，型號ZZ-6；小鼠避暗儀，成都泰盟科技有限公司，型號：BA-200；酶標(biāo)儀，美國BIO-RAD公司，型號680；電動顯微鏡，日本OLYMPUS公司，型號BX61。
2實驗方法
2.1造模與給藥
造模方法：取體重23～25g雌性昆明小鼠84只，隨機選出10只作為空白，做假手術(shù)處理，其余小鼠造圍絕經(jīng)期模型。小鼠稱重后腹腔注射10％水合氯醛(0.03ml/10g)麻醉后腹位固定，然后從小鼠背部最末肋骨下，在腋中線和距脊柱外側(cè)約1cm交叉處剪毛，消毒后切開皮膚和背肌約0.5～1cm，切口視野中可見一乳白色發(fā)亮的脂肪團，卵巢即包埋其中。用小鑷子輕輕夾住脂肪團拉出切口外，分離脂肪團，即可見到一團細(xì)線狀不規(guī)則呈黃紅色的卵巢。剪取時先將卵巢下輸卵管(包括脂肪)用細(xì)線結(jié)扎，再摘除卵巢，術(shù)后順勢將子宮角放回腹腔中，縫合肌肉及皮膚，同法摘除雙側(cè)卵巢。術(shù)后精心飼養(yǎng)，肌肉注射青霉素25萬u/kg(每只0.02mL)以防感染，連續(xù)3d，每天1次。手術(shù)5d后開始逐只進行小鼠陰道涂片檢查，每天1次，連續(xù)5d，以確定卵巢是否完全切除。涂片呈現(xiàn)動情反應(yīng)的小鼠棄去不用，選擇60只去勢完全的小鼠隨機均勻分為6組供實驗用，分別為模型組，更年安膠囊組，大豆異黃酮軟膠囊組，大、中、小劑量杜仲葉總黃酮組。
配藥：0.5％CMC配制方法：稱取羧甲基纖維素鈉4g，用蒸餾水配成800ml。
大、中、小劑量杜仲葉總黃酮組給藥劑量分別為400mg·kg-1、200mg·kg-1、100mg·kg-1(給藥體積0.1ml/10g)。
更年安膠囊(675mg·kg-1，濃度67.5mg·mL-1，相當(dāng)于臨床用量的15倍)；配置方法：取更年安膠囊9粒，先混懸于少量的0.5％CMC溶液，然后再定容到40ml，混勻，即為所需更年安膠囊混懸液。
大豆異黃酮維E軟膠囊(250mg·kg-1，濃度25mg·mL-1，相當(dāng)于臨床用量的15倍)；配置方法：取大豆異黃酮膠囊2粒，先混懸于少量的0.5％CMC溶液，然后再定容到40ml，混勻，即為所需大豆異黃酮混懸液。
儲存方法：冷藏，用時隔水溫?zé)?/p>
給藥方法：各組動物于手術(shù)后第10天給予相應(yīng)藥物。更年安膠囊組灌服更年安膠囊混懸液675mg·kg-1，大豆異黃酮軟膠囊組灌服大豆異黃酮軟膠囊混懸液250mg·kg-1，大、中、小劑量杜仲葉總黃酮組分別組別灌服大、中、小劑量杜仲葉總黃酮400mg·kg-1、200mg·kg-1、100mg·kg-1?？瞻捉M和模型組分別灌服同體積蒸餾水，每日灌胃給藥1次，連續(xù)給藥21d。
2.2觀察項目及檢測方法
各組小鼠于給藥18d時測定5min內(nèi)自主活動次數(shù)，于給藥19～20d時測定小鼠首次進入暗室的潛伏期及5min內(nèi)進入暗室遭電擊的次數(shù)。于末次給藥后2h(禁食不禁水12h)，小鼠稱重后摘眼球取血，分離血清，測定血清中E2、T、LH、FSH、IL-2的含量；然后脫頸椎處死小鼠，解剖小鼠，摘除胸腺、脾臟、子宮組織，稱量其濕重并計算臟器指數(shù)(臟器指數(shù)＝臟器濕重mg/小鼠體重g)，然后取腦；將胸腺、脾臟、子宮、腦組織固定于10％甲醛溶液中，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察各組的組織形態(tài)學(xué)變化。
2.2.1自主活動次數(shù)測試
將各組小鼠放入自主活動儀中，先適應(yīng)環(huán)境1min，然后測定5min內(nèi)自主活動次數(shù)。
2.2.2避暗法測試
將各組小鼠尾部對著進入暗室的小口放入測定盒中，進行訓(xùn)練，24h后重新測定小鼠首次進入暗室的潛伏期及5min內(nèi)進入暗室遭電擊的次數(shù)。
2.2.3試劑盒測定方法
小鼠雌二醇(E2)、睪酮(T)、黃體生成素(LH)、促卵泡素(FSH)、白細(xì)胞介素2(IL-2)ELISA檢測試劑盒測定方法詳見說明書。
2.3統(tǒng)計學(xué)處理方法
數(shù)據(jù)分析用SPSS17.0醫(yī)用統(tǒng)計包進行數(shù)據(jù)資料的統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間比較采用單因素方差分析，方差檢驗齊者用LSD法，方差不齊者用Games-Howell法檢驗，等級資料采用Ridit檢驗。
結(jié)果
1.對圍絕經(jīng)期模型小鼠自主活動的影響
杜仲葉總黃酮對圍絕經(jīng)期模型小鼠自主活動的影響，結(jié)果見表1。
表1杜仲葉總黃酮對圍絕經(jīng)期模型小鼠自主活動的影響
注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01
由表1可看出，與空白組比，模型組小鼠的活動、站立次數(shù)均顯著減少(P<0.01)，反映了圍絕經(jīng)期模型小鼠對新鮮環(huán)境的好奇程度降低。與模型組比，大豆異黃酮軟膠囊組、更年安膠囊組、大、中劑量杜仲葉總黃酮組均可顯著提高小鼠的活動次數(shù)(P<0.01)。
2.對圍絕經(jīng)期模型小鼠避暗法潛伏期和受電擊次數(shù)的影響
杜仲葉總黃酮對圍絕經(jīng)期模型小鼠暗室潛伏期和受電擊次數(shù)的影響，結(jié)果見表2
表2杜仲葉總黃酮對圍絕經(jīng)期模型小鼠暗室潛伏期和受電擊次數(shù)的影響
注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01
由表2可知，與空白組比，模型組小鼠的受電擊次數(shù)顯著增加(P<0.01)，反映了圍絕經(jīng)期模型小鼠記憶力降低。與模型組比，大豆異黃酮軟膠囊組、更年安膠囊組、大、中、小劑量杜仲葉總黃酮組均可顯著延長暗室潛伏期，減少小鼠受電擊次數(shù)(P<0.01)。
3.對圍絕經(jīng)期模型小鼠臟器指數(shù)的影響
杜仲葉總黃酮對圍絕經(jīng)期模型小鼠胸腺、脾臟、子宮指數(shù)的影響，結(jié)果見表3。表3杜仲葉總黃酮對圍絕經(jīng)期模型小鼠胸腺、脾臟、子宮指數(shù)的影響
注：*P<0.05，**P<0.01，表示與模型組比較
由表3可知，與空白組比，模型組小鼠的子宮指數(shù)顯著降低(P<0.01)，說明摘除卵巢導(dǎo)致圍絕經(jīng)期模型小鼠子宮萎縮。與模型組比，大豆異黃酮軟膠囊組、更年安膠囊組、中劑量杜仲葉總黃酮組均可顯著提高胸腺、脾臟、子宮指數(shù)(P<0.01)。
4.對圍絕經(jīng)期模型小鼠血清性激素含量的影響
杜仲葉總黃酮對圍絕經(jīng)期模型小鼠血清中E2、T含量的影響，結(jié)果見表4；杜仲葉總黃酮對圍絕經(jīng)期模型小鼠血清中FSH、LH含量的影響，結(jié)果見表5。
表4杜仲葉總黃酮對圍絕經(jīng)期模型小鼠血清中E2、T含量的影響
注：*P<0.05，**P<0.01，表示與模型組比較
表5杜仲葉總黃酮對圍絕經(jīng)期模型小鼠血清中FSH、LH含量的影響
注：*P<0.05，**P<0.01，表示與模型組比較
由表4、表5可以看出，與空白組比，模型組小鼠血清中E2、T水平顯著下降(P<0.01)，LH、FSH水平均顯著升高(P<0.01)，說明小鼠血清中的性激素水平紊亂，圍絕經(jīng)期小鼠模型復(fù)制成功。與模型組比，大劑量杜仲葉總黃酮組均可顯著升高血清E2、T水平(P<0.01)，明顯降低升高的LH、FSH水平(P<0.05)。
5.對圍絕經(jīng)期模型小鼠血清中IL-2含量的影響
杜仲葉總黃酮對圍絕經(jīng)期模型小鼠血清中IL-2含量的影響，結(jié)果見表6。
表6杜仲葉總黃酮對圍絕經(jīng)期模型小鼠血清中IL-2含量的影響
注:*P<0.05，**P<0.01，表示與模型組比較
由表6可知，與空白組比，模型組小鼠血清中IL-2水平顯著下降(P<0.01)，說明完全摘除卵巢所致圍絕經(jīng)期小鼠模型機體免疫力有所降低。與模型組比，各給藥組均可顯著升高血清IL-2水平(P<0.01)。
6.對圍絕經(jīng)期模型小鼠器官組織形態(tài)的影響
杜仲葉總黃酮模型小鼠子宮、胸腺、脾臟、垂體的病理組織學(xué)觀察，采用測微尺，測定實驗各組每只小鼠子宮內(nèi)膜的厚度。結(jié)果見表7；采用測微尺，對實驗各組每只小鼠胸腺皮質(zhì)最厚處和最窄處測定其厚度求得均數(shù)；然后用測微尺的基線測得壓在基線上的胸腺皮質(zhì)最厚處和最窄處的淋巴細(xì)胞數(shù)求得均數(shù)，結(jié)果見表8；采用測微尺的基線落在脾小結(jié)上，以中央動脈為中心分別測定兩側(cè)的脾小結(jié)厚度大小，求均數(shù)；同時計算落在基線上兩側(cè)的淋巴細(xì)胞數(shù)的個數(shù)，求均數(shù)；采用測微尺測量對角線上腺垂體的數(shù)量并求得平均值。
表7杜仲葉總黃酮對圍絕經(jīng)期模型小鼠子宮內(nèi)膜厚度的影響
注:*P<0.05，**P<0.01，表示與模型組比較
由表7可知，與空白組比，模型組小鼠子宮內(nèi)膜厚度顯著下降(P<0.01)，說明完全摘除卵巢所致圍絕經(jīng)期小鼠模型顯著子宮萎縮。與模型組比，大豆異黃酮軟膠囊組、更年安膠囊組，大劑量杜仲葉總黃酮膠囊組均可顯著升高子宮內(nèi)膜的厚度(P<0.01)。
6.2對圍絕經(jīng)期模型小鼠胸腺、脾臟組織形態(tài)的影響
表8杜仲葉總黃酮對圍絕經(jīng)期模型小鼠胸腺的影響
注：*P<0.05，**P<0.01，表示與模型組比較
從表8可知，與空白組比，模型組小鼠胸腺皮質(zhì)厚度、脾小結(jié)體積顯著減少(P<0.01)，說明小鼠造圍絕經(jīng)期模型后胸腺、脾臟體積萎縮。與模型組比，大豆異黃酮膠囊、更年安膠囊、大、中劑量杜仲葉總黃酮組可顯著增厚胸腺皮質(zhì)和脾小結(jié)體積(P<0.01)。
6.3對小鼠圍絕經(jīng)期模型垂體組織形態(tài)的影響
表9杜仲葉總黃酮對圍絕經(jīng)期模型小鼠腺垂體數(shù)量的影響
注:*P<0.05，**P<0.01，表示與模型組比較
從表9可知，與空白組比，模型組腺垂體的數(shù)量顯著減少(P<0.01)，說明小鼠造圍絕經(jīng)期模型后分泌促性激素的細(xì)胞源減少。與模型組比，大、中、小劑量杜仲葉總黃酮組可顯著增加腺垂體的數(shù)量體積(P<0.01)。
應(yīng)有本品制備用于治療圍絕經(jīng)期綜合征的藥物(膠囊)，并經(jīng)88例圍絕經(jīng)期綜合征患者臨床應(yīng)用，取得了顯著的治療效果?；颊呙咳辗?次，每次2粒，每粒含杜仲葉總黃酮0.5g，連服60天，除2人外，臨床癥狀消失或臨床癥狀有明顯改善或改善者86人，有效率高達97.7％，效果之好是未曾料到的，是治療圍絕經(jīng)期綜合征藥物上的創(chuàng)新，開拓了杜仲葉的新用途，經(jīng)濟和社會效益顯著。