本發(fā)明涉及一種脫色的具有抗腫瘤活性的銀杏外種皮提取物及其制劑的制備方法，屬于中藥制藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

銀杏外種皮俗稱白果衣，是白果最外層的肉質(zhì)皮。江蘇為銀杏產(chǎn)區(qū)，外種皮資源極其豐富。銀杏外種皮提取物（Ginkgo biloba exocarp extracts，GBEE）是本課題組從銀杏的外種皮中提取的以多糖類化合物為主要成分的組合物，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)GBEE具有顯著的抗腫瘤作用，其膠囊制劑作為醫(yī)院制劑在臨床應(yīng)用于惡性腫瘤患者多年，廣受青睞，開發(fā)前景樂觀。但GBEE與大多植物提取物類似，顏色偏深，制備口服液等劑型有可能影響患者的依從性（見施心建, 晏新連, 陳躍雪. 薄膜衣片顏色的選擇依據(jù)[J]. 中國藥業(yè), 2007, 16(02):45-46）。故以往在制備GBEE固體制劑的過程中不得不加入多于原料藥的白色賦形劑，使成品藥物的顏色變淺。因此，如何對GBEE進(jìn)行脫色處理，一直是本領(lǐng)域技術(shù)人員努力解決的技術(shù)難題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有工藝的不足，提供一種脫色的具有抗腫瘤活性的銀杏外種皮提取物及其制劑的制備方法。

本發(fā)明的第一個目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，脫色的具有抗腫瘤活性的銀杏外種皮提取物的制備方法，包括以下步驟：

（1）將被乙醇浸泡過的干銀杏外種皮置于煮提鍋中常規(guī)加水煎煮 2 - 3 次并分別過濾，將濾液合并減壓濃縮，得到濃縮液，將95-100 ％乙醇緩慢加入濃縮液中，使乙醇終濃度在 86 - 88%（V/V） ，邊加邊快速攪動，靜置后將沉淀物再用高濃度乙醇洗滌數(shù)次后真空干燥或冷凍干燥，得GBEE粗粉；

（2）將GBEE粗粉配制成濃度為5-20mg/mL的水溶液，加入95-100%乙醇浸泡24h后的大孔吸附樹脂，將溶液與樹脂的混合物封口，置50-60℃水浴搖床，120-160r/min轉(zhuǎn)速反應(yīng)5-8h；

（3）反應(yīng)結(jié)束后，過濾去除樹脂，將濾液減壓濃縮，向濃縮液中緩慢加入乙醇，使乙醇終濃度為60-80%（V/V），邊加邊快速攪動，靜置沉淀6-10h；

（4）將沉淀物用高濃度乙醇洗滌1-2次后真空干燥或冷凍干燥，得到脫色的具有抗腫瘤活性的GBEE。

步驟（1）中所述濃縮液的比重為 1.21 - 1.30。

步驟（2）中所述的大孔吸附樹脂型號為D101、LX-60或LX-20，乙醇浸泡后需水洗至無醇味，GBEE粗粉：大孔吸附樹脂的重量比為1：（8-15）（W/W）。

步驟（3）中所述的將濾液減壓濃縮得到的濃縮液的比重為 1 .10 - 1 .20。

步驟（4）中所述的脫色的具有抗腫瘤活性的GBEE，其水溶液（10mg/mL）在450nm下的OD值不高于0.200，其多糖含量與蛋白質(zhì)含量之和大于80%，在10-320μg/ml劑量范圍內(nèi)其對HepG-2細(xì)胞的最高抑制率不低于65%。

本發(fā)明的第二個目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，脫色的具有抗腫瘤活性的GBEE制劑的制備方法，將上述方法制備的脫色的GBEE干粉加入少量賦型劑或矯味劑和防腐劑，制成膠囊劑、片劑或口服液制劑。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明具有科學(xué)性和可行性，工藝簡單，實用性強，將GBEE粗粉制備成水溶液后，采用中性樹脂吸附其中的小分子色素及無活性的游離物質(zhì)，使最終提取物的顏色變淺，抗腫瘤效價提高，在無需使用大量白色賦形劑的條件下，所制備的片劑和口服液顏色柔和，觀感佳，其多糖與蛋白質(zhì)含量之和大于80%，抗腫瘤效果好。且樹脂可回收再利用，經(jīng)濟實惠，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。

1、顏色深淺測定

將脫色前和脫色后的GBEE干粉配制為10mg/ml,采用紫外-可見分光光度計于450nm處測定其水溶液的吸光度值（0D值），檢測脫色效果。0D值越大，顏色越深。結(jié)果見表1。

表1脫色前后的GBEE水溶液OD值

表1結(jié)果顯示，脫色后的GBEE水溶液0D值明顯減小。

2、肽多糖含量的測定

采用苯酚硫酸法測多糖含量：精密稱取無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品適量，用蒸餾水配成1mg /ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，再進(jìn)一步稀釋為不同濃度。精密量取濃度為30μg/ml、60μg/ml、90μg/ml、120μg/ml、150μg/ml、180μg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5ml于6支10ml具塞試管中，加入50mg/ml的重蒸酚溶液1ml，混合均勻后，加入5ml濃硫酸，混合均勻，沸水浴15min，冷水浴30min。用紫外分光光度計于490nm處測定吸光度，對葡萄糖溶液濃度和吸光度進(jìn)行線性回歸，建立回歸方程。取脫色的具有抗腫瘤活性的GBEE供試品溶液0.5ml，按上述操作測吸光度值，代入回歸方程，計算出多糖含量。

采用考馬斯亮藍(lán)法測蛋白質(zhì)含量：精密稱取牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品適量，用蒸餾水配成100μg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，再進(jìn)一步稀釋為不同濃度。精密量取濃度為20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5ml分別于5支10ml具塞試管，再加入2.5ml考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，搖勻后，放置5～10min，待其充分反應(yīng)后，用紫外分光光度計于595nm處測定吸光度，對牛血清白蛋白溶液濃度和吸光度進(jìn)行線性回歸，建立回歸方程。取脫色的具有抗腫瘤活性的GBEE供試品溶液0.5ml，按上述操作測吸光度值，代入回歸方程，計算出蛋白質(zhì)含量。

肽多糖含量%=(多糖含量+蛋白質(zhì)含量)%。

采用該方法制備的脫色的具有抗腫瘤活性的GBEE其中多糖含量為58%、蛋白質(zhì)含量為24%，肽多糖總含量為58%+24%=82%。

3、藥效研究

取處于對數(shù)生長期的人肝癌HepG-2細(xì)胞，用胰蛋白酶消化、Hank’s液洗滌后用含10%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞至1×10⁵/ml。向96孔培養(yǎng)板各孔中分別加入上述細(xì)胞懸液100μl，在5%CO₂、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入用含10%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液配制的不同濃度的脫色的銀杏外種皮提取物各 100μl，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束前4h加入MTT（終濃度5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去培養(yǎng)液，加入酸化異丙醇，振蕩10min，用酶標(biāo)儀于570nm處測定各孔的OD值。按公式“抑制率=(1-藥物孔OD值/對照孔OD值)×100%”，計算脫色的具有抗腫瘤活性的GBEE體外對HepG-2細(xì)胞增殖的抑制率。結(jié)果見表2。

表2 脫色的具有抗腫瘤活性的GBEE體外對HepG-2細(xì)胞的抑制作用

表2結(jié)果顯示，脫色的GBEE在10-320μg/ml劑量下對Hepg-2腫瘤細(xì)胞具有直接抑制作用，而且隨著劑量增加，其抑制作用逐漸增強。經(jīng)SPSS軟件統(tǒng)計，其IC₅₀為53.3μg/ml。

具體實施方式

實施例1

取被乙醇浸泡過的干銀杏外種皮 100 千克按料液比為1:8置于煮提鍋中加水常規(guī)煎煮1 小時，過濾后繼續(xù)加水重復(fù)上述煎煮方法 1 次并過濾，將 2 次的濾液合并，于 70℃ 減壓濃縮至比重為 1.21 ，將95-100 ％的乙醇緩慢加入濃縮液中，使乙醇終濃度在86 %（V/V），邊加邊快速攪動，靜置 6 小時后將沉淀物離心甩干，再用高濃度乙醇（體積濃度98%以上）洗滌 2 次后真空干燥或冷凍干燥，此即GBEE粗粉；稱取此GBEE粗粉100g，配制成10mg/mL的水溶液，按1:8（W/W）加入D101大孔吸附樹脂，將溶液與樹脂的混合物封口后置55℃水浴搖床，120r/min轉(zhuǎn)速反應(yīng)6h；反應(yīng)結(jié)束后，過濾去除樹脂，將濾液減壓濃縮至比重為1.10，向濃縮液中緩慢加入乙醇，使乙醇終濃度為60%（V/V），邊加邊快速攪動，靜置沉淀6h；將沉淀物用高濃度乙醇洗滌數(shù)次后真空干燥或冷凍干燥，得到脫色的具有抗腫瘤活性的GBEE。采用紫外-可見分光光度計于450nm處測定其水溶液（10mg/mL）的0D值，結(jié)果顯示，GBEE粗粉水溶液的OD值為0.544，脫色的GBEE水溶液的OD值為0.156，顏色明顯變淺。采用苯酚硫酸法及考馬斯亮藍(lán)法分別檢測其多糖及蛋白質(zhì)含量，結(jié)果分別為57%及24%，肽多糖總含量為81%。采用MTT法體外檢測對HepG-2細(xì)胞增殖的影響，接種細(xì)胞24h后加入脫色的GBEE繼續(xù)培養(yǎng)48h檢測。結(jié)果顯示，脫色的GBEE終濃度在320μg/ml ，160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，20μg/ml，10μg/ml下可直接抑制HepG-2細(xì)胞生長，且隨著劑量增加，其抑制作用逐漸增強，抑制率（%）分別為70，63，54，46，35及29，IC₅₀為52.8μg/ml。取脫色的具有抗腫瘤活性的GBEE干粉150g，加入賦型劑50g，拌勻，按每粒200mg裝入空心膠囊，制成膠囊劑。

實施例2

取被乙醇浸泡過的干銀杏外種皮 200 千克按料液比為1:10置于煮提鍋中加水常規(guī)煎煮0.5 小時，過濾后繼續(xù)加水重復(fù)上述煎煮方法 2次并過濾，將 3 次的濾液合并，于 70℃ 減壓濃縮至比重為 1.30 ，將98％的乙醇緩慢加入濃縮液中，使乙醇終濃度在87%（V/V） ，邊加邊快速攪動，靜置 6 小時后將沉淀物離心甩干，再用高濃度乙醇洗滌數(shù)次后真空干燥或冷凍干燥，此即GBEE粗粉；稱取此GBEE粗粉150g，配制成5mg/mL的水溶液，按1:10（W/W）加入LX-20大孔吸附樹脂，將溶液與樹脂的混合物封口后置50℃水浴搖床，130r/min轉(zhuǎn)速反應(yīng)8h；反應(yīng)結(jié)束后，過濾去除樹脂，將濾液減壓濃縮至比重為1.15，向濃縮液中緩慢加入乙醇，使乙醇終濃度為70%（V/V），邊加邊快速攪動，靜置沉淀8h；將沉淀物用高濃度乙醇洗滌數(shù)次后真空干燥或冷凍干燥，得到脫色的具有抗腫瘤活性的GBEE。采用紫外-可見分光光度計于450nm處測定其水溶液（10mg/mL）的0D值，結(jié)果顯示，GBEE粗粉水溶液的OD值為0.546，脫色的GBEE水溶液的OD值為0.152，顏色明顯變淺。采用苯酚硫酸法及考馬斯亮藍(lán)法分別檢測其多糖及蛋白質(zhì)含量，結(jié)果分別為59%及23%，肽多糖總含量為82%。采用MTT法體外檢測對HepG-2細(xì)胞增殖的影響，接種細(xì)胞24h后加入脫色的GBEE繼續(xù)培養(yǎng)48h檢測。結(jié)果顯示，脫色的GBEE終濃度在320μg/ml ，160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，20μg/ml，10μg/ml下可直接抑制HepG-2細(xì)胞生長，且隨著劑量增加，其抑制作用逐漸增強，抑制率（%）分別為72，64，54，43，36及30，IC₅₀為52.1μg/ml。取脫色的具有抗腫瘤活性的GBEE干粉300g，加入賦型劑100g，拌勻，按每片 100mg制成片劑。

實施例3

取被乙醇浸泡過的的干銀杏外種皮 100 千克按料液比為1:12置于煮提鍋中加水常規(guī)煎煮1小時，過濾后繼續(xù)加水重復(fù)上述煎煮方法 2 次并過濾，將 3 次的濾液合并，于 70℃ 減壓濃縮至比重為 1.25，將95 ％的乙醇緩慢加入濃縮液中，使乙醇終濃度在88%（V/V），邊加邊快速攪動，靜置 6 小時后將沉淀物離心甩干，再用高濃度乙醇洗滌數(shù)次后真空干燥或冷凍干燥，此即GBEE粗粉；稱取此GBEE粗粉200g，配制成20mg/mL的水溶液，按1:15（W/W）加入LX-60大孔吸附樹脂，將溶液與樹脂的混合物封口后置60℃水浴搖床，160r/min轉(zhuǎn)速反應(yīng)5h；反應(yīng)結(jié)束后，過濾去除樹脂，將濾液減壓濃縮至比重為1.20，向濃縮液中緩慢加入乙醇，使乙醇終濃度為80%（V/V），邊加邊快速攪動，靜置沉淀10h；將沉淀物用高濃度乙醇洗滌數(shù)次后真空干燥或冷凍干燥，得到脫色的具有抗腫瘤活性的GBEE。采用紫外-可見分光光度計于450nm處測定其水溶液（10mg/mL）的0D值，結(jié)果顯示，GBEE粗粉水溶液的OD值為0.551，脫色的GBEE水溶液的OD值為0.159，顏色明顯變淺。采用苯酚硫酸法及考馬斯亮藍(lán)法分別檢測其多糖及蛋白質(zhì)含量，結(jié)果分別為57%及24%，肽多糖總含量為81%。采用MTT法體外檢測對HepG-2細(xì)胞增殖的影響，接種細(xì)胞24h后加入脫色的GBEE繼續(xù)培養(yǎng)48h檢測。結(jié)果顯示，脫色的GBEE終濃度在320μg/ml ，160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，20μg/ml，10μg/ml下可直接抑制HepG-2細(xì)胞生長，且隨著劑量增加，其抑制作用逐漸增強，抑制率（%）分別為69，61，52，44，34及27，IC₅₀為53.1μg/ml。取脫色的具有抗腫瘤活性的GBEE干粉100g溶解于純凈水中，按藥物質(zhì)量要求加入適量矯味劑和防腐劑，搖勻，按10ml規(guī)格裝瓶，制成口服液制劑。