本發(fā)明涉及富馬酸二甲酯在制備預(yù)防和治療移植物抗宿主病及移植物抗白血病藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)是當(dāng)今治療惡性血液病的有效手段，急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host-disease,aGVHD)是其重要并發(fā)癥，aGVHD是移植物中以T細(xì)胞為主的淋巴細(xì)胞識別宿主抗原致敏、增殖、分化，直接或間接攻擊宿主組織器官產(chǎn)生的病理損傷。目前臨床常規(guī)防治GVHD的經(jīng)典方案為環(huán)孢菌素(CSA)+短程甲氨喋呤(MTX)，然而此類藥物是針對整個(gè)免疫系統(tǒng)的，其不僅導(dǎo)致感染增加，而且部分患者仍會發(fā)生嚴(yán)重GVHD，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。因此尋找有效防治GVHD而不影響移植物抗白血病的新方法顯得尤為重要。

富馬酸二甲酯(Dimethylfumarate，DMF)，分子式CH₃OOCCH＝CHCOOCH₃，分子量144.13。它最初被確認(rèn)為一種非常有效的缺氧細(xì)胞的放射增敏劑。后來結(jié)合三個(gè)其它富馬酸酯基(FAE)的DMF在德國被授權(quán)口服治療牛皮癬(Fumaderm)。偶見報(bào)道治療其它疾病，如類脂質(zhì)漸進(jìn)性壞死，環(huán)狀肉芽腫，結(jié)節(jié)病也被發(fā)現(xiàn)用DMF治療。近日，III期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DMF(BG-12)成功地降低了多發(fā)性硬化癥的殘疾進(jìn)程的復(fù)發(fā)率和復(fù)發(fā)時(shí)間。DMF被認(rèn)為具有無重大免疫抑制的免疫調(diào)節(jié)特性。歐盟EMA在2013年3月21日批準(zhǔn)DMF以名稱“Tecfidera”推薦作為多發(fā)性硬化癥MS的口服治療劑；2013年3月27日美國FDA批準(zhǔn)Tecfidera膠囊治療成人復(fù)發(fā)型多發(fā)性硬化癥。

目前，對于造血干細(xì)胞移植后移植物抗宿主病的預(yù)防和治療，現(xiàn)有的藥物存在一定的副作用，缺乏有效藥物的治療，也沒有DMF對aGVHD進(jìn)行預(yù)防及治療的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種富馬酸二甲酯在制備預(yù)防和治療移植物抗宿主病及移植物抗白血病藥物中的應(yīng)用。

為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一種富馬酸二甲酯或含有富馬酸二甲酯的藥物組合物在制備藥物中的用途，該藥物用于預(yù)防和治療異基因造血干細(xì)胞移植后的急性移植物抗宿主病。

具體地，該藥物用于抑制異基因造血干細(xì)胞移植后活化的T細(xì)胞的增殖。

具體地，該藥物用于抑制樹突狀細(xì)胞的增殖、活化和抗原提成能力。

具體地，該藥物用于抑制Th1細(xì)胞反應(yīng)。

具體地，該藥物用于減輕急性移植物抗宿主病的同時(shí)保留移植物抗白血病效應(yīng)。

由于上述技術(shù)方案的實(shí)施，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)富馬酸二甲酯具有明顯的抑制急性移植物抗宿主病的作用，可用來制備預(yù)防和治療移植物抗宿主病及移植物抗白血病的藥物。

附圖說明

附圖1為小鼠的生存曲線、臨床評分變化曲線圖，其中，DMF組與control組相比小鼠生存時(shí)間明顯延長(P＝0.005)；

附圖2為control組和DMF組小鼠肺部、肝臟和腸道、皮膚組織H&E染色圖，control組小鼠肝、肺、小腸間質(zhì)、皮膚可見淋巴細(xì)胞浸潤，而DMF組小鼠肝、肺、小腸間質(zhì)、皮膚淋巴細(xì)胞浸潤明顯減少；

附圖3為DMF對同種T細(xì)胞反應(yīng)的抑制作用圖，其中，*表示P＜0.05；

附圖4為DMF對脾細(xì)胞增殖能力的抑制作用圖，其中，*表示P＜0.05；

附圖5為DMF組小鼠細(xì)胞因子TNF-α的分泌抑制圖；

附圖6為DMF組小鼠細(xì)胞因子IFN-γ的分泌抑制圖；

附圖7為DMF組中對CD80的抑制作用圖；

附圖8為DMF組中對CD86的抑制作用圖；

附圖9為DMF組中對CD40的抑制作用圖；

附圖10為DMF組中對細(xì)胞因子IL-6的表達(dá)抑制圖；

附圖11為DMF組中對細(xì)胞因子TNF-α的表達(dá)抑制圖；

附圖12為CD4⁺Treg和CD8⁺Treg的細(xì)胞百分比圖；

附圖13為CD3⁺T、CD4⁺T和CD8⁺T的細(xì)胞百分比圖；

附圖14為CD4⁺T和CD8⁺T的細(xì)胞百分比圖；

附圖15為小鼠生存曲線圖；

附圖16為小鼠體內(nèi)白血病細(xì)胞的活體成像圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。本發(fā)明中若無特別說明，原料均可市購獲得，方法為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

一：材料和方法

(一)、動(dòng)物

7～8周齡SPF級BALB/c小鼠(H-2^d)，體重20～24g；6～8周齡SPF級C57BL/6小鼠(H-2^b)，體重20～24g，購自中國上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有的程序是根據(jù)動(dòng)物護(hù)理委員會和美國國立衛(wèi)生研究院的關(guān)懷和使用動(dòng)物的指南進(jìn)行。所有實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)于SPF(specific pathogen-free facility)級別的隔離籠中，飼料及墊料均經(jīng)60Co輻照滅菌處理，飲用水經(jīng)高溫高壓滅菌及酸化處理并加入慶大霉素，于蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心無菌層流房中飼養(yǎng)。

(二)、細(xì)胞株

小鼠B淋巴瘤細(xì)胞株A20(帶luciferace)培養(yǎng)于含10％胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，37℃、5％CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

(三)、主要試劑及耗材

DMF：sigma公司，美國

甲基纖維素：sigma公司，美國

³H-TdR：中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所

CD16/CD32FcR阻斷抗體：BD Pharmingen，美國

PE-CD3ε單克隆抗體：BD Pharmingen，美國

FITC-CD4單克隆抗體：BD Pharmingen，美國

PE-cy5.5-CD8α單克隆抗體：BD Pharmingen，美國

APC-CD69單克隆抗體：BD Pharmingen，美國

FITC-H-2Kb單克隆抗體：BD Pharmingen，美國

PE-H-2Kd單克隆抗體：BD Pharmingen，美國

PE-IL-17單克隆抗體：BD Pharmingen，美國

APC-IFN-γ克隆抗體：BD Pharmingen，美國

PE-TNF-α克隆抗體：BD Pharmingen，美國

Foxp3染色試劑盒：ebioscience，美國

RPMI-1640培養(yǎng)基：Hyclone，美國

DMEM培養(yǎng)基：Gibco，美國

胎牛血清：Hyclone，美國

青霉素、鏈酶素：石家莊拜斯德醫(yī)藥化工有限公司

蘇木精-伊紅染色：碧云天生物科技有限公司

試劑盒：Promega，美國

96孔U形底培養(yǎng)板：Becton Dickinson，美國

96孔平底培養(yǎng)板：Becton Dickinson，美國

(四)、實(shí)驗(yàn)方法

1、小鼠脾細(xì)胞、造血干細(xì)胞懸液的制備

1.1、小鼠脾細(xì)胞懸液的制備

頸椎脫位處死小鼠，于超凈臺內(nèi)無菌操作取出小鼠脾臟，載玻片輕柔研磨直至大部分脾臟細(xì)胞均已研出，尼龍網(wǎng)過濾所得細(xì)胞懸液，1200rpm 4℃離心5min，棄上清，加入2ml的1×紅細(xì)胞裂解液，混勻，室溫放置5min，加入5ml RPMI-1640培養(yǎng)基，1200rpm 4℃離心5min，棄上清，用1ml的1×PBS重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)。置于4℃待用。

1.2、小鼠造血干細(xì)胞懸液的制備

頸椎脫位處死小鼠，于超凈臺內(nèi)無菌操作取出小鼠脊椎、股骨、脛骨，置于研缽輕柔擠壓研磨，重復(fù)此操作，直至大部分細(xì)胞均已研出。尼龍網(wǎng)過濾所得細(xì)胞懸液，1200rpm、4℃離心5min，棄上清，加入3ml的1×紅細(xì)胞裂解液，混勻，室溫放置5min，加入5ml RPMI-1640培養(yǎng)基，1200rpm 4℃離心5min，棄上清，用1ml的1×PBS重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，置于4℃待用。

2、急性移植物抗宿主病模型的建立

實(shí)驗(yàn)開始前一周，給BALB/C小鼠喂慶大霉素水溶液預(yù)防腸道感染，將小鼠分為實(shí)驗(yàn)組(10只)和對照組(10只)，SPF級小鼠進(jìn)行全身照射8.5Gy。照射4小時(shí)后尾靜脈注射供鼠(C56BL/6鼠)骨髓(1×10⁷)及脾細(xì)胞(5×10⁶)，誘導(dǎo)急性移植物抗宿主病模型。實(shí)驗(yàn)組予DMF(30mg/kg，200μl每只，-3d至+3d)灌胃，對照組予等量安慰劑(0.8％甲基纖維素)(200μl每只，3d至+3d)灌胃。

3、aGVHD臨床表現(xiàn)觀察

移植后每天觀察受鼠一次，每2天測體重1次，觀察體重減輕、姿勢改變、活動(dòng)度、體毛改變和皮膚完整性等臨床aGVHD指標(biāo)。表1為異基因造血干細(xì)胞移植后小鼠aGVHD臨床積分評分標(biāo)準(zhǔn)表。

表1

4、aGVHD病理組織學(xué)檢查

移植后10d處死部分小鼠，取肝臟、回腸、肺、皮膚，用10％中性甲醛固定48小時(shí)。用濃度遞增酒精置換組織內(nèi)水分，石蠟包埋并切成5μm厚度的切片，用二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，蘇木素－伊紅染色，樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察。aGVHD病理學(xué)主要研究肝臟、回腸、肺、皮膚四個(gè)靶器官受損程度。肝臟GVHD病理學(xué)觀察匯管區(qū)淋巴細(xì)胞浸潤、膽管壞死、肝細(xì)胞灶狀壞死。小腸GVHD病理學(xué)觀察單個(gè)核細(xì)胞浸潤、杯狀細(xì)胞退化凋亡缺失、隱窩表面膿性分泌物、粘膜破損潰瘍。肺部GVHD病理學(xué)觀察肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤。皮膚GVHD病理學(xué)觀察表皮界面壞死、炎癥細(xì)胞浸潤、脂肪萎縮、毛囊減少。

5、系譜特異性嵌合度檢查

BALB/c受鼠H-2I類抗原分子為H-2^d型，C57BL/6供鼠H-2I類抗原分子為H-2^b型。造血干細(xì)胞移植后10d取受體鼠的脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，F(xiàn)ACS緩沖液(PBS+0.5％BSA+0.1％疊氮鈉)重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。細(xì)胞懸液先加CD16/CD32FcR阻斷抗體于4℃封閉20min，然后加特異性熒光標(biāo)記抗體FITC-H-2Kb單克隆抗體，PE-H-2Kd單克隆抗體于4℃孵育20分鐘，離心沉淀細(xì)胞，F(xiàn)ACS緩沖液洗滌一遍后重懸上BD流式細(xì)胞儀檢測，CellQuest軟件分析數(shù)據(jù)。

6、移植后小鼠脾淋巴細(xì)胞的獲取

頸椎脫臼法處死小鼠，于超凈臺內(nèi)無菌操作取出小鼠脾臟，載玻片輕柔研磨直至大部分脾臟細(xì)胞均已研出，尼龍網(wǎng)過濾所得細(xì)胞懸液，1200rpm 4℃離心5min，棄上清，加入2ml 1×紅細(xì)胞裂解液，混勻，室溫放置5min，加入5ml RPMI-1640培養(yǎng)基，1200rpm 4℃離心5min，棄上清，1ml RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。吸取10μl用于計(jì)數(shù)。所獲得的無菌脾細(xì)胞可用于混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)和流式細(xì)胞術(shù)檢測。

7、細(xì)胞表面染色及胞內(nèi)染色

分別取方法6中獲得的脾淋巴細(xì)胞按照細(xì)胞表面標(biāo)記(1-5)×10⁵/孔，胞內(nèi)染色及Treg細(xì)胞標(biāo)記(1-5)×10⁶/孔進(jìn)行鋪板，細(xì)胞表面染色的具體步驟：PBS 100μl重懸細(xì)胞后置于96孔板中，先予CD16/CD32FcR阻斷抗體于4℃封閉FcR 20min，離心沉淀細(xì)胞，PBS 200μl重懸后加入細(xì)胞表面標(biāo)記抗體，根據(jù)不同熒光進(jìn)行組合(CD3CD4CD8CD69/孔)(CD3CD4CD8孔)，4℃避光孵育30min，1200rpm離心5min，棄上清，PBS 200μl重懸洗滌1遍，1200rpm離心5min，棄上清，PBS 200μl重懸后上BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測，需同時(shí)做四種熒光的單染管及陰性管用于調(diào)補(bǔ)償，CellQuest軟件分析數(shù)據(jù)。

胞內(nèi)染色的具體步驟：取(1-5)×10⁵/孔的脾淋巴細(xì)胞，加入含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基1ml置于24孔板中混勻，加入PMA(500ng/ml)+Ionomycin(500ng/ml)+BFA(Brefeldin A，是蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑，抑制蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體，從而抑制其向胞外分泌)，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱刺激4小時(shí)，收集細(xì)胞并以FACS Buffer充分洗滌。PBS 100μl重懸后置于96孔板中，先予CD16/CD32FcR阻斷抗體于4℃封閉FcR20min，離心沉淀細(xì)胞，PBS200μl重懸后加入細(xì)胞表面標(biāo)記CD4和CD8抗體，4℃避光孵育30min，1200rpm離心5min，棄上清，PBS 200μl重懸洗滌1遍，1200rpm離心5min，棄上清，然后以4％多聚甲醛100μl固定細(xì)胞40min，1200rpm離心5min，棄上清，加入1％saponin(皂素)破膜20min，1200rpm離心5min，棄上清，PBS 200μl重懸洗滌1遍，1200rpm離心5min，棄上清，分別加入PE-IL-17單克隆抗體，APC-IFN-γ克隆抗體，PE-TNF-α克隆抗體各1μl，避光孵育30min，1200rpm離心5min，棄上清，PBS 200μl重懸洗滌1遍，1200rpm離心5min，棄上清，PBS 200μl重懸上BD流式細(xì)胞儀檢測，需同時(shí)做四種熒光的單染管及陰性管用于調(diào)補(bǔ)償，CellQuest軟件分析數(shù)據(jù)。

8、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)

制備移植后10d受體BALB/c小鼠的脾細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，移植后10d小鼠脾細(xì)胞轉(zhuǎn)為供體型(H-2^b)，以照射后的(30Gy)BALB/c(H-2^d)來源的脾細(xì)胞作為刺激細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整效應(yīng)細(xì)胞和刺激細(xì)胞的終濃度為5×10⁶/ml 0.1ml/孔加入U(xiǎn)形底96孔培養(yǎng)板，共制板3塊，每塊板設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天，其中1塊板加入³H-TdR 1微居/孔，繼續(xù)培養(yǎng)。

9、乳酸脫氫酶釋放法測定反應(yīng)細(xì)胞殺傷活性

試劑盒檢測細(xì)胞毒性作用的化學(xué)反應(yīng)原理為：NAD⁺+乳酸→丙酮酸+NADH，NADH+INT→NAD⁺+formazan(紅色)。紅色化合物formaza對490nm波長光波吸收最明顯。以方法6中MLR體系的反應(yīng)細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，以小鼠腫瘤細(xì)胞A20(H-2^b)作為靶細(xì)胞，96孔U形底培養(yǎng)板培養(yǎng)。RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)整A20細(xì)胞濃度為2×10⁵/ml。實(shí)驗(yàn)孔中加入效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞各100μl，效應(yīng)細(xì)胞對照孔加入效應(yīng)細(xì)胞和完全培養(yǎng)基各100μl，靶細(xì)胞對照孔加入靶細(xì)胞和完全培養(yǎng)基各100μl。效:靶比設(shè)為12.5:1、25:1、50:1、100:1，加樣后平板離心機(jī)250×g離心4min，在37℃、5％CO2飽和濕度孵箱內(nèi)孵育4h。孵育后平板離心機(jī)250×g離心4min，轉(zhuǎn)移50μl至新的96孔平底板，每孔加入50μl重懸的底物，蓋上板蓋室溫下避光孵育30min，每孔加入50μl終止液，酶聯(lián)免疫檢測儀讀取490nm吸光度值。按以下公式計(jì)算效應(yīng)細(xì)胞細(xì)胞毒性：效應(yīng)細(xì)胞毒性％＝(實(shí)驗(yàn)孔OD-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放OD-靶細(xì)胞自發(fā)釋放OD)÷(靶細(xì)胞最發(fā)釋放OD-靶細(xì)胞自發(fā)釋放OD)×100。

11、GVL模型的建立

為進(jìn)一步觀察DMF在抑制aGVHD過程中對移植物抗白血病作用的影響，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分二組，每組10只小鼠：第一組：SPF級BALB/c小鼠DMF組，予DMF(30mg/kg，-3d至+3d)灌胃；CO⁶⁰8.5Gy照射預(yù)處理，照射4小時(shí)后輸注C57BL/6小鼠的骨髓(1×10⁷)細(xì)胞+脾細(xì)胞(5×10⁶)+小鼠BALB/c背景的帶luciferace的A20腫瘤細(xì)胞(5×10⁶)。第二組：SPF級BALB/c小鼠control組，對照組予安慰劑(0.8％甲基纖維素)灌胃后，CO⁶⁰ 8.5Gy照射預(yù)處理，照射4小時(shí)后輸注C57BL/6小鼠的骨髓(1×10⁷)細(xì)胞+脾細(xì)胞(5×10⁶)+小鼠BALB/c背景的帶luciferace的A20腫瘤細(xì)胞(5×10⁶)。建立小鼠移植物抗白血病模型。移植后每周在小動(dòng)物活體成像儀上實(shí)時(shí)觀測小鼠體內(nèi)的腫瘤負(fù)荷。觀察時(shí)腹腔注射底物100μg，8秒后予乙醚麻醉小鼠，在小動(dòng)物活體成像儀上觀察注射腫瘤細(xì)胞小鼠體內(nèi)的腫瘤負(fù)荷。每2天小鼠稱重，aGVHD評分，對各實(shí)驗(yàn)組小鼠的aGVHD發(fā)病率、發(fā)病時(shí)間及癥狀嚴(yán)重程度以及小鼠體內(nèi)腫瘤負(fù)荷進(jìn)行比較。

12、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Student-Newman-Keulsa,b檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 5軟件(GraphPad Software Inc.)作統(tǒng)計(jì)分析并繪圖。采用Kaplan-Meier法繪制小鼠白血病生存曲線并采用log-rank檢驗(yàn)生存期。分析所得P值小于0.05定義為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.DMF具有抑制異基因移植后急性移植物抗宿主病(aGVHD)的作用

TBI預(yù)處理后所有小鼠均出現(xiàn)放射反應(yīng)、進(jìn)食飲水量減少，移植后一周左右開始出現(xiàn)體重減輕。安慰劑(0.8％甲基纖維素)control組小鼠6天后出現(xiàn)中到重度的aGVHD表現(xiàn)如倦怠、納差、弓背、脫毛、腹瀉等現(xiàn)象，并出現(xiàn)GVHD相關(guān)消耗性體重減輕及死亡。移植后7d出現(xiàn)死亡，移植后53d全部死亡，而DMF組小鼠aGVHD表現(xiàn)癥狀輕，移植后8d開始出現(xiàn)死亡，有6只小鼠生存60d以上。小鼠的生存曲線、臨床評分變化曲線見圖1。選移植后10d為研究時(shí)間點(diǎn)，取control組和DMF組小鼠肺部、肝臟和腸道、皮膚組織H&E染色，control組小鼠腸道的隱窩腺體擴(kuò)張及上皮細(xì)胞壞死、淋巴細(xì)胞浸潤，肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤，肝臟匯管區(qū)淋巴細(xì)胞浸潤，皮膚表皮界面部分壞死、局部炎癥細(xì)胞浸潤、脂肪萎縮伴局部毛囊減少。而DMF組小鼠腸道隱窩腺體擴(kuò)張及上皮細(xì)胞壞死、淋巴細(xì)胞浸潤明顯減少，肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞少見，肝臟淋巴細(xì)胞減少，皮膚結(jié)構(gòu)相對完整、炎癥細(xì)胞少見(圖2)。

2.DMF直接抑制移植后活化的T細(xì)胞增殖

2.1DMF抑制CD3/CD28活化的T細(xì)胞的增殖

取小鼠脾臟細(xì)胞，應(yīng)用CD3/CD28抗體刺激T細(xì)胞增殖，用3H-UdR摻入處于DNA合成期的細(xì)胞，用液體閃爍計(jì)算儀測定每分鐘脈沖數(shù)(CPM)以測知3H-TdR或3H-UdR含量，用公式計(jì)算細(xì)胞抑制率。通過與control組比較，分析DMF組對小鼠同種T細(xì)胞反應(yīng)的抑制作用。數(shù)據(jù)分析見圖3，相同體外實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

結(jié)果顯示：DMF處理后脾臟T細(xì)胞增殖受到明顯抑制，且其抑制作用與DMF給藥濃度成正相關(guān)(P＜0.05)。

2.2DMF抑制同種異基因反應(yīng)性T細(xì)胞的增殖

C57BL/6小鼠脾細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞(5×10⁵/孔)，經(jīng)CO⁶⁰ 30Gy照射后的BALB/c脾細(xì)胞作為刺激細(xì)胞，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)3天。每組加入3H-TdR 1微居/孔，繼續(xù)培養(yǎng)16-18h，收集細(xì)胞，通過β液閃計(jì)數(shù)儀檢測反應(yīng)細(xì)胞的增殖情況。DMF組T細(xì)胞增殖受到抑制，其抑制程度與給藥濃度呈正相關(guān)(p<0.05)(圖4)。

2.3取上述混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的培養(yǎng)上清，應(yīng)用ELISA法檢測小鼠混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)上清中細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ含量，結(jié)果顯示：DMF組小鼠細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ的分泌均受到抑制(圖5，6)。相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4.DMF能抑制樹突狀細(xì)胞的增殖、活化和抗原提成能力

DMF組中，經(jīng)LPS刺激活化的樹突狀細(xì)胞成熟受到抑制，見圖7、8、9。應(yīng)用ELISA法檢測小鼠細(xì)胞因子IL-6、TNF-α含量，結(jié)果顯示：DMF組細(xì)胞因子IL-6、TNF-α的表達(dá)均受到抑制，見圖10、11。

5.DMF能增加Treg細(xì)胞的數(shù)量，抑制Th1細(xì)胞反應(yīng)

選移植后10d為研究時(shí)間點(diǎn)，取兩組小鼠脾臟細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀對移植后小鼠脾臟淋巴細(xì)胞進(jìn)行Treg、CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺T細(xì)胞檢測。從細(xì)胞百分比分析DMF對小鼠Treg細(xì)胞、Th1細(xì)胞的作用。數(shù)據(jù)分析見圖12、13、14。分析比較DMF與Control兩組數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示：DMF能增加小鼠脾臟Treg細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)抑制Th1細(xì)胞的反應(yīng)。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*表示P＜0.05，**表示P＜0.01)。相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

6.DMF能夠在減輕aGVHD的同時(shí)保留GVL效應(yīng)

第一組：SPF級BALB/c小鼠DMF組，予DMF(30mg/kg，-3d至+3d)灌胃；CO⁶⁰ 8.5Gy照射預(yù)處理，照射4小時(shí)后輸注C57BL/6小鼠的骨髓(1×10⁷)細(xì)胞+脾細(xì)胞(5×10⁶)+小鼠BALB/c背景的帶luciferace的A20腫瘤細(xì)胞(5×10⁶)。第二組：SPF級BALB/c小鼠control組，對照組予安慰劑(0.8％甲基纖維素)灌胃后，CO⁶⁰ 8.5Gy照射預(yù)處理，照射4小時(shí)后輸注C57BL/6小鼠的骨髓(1×10⁷)細(xì)胞+脾細(xì)胞(5×10⁶)+小鼠BALB/c背景的帶luciferace的A20腫瘤細(xì)胞(5×10⁶)。建立小鼠移植物抗白血病模型。結(jié)果顯示，DMF在減輕aGVHD的同時(shí)，不影響GVL效應(yīng)。圖15，小鼠生存曲線。圖16，活體成像顯示小鼠體內(nèi)的白血病細(xì)胞。

結(jié)論

綜上所述，本發(fā)明對DMF在GVHD模型中對GVHD和GVL的作用進(jìn)行評估。我們發(fā)現(xiàn)，DMF具有抑制異基因造血干細(xì)胞移植后急性移植物抗宿主病(aGVHD)的作用；能直接抑制移植后活化的T細(xì)胞反應(yīng)；抑制樹突狀細(xì)胞的增殖、活化和抗原提成能力；抑制Th1細(xì)胞反應(yīng)；可能是通過增加Treg細(xì)胞的數(shù)量來實(shí)現(xiàn)的，DMF能夠在減輕aGVHD的同時(shí)不影響GVL效應(yīng)。

以上對本發(fā)明做了詳盡的描述，其目的在于讓熟悉此領(lǐng)域技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并加以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，且本發(fā)明不限于上述的實(shí)施例，凡根據(jù)本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。