本發(fā)明屬于醫(yī)用造影劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新的MRS造影劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

現(xiàn)有技術(shù)公開了MRS成像即磁共振波譜成像技術(shù)，是目前唯一能無創(chuàng)性觀察活體組織代謝及生化變化的技術(shù)。其原理是在相同的磁場(chǎng)環(huán)境下，處于不同化學(xué)環(huán)境中的同一種原子核，由于受到原子核周圍不同電子云的磁屏蔽作用，而具有不同的共振頻率。有關(guān)波譜分析就是利用化學(xué)位移研究分子結(jié)構(gòu)，其優(yōu)勢(shì)在于：由于代謝異常通常早于結(jié)構(gòu)變化，MRS可以檢測(cè)到常規(guī)MR不能檢測(cè)到的異常，其敏感性更高。然而，傳統(tǒng)的MRS成像技術(shù)利用體內(nèi)內(nèi)源性代謝物進(jìn)行診斷疾病，無法可靠地鑒別某些特殊病變，如無法可靠地鑒別腦膠質(zhì)瘤及腦內(nèi)其他腫瘤如淋巴瘤等，甚至一些非腫瘤性腫塊如脫髓鞘斑塊等。鑒于此，本申請(qǐng)的發(fā)明人擬采用引入外源性造影劑進(jìn)行MRS增強(qiáng)顯像，具體涉及提供一種MRS造影劑及其制備方法和應(yīng)用，而至目前為止，業(yè)內(nèi)尚無MRS造影劑概念的提出。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，針對(duì)現(xiàn)有臨床實(shí)踐的需求，提供一種MRS造影劑及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明合成的簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)的納米顆粒，能實(shí)現(xiàn)高效能MRS增強(qiáng)顯像。

本發(fā)明提供了一種新型磁共振波譜(MRS)成像造影劑。

具體的，本發(fā)明提供了一種新型醫(yī)用MRS造影劑，其中的探針材料為ALA擔(dān)載的HMSNs納米顆粒；較佳地，所述探針材料的納米顆粒尺寸為50-300nm。

本發(fā)明基于：(1)HMSNs表面易修飾，生物安全性好，載藥量高，(2)β-ALA是肝臟生成的一種非蛋白源性氨基酸，轉(zhuǎn)運(yùn)到肌肉組織中形成肌肽且中樞神經(jīng)系統(tǒng)不存在β-ALA，且MRS波譜存在特異峰于2.562ppm及3.177ppm，(3)Angiopep-2(ANG)有助于納米顆粒穿過血腦屏障并靶向腦膠質(zhì)瘤，將ALA擔(dān)載入ANG修飾的HMSNs中，形成AMSNs，制成MRS造影劑，尤其是腦膠質(zhì)瘤特異性MRS造影劑。

本發(fā)明中，所述造影劑適用于MRS造影成像。

本發(fā)明中MRS造影劑概念的提出，將打破目前常規(guī)MRS成像技術(shù)發(fā)展的禁錮，對(duì)臨床影像診斷技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用具有重要意義，可線束提高腦膠質(zhì)瘤影像學(xué)診斷的信心。

本發(fā)明所述的MRS造影劑的概念不僅適用于腦膠質(zhì)瘤，同樣也適用于其他疾病如乳腺癌等。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述MRS造影劑的制備方法，其包括：首先制備合成空心介孔氧化硅納米顆粒(Hollow Mesoporous Silica Nanoparticles，HMSNs)，然后再在其表面修飾Angiopep-2(ANG)以使得納米顆粒能夠更好地通過血腦屏障，繼而將β-丙氨酸(ALA)擔(dān)載入HMSNs的空腔及孔道內(nèi)，形成AMSNs(Alanine Loaded Hollow Mesoporous Silica Nanoparticles)。

本發(fā)明上述MRS造影劑的制備方法，包括下述步驟：

1)將ANG-HMSNs納米顆粒分散于PBS或去離子水中，并加入ALA的PBS或去離子水溶液，得到第一混合液；

2)常溫下攪拌步驟1)制備的第一混合液24～72h；

3)分離步驟2)溶液中所含ALA擔(dān)載的HMSNs納米顆粒。

本發(fā)明中，所述步驟1)中使用的ANG-HMSNs納米顆粒通過下述方法制備：

a)將NH₂-HMSNs納米顆粒、EDC、NHS及ANG配成第二混合液中，攪拌24-72h；

b)離心收集步驟a)的第二混合液，并將其分散至水中，得到ANG-HMSNs。

本發(fā)明的步驟1)中，ALA與ANG-HMSNs的質(zhì)量比為1∶(1-200)；

本發(fā)明所述的步驟a)中，NH₂-HMSNs納米顆粒、EDC、NHS及ANG的質(zhì)量比為(10～100)∶(10～100)∶(10～130)∶1。

本發(fā)明對(duì)所制得的HMSNs納米顆粒進(jìn)行了性能測(cè)試，獲得分散于去離子水中的透射結(jié)果，和制得的HMSNs納米顆粒的粒徑分布；制得的HMSNs納米顆粒的N₂吸附試驗(yàn)，制得的HMSNs、NH₂-HMSNs及ANG-HMSNs納米顆粒水溶液的數(shù)碼照片及水溶液的DLS水和動(dòng)力學(xué)直徑圖和zeta電位圖以及FT-IR圖，和不同濃度游離ALA的MRS譜線圖及所得的ALA標(biāo)準(zhǔn)曲線，ALA藥物釋放曲線，和制得的AMSNs納米顆粒瘤內(nèi)注入大鼠皮下腦膠質(zhì)瘤模型的MRS譜線圖，及注射后腦膠質(zhì)瘤的生物電鏡圖及能譜圖，制得ANG-HMSNs及AMSNs納米顆粒分別與BCEC及C6細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)后的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)圖，制得的ANG-HMSNs及AMSNs納米顆粒與C6細(xì)胞共培養(yǎng)后的MRS譜線圖，制得的ANG-HMSNs納米顆粒連接FITC后與C6細(xì)胞共培養(yǎng)2小時(shí)后共聚焦所觀察到的細(xì)胞吞噬納米顆粒的情況以及實(shí)驗(yàn)鼠注射入所制得的AMSNs納米顆粒后的體重變化情況結(jié)果圖和心、肝、脾、肺、腎、腦等各器官的組織切片圖，結(jié)果表明，本發(fā)明所述的AMSNs納米顆粒可用于MRS增強(qiáng)成像，進(jìn)一步制備MRS造影劑，所述的MRS造影劑，造影效果優(yōu)異，且無毒副作用，可成功實(shí)現(xiàn)皮下腦膠質(zhì)瘤及原位腦膠質(zhì)瘤的MRS增強(qiáng)顯像，生物相容性好，對(duì)于醫(yī)學(xué)疾病的診斷具有重要價(jià)值和意義。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)有：

HMSNs安全性好，表面易于修飾，其大空腔結(jié)構(gòu)使其能夠擔(dān)載更多的成像介質(zhì)；ALA具有特征性MRS譜線，于2.562ppm及3.177ppm處存在兩個(gè)峰，其中2.562ppm處的峰不受腦內(nèi)其他物質(zhì)峰的影響，為AMSNs的特征峰；

所述的合成的MRS造影劑的制備方法，制備工藝簡(jiǎn)易，成像效果優(yōu)異，靈敏度高，生物相容性好，對(duì)臨床影像診斷技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用具有重要意義。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1制得的HMSNs納米顆粒分散于去離子水中的透射電鏡(TEM)照片。

圖2為實(shí)施例1制得的HMSNs納米顆粒的粒徑分布圖。

圖3為明實(shí)施例1制得的HMSNs納米顆粒的N₂吸附試驗(yàn)結(jié)果。

圖4為實(shí)施例1制得的HMSNs、NH₂-HMSNs及ANG-HMSNs納米顆粒水溶液的數(shù)碼照片。

圖5為實(shí)施例1制得的HMSNs、NH₂-HMSNs及ANG-HMSNs納米顆粒水溶液的DLS水和動(dòng)力學(xué)直徑圖。

圖6為實(shí)施例1制得的HMSNs、NH₂-HMSNs及ANG-HMSNs納米顆粒水溶液的zeta電位圖。

圖7為實(shí)施例1制得的HMSNs、ANG-HMSNs及AMSNs納米顆粒的FT-IR圖。

圖8為實(shí)施例1不同濃度游離ALA的MRS譜線圖及所得的ALA標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖9為實(shí)施例1制得的AMSNs納米顆粒的ALA藥物釋放曲線。

圖10為實(shí)施例1制得的AMSNs納米顆粒瘤內(nèi)注入大鼠皮下腦膠質(zhì)瘤模型的MRS譜線圖。

圖11為實(shí)施例1制得的AMSNs納米顆粒靜脈注射入大鼠原位腦膠質(zhì)瘤模型的MRS譜線圖及注射后腦膠質(zhì)瘤的生物電鏡圖及能譜圖。

圖12為實(shí)施例1制得ANG-HMSNs及AMSNs納米顆粒分別與BCEC及C6細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)后的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)圖。

圖13為實(shí)施例1制得的ANG-HMSNs及AMSNs納米顆粒與C6細(xì)胞共培養(yǎng)后的MRS譜線圖。

圖14為實(shí)施例1制得的ANG-HMSNs納米顆粒連接FITC后與C6細(xì)胞共培養(yǎng)2小時(shí)后共聚焦所觀察到的細(xì)胞吞噬納米顆粒的情況。

圖15為昆明鼠注射入所制得的AMSNs納米顆粒后的體重變化情況結(jié)果圖。

圖16為昆明鼠注射入所制得的AMSNs納米顆粒后，心、肝、脾、肺、腎、腦等各器官的組織切片圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和下述實(shí)施方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，應(yīng)理解，附圖及下述實(shí)施方式僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容作出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。另外，下述工藝參數(shù)中的具體配比、時(shí)間、溫度等也僅是示例性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在上述限定的范圍內(nèi)選擇合適的值。

實(shí)施例1

將100mg實(shí)心SiO₂顆粒超聲分散到20mL去離子水中，備用；將100mg C₁₆TAB，30mL去離子水，30mL乙醇及0.55mL氨水預(yù)先配成混合溶液，向其中滴加實(shí)心SiO₂的水溶液，攪拌0.5h。隨后，迅速向其中加入0.25mL TEOS，繼續(xù)攪拌6h；產(chǎn)物通過離心收集后，分散到Na₂CO₃的水溶液中(0.848gNa₂CO₃+20mL水)，并在50℃水浴條件下攪拌10h以刻蝕掉中間的實(shí)心SiO₂層，得到HMSNs；產(chǎn)物離心收集后，用大量的去離子水及酒精反復(fù)洗滌，分散到鹽酸的乙醇溶液中(50mL鹽酸+500mL乙醇)78℃回流12h，回流重復(fù)4次，最后回流結(jié)束后用大量的去離子水及酒精反復(fù)洗滌，離心收集材料分散至水中，即得HMSNs水溶液；取50mg HMSNs分散至50mL乙醇中，再加入100μLAPTES于80℃回流4小時(shí)，產(chǎn)物用離心收集即得NH₂-HMSNs。取NH₂-HMSNs 10mg，EDC 37mg，NHS 48mg，ANG 10mg，分散在20mL去離子水中，常溫?cái)嚢?4h，即獲得ANG-HMSNs；取上述ANG-HMSNs 50mg，加入50mM ALA水溶液中，常溫下攪拌48h，離心收集材料，即得AMSNs。圖1顯示了所制得的HMSNs納米顆粒分散于去離子水中的透射電鏡(TEM)照片，表明HMSNs的成功合成，粒徑分布均一且具有良好的單分散性；圖2顯示了所制得的HMSNs納米顆粒的粒徑分布圖，所合成的HMSNs納米顆粒粒徑約168nm；圖3顯示了所制得的HMSNs納米顆粒的N₂吸附試驗(yàn)結(jié)果，所合成的HMSNs比表面為880m²/g，孔徑為4.2nm，孔容為1.16cm²/g；圖4顯示了制得的HMSNs、NH₂-HMSNs及ANG-HMSNs納米顆粒水溶液的數(shù)碼照片，均未見明顯沉淀，分散性良好；圖5顯示了制得的HMSNs、NH₂-HMSNs及ANG-HMSNs納米顆粒水溶液的DLS水和動(dòng)力學(xué)直徑圖，證實(shí)NH₂-HMSNs及ANG-HMSNs納米顆粒成功制備；圖6顯示了制得的HMSNs、NH₂-HMSNs及ANG-HMSNs納米顆粒水溶液的zeta電位圖，證實(shí)NH₂-HMSNs及ANG-HMSNs納米顆粒成功制備；圖7顯示了制得的HMSNs、ANG-HMSNs及AMSNs納米顆粒的FT-IR圖，證實(shí)ANG-HMSNs納米顆粒的成功制備；圖8顯示了不同濃度游離ALA的MRS譜線圖及所得的ALA標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖9顯示了制得的AMSNs納米顆粒的ALA藥物釋放曲線，表明AMSNs納米顆粒藥物釋放量較少。

實(shí)施例2 醫(yī)用成像應(yīng)用效果實(shí)驗(yàn)

1、MRS成像

1.1實(shí)驗(yàn)材料及儀器：

采用實(shí)施例1制得的AMSNs納米顆粒；

MRS成像檢測(cè)儀器型號(hào)：7.0T小動(dòng)物磁共振成像系統(tǒng)Agilent Technologies Inc，U.S.A.

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性Sprague-Dawley大鼠皮下膠質(zhì)瘤模型及原位腦膠質(zhì)瘤模型，平均年齡2個(gè)月，平均體重200g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司；

1.3實(shí)驗(yàn)方法：SD大鼠用水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉后，采用實(shí)施例1制得的AMSNs水溶液10mg/mL，40mg/kg通過瘤內(nèi)注射至皮下腦膠質(zhì)瘤內(nèi)，尾靜脈注射至原位腦膠質(zhì)瘤模型鼠內(nèi)，行MRS成像，并在不同的時(shí)間點(diǎn)觀察感興趣區(qū)波譜變化情況；

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：制得的AMSNs納米顆粒瘤內(nèi)注入大鼠皮下腦膠質(zhì)瘤模型的MRS譜線圖，可見打藥后膠質(zhì)瘤區(qū)域MRS顯著的AMSNs峰出現(xiàn)，在2.562ppm及3.177ppm，表明AMSMs可用于體內(nèi)MRS成像(如圖10所示)，圖11顯示了制得的AMSNs納米顆粒靜脈注射入大鼠原位腦膠質(zhì)瘤模型的MRS譜線圖及注射后腦膠質(zhì)瘤的生物電鏡圖及能譜圖，顯示注藥后正常腦區(qū)域未見明顯的AMSNs峰，而膠質(zhì)瘤區(qū)域可見到AMSNs峰于2.562ppm(用藥前膠質(zhì)瘤區(qū)域的波譜2.562ppm位置沒有峰)，表明AMSNs可穿透血腦屏障靶向膠質(zhì)瘤，可用作腦內(nèi)原位膠質(zhì)瘤的特異性MRS造影劑。

實(shí)施例3 毒性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)

1.體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

1.1實(shí)驗(yàn)材料：采用實(shí)施例1所制得的ANG-HMSNs及AMSNs納米顆粒；

1.2實(shí)驗(yàn)方法：采用MTT(3-(4，5-dimethylthiazol-2-y1)-2，5-diphenyltetrazolium bromide)方法評(píng)價(jià)細(xì)胞存活率，具體實(shí)驗(yàn)方法為：(1)接種細(xì)胞：用含10％胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔10⁵-10⁶個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積100微升(2)培養(yǎng)細(xì)胞：加入納米顆粒后與細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)后，每孔加MTT溶液(5mg/ml，用PBS配制，pH＝7.4)50微升，繼續(xù)共培養(yǎng)4h，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。(3)定量：每孔加150微升DMSO，脫色搖床振蕩10min，使結(jié)晶物充分融解，選擇570nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果；

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：制得ANG-HMSNs及AMSNs納米顆粒在1000μg/mL的較高濃度下，共培養(yǎng)24小時(shí)后細(xì)胞仍有高達(dá)85％以上的存活率；表明ANG-HMSNs及AMSNs納米顆粒的低細(xì)胞毒性(如圖12所示)；MRS譜線圖表明僅有AMSNs與細(xì)胞共培養(yǎng)后才可表現(xiàn)出特征峰(如圖13所示)；細(xì)胞吞噬納米顆粒的結(jié)果表明AMSNs可被C6細(xì)胞吞噬(如圖14所示)；

2.體內(nèi)組織毒性實(shí)驗(yàn)

2.1實(shí)驗(yàn)材料采用實(shí)施例1制得的AMSNs納米顆粒；

2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明小鼠，平均體重20g，5～6周齡，購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房；

2.2.3實(shí)驗(yàn)方法：尾靜脈注射AMSNs納米顆粒水溶液(劑量為40mg/kg)；尾靜脈注射所述AMSNs納米顆粒的生理鹽水溶液(劑量為40mg/kg)，通過常規(guī)的H&E染色觀察注射前、注射30天后的組織切片；并記錄小鼠體重變化情況；

圖15顯示了昆明鼠注射入所制得的AMSNs納米顆粒后的體重變化情況結(jié)果圖；圖16顯示了昆明鼠注射入所制得的AMSNs納米顆粒后，心、肝、脾、肺、腎、腦等各器官的組織切片圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：昆明鼠在注射nCAs前后，心肝脾肺腎和腦各器官均無明顯毒性反應(yīng)，表明該材料在活體水平的低毒性。