本發(fā)明屬于材料科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種電壓-刺激響應(yīng)型智能納米容器及其制備方法。

背景技術(shù)：

近年來，刺激響應(yīng)型智能納米容器在控制藥物運輸和基因傳遞等領(lǐng)域受到了廣泛的關(guān)注。作為一個智能納米容器具有能在外界的某種刺激信號下做出反饋調(diào)節(jié)的能力，并且可以根據(jù)刺激信號的性質(zhì)和強(qiáng)弱調(diào)整藥物釋放的時間、空間和劑量。智能給藥系統(tǒng)能實現(xiàn)對藥物的有效控制主要是由于載體中的分子組件在外界條件刺激下發(fā)生了水解、質(zhì)子化、構(gòu)象、親水性和溶解度等性質(zhì)變化。針對智能藥物載體的刺激信號主要包括內(nèi)源性刺激(pH值、氧化還原物質(zhì)和酶濃度等)和外源性刺激(溫度、光、磁場、超聲和電壓等)。具有緩釋、控釋和靶向釋放功能的藥物傳遞系統(tǒng)可以提高藥物生物利用度并降低其毒副作用，然而這些功能往往需要借助智能載體才能實現(xiàn)。具有自組裝能力的超分子實體是構(gòu)筑具有特殊性能的智能藥物載體的理想砌塊。

在刺激響應(yīng)方面，由于人類機(jī)體是一個十分復(fù)雜的體系，各個器官和組織會相互影響，內(nèi)源性響應(yīng)系統(tǒng)較難得到有效控制，而相對來說外源性響應(yīng)系統(tǒng)更具有發(fā)展?jié)摿Α：笳哂捎诳刹倏匦愿鼜?qiáng)，通過外加刺激信號的“開-關(guān)”可以更有效的控制藥物釋放的時間、空間和劑量。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種響應(yīng)過程快、靈敏度高、操作性好的電壓-刺激響應(yīng)型智能納米容器及其制備方法。

實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)解決方案為：一種電壓-刺激響應(yīng)型智能納米容器，其結(jié)構(gòu)如下：

一種電壓-刺激響應(yīng)型智能納米容器的制備方法，步驟如下：

步驟1，將介孔二氧化硅微球與含炔基的硅烷偶聯(lián)劑在干燥過的甲苯中進(jìn)行脫醇反應(yīng)；

步驟2，將2-(O-炔丙基)-β-環(huán)糊精和疊氮甲基二茂鐵溶于無水N,N-二甲基甲酰胺中進(jìn)行點擊化學(xué)反應(yīng)生成五元環(huán)；

步驟3，將三苯基膦和碘溶于干燥后的N,N-二甲基甲酰胺中，緩慢加熱到30～80℃時將步驟2獲得的產(chǎn)物加入到溶液中并氮氣保護(hù)，升溫到30～80℃攪拌反應(yīng)12～20小時，反應(yīng)結(jié)束后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去N,N-二甲基甲酰胺，再在冰浴中加入甲醇鈉的甲醇溶液，然后倒入甲醇中得沉淀，真空干燥得產(chǎn)物；

步驟4，步驟3獲得的產(chǎn)物與疊氮化鈉溶在N,N-二甲基甲酰胺中，升溫到50～80℃攪拌反應(yīng)12～20小時并氮氣保護(hù)，反應(yīng)結(jié)束后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去N,N-二甲基甲酰胺，加入水得到沉淀，離心洗滌得到產(chǎn)物；

步驟5，將步驟4獲得的產(chǎn)物與步驟1獲得的產(chǎn)物在干燥后的N,N-二甲基甲酰胺中進(jìn)行點擊化學(xué)反應(yīng)生成五元環(huán)；

步驟6，步驟5獲得的產(chǎn)物經(jīng)真空干燥后分散在含有吸附分子的NaH₂PO₄/Na₂HPO₄的緩沖溶液中，得到所述的電壓-刺激響應(yīng)智能納米容器。

優(yōu)選地，步驟1中，所述的介孔二氧化硅微球為MCM-41；所述的含炔基的硅烷偶聯(lián)劑為丙-2-炔-1-基(3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基)氨基甲酸叔丁酯。

優(yōu)選地，步驟1中，所述的脫醇反應(yīng)在氮氣保護(hù)下進(jìn)行，其中介孔二氧化硅微球與含炔基的硅烷偶聯(lián)劑的質(zhì)量比為(1～2):1，含炔基的硅烷偶聯(lián)劑在甲苯中的濃度為6～20μg/mL。

優(yōu)選地，步驟2中，所述的點擊化反應(yīng)所用的催化劑為三乙氧基膦碘化亞銅，反應(yīng)溫度為90～120℃，反應(yīng)時間為3-5小時。

優(yōu)選地，步驟5中，所述的點擊化反應(yīng)所用的催化劑為三乙氧基膦碘化亞銅，反應(yīng)溫度為90～120℃，反應(yīng)時間為12-24小時。

優(yōu)選地，步驟6中，所述的吸附分子為吉西他濱，NaH₂PO₄/Na₂HPO₄緩沖溶液中的pH＝7.4。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其顯著優(yōu)點在于：(1)具有操作簡單方便，快速響應(yīng)的優(yōu)點；(2)具有響應(yīng)過程簡單、靈敏度高、應(yīng)用范圍廣泛的優(yōu)點；(3)超分子閥 門具有生物相溶性，無毒，降解，無酸性分解物產(chǎn)生的優(yōu)點；(4)可用于藥物釋放領(lǐng)域。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述電壓-刺激響應(yīng)智能納米容器的釋放效果原理圖。

圖2為本發(fā)明所述電壓-刺激響應(yīng)智能納米容器在紫外光譜儀下測試的釋放曲線。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖及具體實施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。

結(jié)合圖1，本發(fā)明電壓-刺激響應(yīng)型智能納米容器，具有以下結(jié)構(gòu)：

其中，A表示中空球體，即為介孔二氧化硅納米微球，B表示吸附分子，即為藥物分子吉西他濱。

本發(fā)明的原理是：β-環(huán)糊精是一類典型的超分子主體單元，它可以和二茂鐵或其衍生物發(fā)生自發(fā)的主-客體嵌套作用，形成1∶1的包合物，這種包絡(luò)作用可以通過電壓的方式解除。即通入正電壓時，二茂鐵分子被氧化后產(chǎn)生一個單位的正電荷，從環(huán)糊精空腔中解離出來；而當(dāng)施加負(fù)電壓時，二茂鐵分子又會被還原，再次進(jìn)入環(huán)糊精的空腔中。

本發(fā)明電壓-刺激響應(yīng)型智能納米容器，采用下述方法制備所得，步驟如下：

步驟1，制備介孔二氧化硅微球；所述介孔二氧化硅微球為MCM-41。

步驟2，將干燥后介孔二氧化硅微球與含炔基的硅烷偶聯(lián)劑在干燥過的甲苯中進(jìn)行脫醇反應(yīng)；所述含炔基的硅烷偶聯(lián)劑為丙-2-炔-1-基(3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基)氨基甲酸叔丁酯。所述脫醇反應(yīng)在氮氣保護(hù)下進(jìn)行，其中介孔二氧化硅納米顆粒與含炔基的硅烷偶聯(lián)劑的質(zhì)量比為(1～2):1，含炔基的硅烷偶聯(lián)劑在甲苯中的濃度為6～20μg/mL。

步驟3，制備2-(O-炔丙基)-β-環(huán)糊精：將β-環(huán)糊精和氫化鋰溶于二甲亞砜中，在常溫下氮氣保護(hù)并攪拌反應(yīng)24小時，然后加入炔丙基溴化鎂和碘化鋰，避光反應(yīng)5小時，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入丙酮溶液中，減壓抽濾得到粗產(chǎn)物，用乙腈、水、氨水對粗產(chǎn)物進(jìn)行柱層析分離得到產(chǎn)物；所述β-環(huán)糊精與炔丙基溴化鎂的摩爾比為1:1。

步驟4，制備疊氮甲基二茂鐵：將二茂鐵甲醇與疊氮鈉溶于冰醋酸溶液中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入二氯甲烷，先后用飽和碳酸氫鈉和水洗滌，最后用無 水硫酸鈉干燥，過濾掉無水硫酸鈉進(jìn)行真空干燥得到疊氮甲基二茂鐵；所述反應(yīng)在氮氣保護(hù)下進(jìn)行，反應(yīng)溫度為50～70℃，反應(yīng)時間為3～5小時。

步驟5，2-(O-炔丙基)-β-環(huán)糊精和疊氮甲基二茂鐵溶于無水N,N-二甲基甲酰胺中進(jìn)行點擊化學(xué)反應(yīng)生成五元環(huán)；所述點擊化反應(yīng)所用的催化劑為三乙氧基膦碘化亞銅，反應(yīng)溫度為90～120℃，反應(yīng)時間為3-5小時。

步驟6，將三苯基膦和碘溶于干燥后的N,N-二甲基甲酰胺中，緩慢加熱到50～100℃時將步驟5獲得的產(chǎn)物加入到溶液中并氮氣保護(hù)，升溫到50～120℃攪拌反應(yīng)10～24小時，反應(yīng)結(jié)束后，將N,N-二甲基甲酰胺旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)出去，再在冰浴中加入甲醇鈉的甲醇溶液，然后倒入甲醇中得沉淀，真空干燥得產(chǎn)物。

步驟7，步驟6獲得的產(chǎn)物與疊氮化鈉溶在N,N-二甲基甲酰胺中，升溫到50～120℃攪拌反應(yīng)10～24小時并氮氣保護(hù)，反應(yīng)結(jié)束后，將N,N-二甲基甲酰胺旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)出去，再加入一定量的水得到沉淀，離心洗滌得到產(chǎn)物。

步驟8，將步驟7獲得的產(chǎn)物與步驟2獲得的產(chǎn)物在干燥后的N,N-二甲基甲酰胺中進(jìn)行點擊化學(xué)反應(yīng)生成五元環(huán)；所述點擊化反應(yīng)所用的催化劑為三乙氧基膦碘化亞銅，反應(yīng)溫度為90～120℃，反應(yīng)時間為12-24小時。

步驟9，步驟8獲得的產(chǎn)物經(jīng)真空干燥后分散在含有吸附分子的NaH₂PO₄/Na₂HPO₄的緩沖溶液中，得到最終產(chǎn)品電壓-刺激響應(yīng)智能納米容器；所述吸附分子為吉西他濱，且NaH₂PO₄/Na₂HPO₄緩沖溶液的pH＝7.4，濃度為5～10mg/ml。

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。

實施例1

本發(fā)明電壓-刺激響應(yīng)型智能納米容器的制備方法，步驟如下：

步驟1，制備介孔二氧化硅微球MCM-41，并將所得的介孔二氧化硅微球真空干燥；介孔二氧化硅微球MCM-41的制備過程如下：

將1.0g丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨(AETAC)溶解于390ml的去離子水中，加入40g苯乙烯，室溫下機(jī)械攪拌30min,隨后將溫度升至90℃，N₂脫氣30min后，加入2,2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(V-50，10wt％,10ml)，在N₂保護(hù)，90℃反應(yīng)24h,得到PS球。

將0.8g十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，29g H₂O，12g乙醇，1ml氨水混合成均相溶液，室溫劇烈攪拌下，逐滴加入10gPS(～9％)。滴加完畢后，超聲振蕩15min， 隨后，用注射泵向混合液中滴加入4.0g原硅酸四乙酯(TEOS)，滴加完后，在室溫下反應(yīng)48h。反應(yīng)結(jié)束后，離心分離，收集固體，乙醇清洗三次，固體真空干燥。然后，將得到的固體以3℃/min的升溫速率在550℃下煅燒8h以去除介孔劑CTAB。將得到的0.5g固體樣品分散在含有4g HCl的無水乙醇中，50℃下反應(yīng)5h，反應(yīng)后離心分離，固體分散在50ml的四氫呋喃(THF)中反應(yīng)過夜，最后離心分離得到固體，用甲醇清洗數(shù)次，50℃真空干燥得到介孔二氧化硅微球(MSNs)。

步驟2，將200mg干燥后介孔二氧化硅微球與100ul含炔基的硅烷偶聯(lián)劑APTS在15ml干燥過的甲苯中進(jìn)行脫醇反應(yīng)；所述含炔基的硅烷偶聯(lián)劑為丙-2-炔-1-基(3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基)氨基甲酸叔丁酯。所述脫醇反應(yīng)在氮氣保護(hù)下進(jìn)行，其中介孔二氧化硅納米顆粒與含炔基的硅烷偶聯(lián)劑的質(zhì)量比為2:1，含炔基的硅烷偶聯(lián)劑在甲苯中的濃度為6.67μg/mL。

步驟3，制備2-(O-炔丙基)-β-環(huán)糊精：將0.881mmolβ-環(huán)糊精和1.322mmol氫化鋰溶于二甲亞砜中，在常溫下氮氣保護(hù)并攪拌反應(yīng)12～24小時，然后加入0.881mmol炔丙基溴和少量碘化鋰，避光反應(yīng)5～12小時，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入丙酮溶液中，減壓抽濾得到粗產(chǎn)物，用乙腈、水、氨水對粗產(chǎn)物進(jìn)行柱層析分離得到產(chǎn)物；所述β-環(huán)糊精與炔丙基溴化鎂的摩爾比為1:1。

步驟4，制備疊氮甲基二茂鐵：將0.231mmol二茂鐵甲醇與1.39mmol疊氮鈉溶于3ml冰醋酸溶液中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入二氯甲烷溶液中，先后用飽和碳酸氫鈉和水洗滌，最后用無水硫酸鈉干燥，過濾掉無水硫酸鈉進(jìn)行真空干燥得到疊氮甲基二茂鐵；所述反應(yīng)在氮氣保護(hù)下進(jìn)行，反應(yīng)溫度為50～70℃，反應(yīng)時間為3～5小時。

步驟5，將300mg 2-(O-炔丙基)-β-環(huán)糊精和68mg疊氮甲基二茂鐵溶于10ml無水N,N-二甲基甲酰胺中進(jìn)行點擊化學(xué)反應(yīng)生成五元環(huán)；所述點擊化反應(yīng)所用的催化劑為三乙氧基膦碘化亞銅，反應(yīng)溫度為90～120℃，反應(yīng)時間為3-5小時。

步驟6，將2.308g三苯基膦和2.234g碘溶于9ml干燥后的N,N-二甲基甲酰胺中，緩慢加熱到50℃時將0.622g步驟5獲得的產(chǎn)物加入到溶液中并氮氣保護(hù)，升溫到70℃攪拌反應(yīng)18小時，反應(yīng)結(jié)束后，將N,N-二甲基甲酰胺旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)出去，再在冰浴中加入甲醇鈉的甲醇溶液，然后倒入甲醇中得沉淀，真空干燥得產(chǎn)物。

步驟7，將0.334g步驟6獲得的產(chǎn)物與0.2g疊氮化鈉溶在5mlN,N-二甲基甲酰 胺中，升溫到60℃攪拌反應(yīng)20小時并氮氣保護(hù)，反應(yīng)結(jié)束后，將N,N-二甲基甲酰胺旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)出去，再加入50ml水得到沉淀，離心洗滌得到產(chǎn)物。

步驟8，將步驟7獲得的產(chǎn)物與步驟2獲得的產(chǎn)物在干燥后的N,N-二甲基甲酰胺中進(jìn)行點擊化學(xué)反應(yīng)生成五元環(huán)；所述點擊化反應(yīng)所用的催化劑為三乙氧基膦碘化亞銅，反應(yīng)溫度為90～120℃，反應(yīng)時間為24小時。

步驟9，步驟8獲得的產(chǎn)物經(jīng)真空干燥后分散在含有吸附分子的NaH₂PO₄/Na₂HPO₄的緩沖溶液中，得到所述的電壓-刺激響應(yīng)智能納米容器；所述吸附分子為吉西他濱，且NaH₂PO₄/Na₂HPO₄緩沖溶液的pH＝7.4，濃度為5mg/ml。

吉西他濱的可控性釋放

為了研究在中性下中空介孔二氧化硅納米容器的釋放效果，本專利進(jìn)行了如下實驗：通過紫外光譜在267nm處檢測納米容器的釋放曲線：準(zhǔn)確稱取5mg的吉西他濱負(fù)載，將步驟9所得的固體置于透析膜中，再將帶有產(chǎn)物的透析膜放在頂部密封的比色皿中，這樣可阻止固體分散在溶液中。準(zhǔn)確量取4ml PBS＝7的緩沖溶液加入上述比色皿中，保證透析膜中的固體能夠被溶液完全浸濕。通過接入正電壓，來實現(xiàn)納米容器中吉西他濱分子的釋放，最后得到吉西他濱濃度與時間的關(guān)系曲線圖2。

實施例2

本發(fā)明電壓-刺激響應(yīng)型智能納米容器的制備方法，步驟如下：

步驟1，制備介孔二氧化硅微球MCM-41，并將所得的介孔二氧化硅微球真空干燥；介孔二氧化硅微球MCM-41的制備過程如實施例1的步驟1。

步驟2，將200mg干燥后介孔二氧化硅微球與80ul含炔基的硅烷偶聯(lián)劑APTS在10ml干燥過的甲苯中進(jìn)行脫醇反應(yīng)；所述含炔基的硅烷偶聯(lián)劑為丙-2-炔-1-基(3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基)氨基甲酸叔丁酯。所述脫醇反應(yīng)在氮氣保護(hù)下進(jìn)行，其中介孔二氧化硅納米顆粒與含炔基的硅烷偶聯(lián)劑的質(zhì)量比為2.5:1，含炔基的硅烷偶聯(lián)劑在甲苯中的濃度為8μg/mL。

步驟3，將300mg 2-(O-炔丙基)-β-環(huán)糊精和68mg疊氮甲基二茂鐵溶于10ml無水N,N-二甲基甲酰胺中進(jìn)行點擊化學(xué)反應(yīng)生成五元環(huán)；所述點擊化反應(yīng)所用的催化劑為三乙氧基膦碘化亞銅，反應(yīng)溫度為90～120℃，反應(yīng)時間為3-5小時。

步驟4，將2.308g三苯基膦和2.234g碘溶于9ml干燥后的N,N-二甲基甲酰胺中，緩慢加熱到50℃時將0.622g步驟5獲得的產(chǎn)物加入到溶液中并氮氣保護(hù)，升溫到 50～120℃攪拌反應(yīng)12～24小時，反應(yīng)結(jié)束后，將N,N-二甲基甲酰胺旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)出去，再在冰浴中加入甲醇鈉的甲醇溶液，然后倒入甲醇中得沉淀，真空干燥得產(chǎn)物。

步驟5，將0.334g步驟6獲得的產(chǎn)物與0.2g疊氮化鈉溶在5mlN,N-二甲基甲酰胺中，升溫到60～120℃攪拌反應(yīng)12～24小時并氮氣保護(hù)，反應(yīng)結(jié)束后，將N,N-二甲基甲酰胺旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)出,，再加入50ml水得到沉淀，離心洗滌得到產(chǎn)物。

步驟6，將步驟7獲得的產(chǎn)物與步驟2獲得的產(chǎn)物在干燥后的N,N-二甲基甲酰胺中進(jìn)行點擊化學(xué)反應(yīng)生成五元環(huán)；所述點擊化反應(yīng)所用的催化劑為三乙氧基膦碘化亞銅，反應(yīng)溫度為80～120℃，反應(yīng)時間為10～24小時。

步驟7，步驟8獲得的產(chǎn)物經(jīng)真空干燥后分散在含有吸附分子的NaH₂PO₄/Na₂HPO₄的緩沖溶液中，得到所述的電壓-刺激響應(yīng)智能納米容器；所述吸附分子為吉西他濱，且NaH₂PO₄/Na₂HPO₄緩沖溶液的pH＝7.4，濃度為10mg/ml。

如圖2，表示組裝后的智能納米容器在不同情況下的釋放效果，a表示未加正電壓情況下的釋放情況，b表示智能納米容器施加正電壓后的釋放效果。

在未施加正電壓情況下，二茂鐵屬于被環(huán)糊精包結(jié)的狀態(tài)，這樣小分子就無法從里面跑出來；當(dāng)施加正電壓后，由于二茂鐵被氧化，導(dǎo)致分子間作用力改變，最后使得二茂鐵被打開，離開環(huán)糊精，從而小分子可以通過環(huán)糊精通道釋放出去，達(dá)到控制開關(guān)的作用。