本發(fā)明涉及醫(yī)用納米材料領(lǐng)域，尤其涉及一種用于體內(nèi)細(xì)菌感染的診療一體化納米探針及其制備方法。

背景技術(shù)：

細(xì)菌是一類重要的病原體，它們侵入機(jī)體后會分泌產(chǎn)生大量的生物毒素，從而破壞機(jī)體的結(jié)構(gòu)和功能，造成宿主感染。近年來，由于抗生素的濫用，抗藥性細(xì)菌(如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA)大量出現(xiàn)，病原細(xì)菌引起的感染疾病已成為危害人類身體健康的重要?dú)⑹?，引起了全球性的廣泛關(guān)注。因此為開展細(xì)菌感染疾病的早期診斷與治療，研究病原細(xì)菌的快速檢測和治療技術(shù)具有非常重要的意義。

目前，臨床上主要通過對組織或血液樣本進(jìn)行凃板培養(yǎng)，然后根據(jù)長出的細(xì)菌菌落的形態(tài)及生理生化反應(yīng)特征來完成細(xì)菌感染的分析診斷。然而這種基于細(xì)菌培養(yǎng)法的診斷策略耗時較長(幾天時間)、操作繁瑣，且只能用于體外環(huán)境。因此，如何實(shí)現(xiàn)對體內(nèi)細(xì)菌感染的快速、非侵入檢測已成為近年來的研究熱點(diǎn)，這其中尤以近紅外熒光成像技術(shù)得到了廣泛關(guān)注，且一系列近紅外熒光探針已被成功用于體內(nèi)細(xì)菌感染的分析診斷。然而，這些探針存在著諸如檢測靈敏度低、準(zhǔn)確性差、應(yīng)用面較窄等缺點(diǎn)。另外，如何實(shí)現(xiàn)對體內(nèi)細(xì)菌感染診斷同時的有效治療，尤其對抗藥性細(xì)菌的有效診斷和殺滅是如今細(xì)菌感染研究的難點(diǎn)。因此，構(gòu)建一種針對體內(nèi)細(xì)菌感染的診療一體化探針具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。

有鑒于上述的缺陷，本設(shè)計人，積極加以研究創(chuàng)新，以期創(chuàng)設(shè)一種新型的用于體內(nèi)細(xì)菌感染的診療一體化納米探針及其制備方法，使其更具有產(chǎn)業(yè)上的利用價值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種用于體內(nèi)細(xì)菌感染的診療一體化納米探針及其制備方法，本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)對體內(nèi)細(xì)菌感染的快速、非侵入、高靈敏度診斷和高效治療。

本發(fā)明的一種用于體內(nèi)細(xì)菌感染的診療一體化納米探針，包括硅納米顆粒，硅納米顆粒外包裹有聚陽離子電解質(zhì)層，聚陽離子電解質(zhì)層外側(cè)修飾有近紅外有機(jī)熒光染料，且交聯(lián)有聚乙二醇和細(xì)菌靶向分子。

進(jìn)一步的，近紅外有機(jī)熒光染料為碳菁類熒光染料。

進(jìn)一步的，硅納米顆粒的粒徑為60-80nm，這一范圍的納米顆粒不宜被血液清除，一定程度上延長了其體內(nèi)滯留時間。

進(jìn)一步的，硅納米顆粒為實(shí)心二氧化硅納米顆粒或介孔二氧化硅納米顆粒。

進(jìn)一步的，聚陽離子電解質(zhì)選自聚丙烯氯化銨、聚二烯丙基二甲基氯化銨或聚乙烯亞胺中的一種。

進(jìn)一步的，聚陽離子電解質(zhì)的分子量為10000-20000g/mol，這一分子量范圍的聚電解質(zhì)修飾一方面既可以增強(qiáng)硅納米顆粒的穩(wěn)定性，另一方面在細(xì)菌存在條件下也易于從硅納米顆粒表面脫落。

進(jìn)一步的，近紅外有機(jī)熒光染料選自吲哚菁綠或Cypate。

進(jìn)一步的，聚乙二醇的分子量為3000-5000g/mol，這一分子量范圍的聚乙二醇修飾可以增強(qiáng)納米探針在體內(nèi)的穩(wěn)定性和滯留時間。

進(jìn)一步的，細(xì)菌靶向分子選自萬古霉素和/或細(xì)菌特異性抗體，細(xì)菌特異性抗體為大腸桿菌K99抗體或耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA抗體。

本發(fā)明還公開了一種用于體內(nèi)細(xì)菌感染的診療一體化納米探針的制備方法，包括以下步驟：

(1)制備粒徑在60-80nm的硅納米顆粒；

(2)將步驟(1)得到的硅納米顆粒加入到聚陽離子電解質(zhì)的鹽溶液中，攪拌反應(yīng)后得到聚陽離子電解質(zhì)包裹的硅納米顆粒；

(3)將近紅外有機(jī)熒光染料溶于有機(jī)溶劑中，加入共價偶聯(lián)劑進(jìn)行活化，再加入步驟(2)得到的聚陽離子電解質(zhì)包裹的硅納米顆粒，攪拌反應(yīng)后得到表面修飾有近紅外有機(jī)熒光染料的硅納米顆粒；

(4)將聚乙二醇和細(xì)菌靶向分子進(jìn)行活化后與步驟(3)得到的硅納米顆粒表面的聚陽離子電解質(zhì)交聯(lián)，得到用于體內(nèi)細(xì)菌感染的診療一體化納米探針。

進(jìn)一步的，在步驟(3)中，有機(jī)溶劑為N,N-二甲基甲酰胺、氯仿或二甲亞砜中的一種。

進(jìn)一步的，在步驟(3)中，共價偶聯(lián)劑為EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)和NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)。

進(jìn)一步的，在步驟(3)中，攪拌反應(yīng)后進(jìn)行離心，水洗后將表面修飾有近紅外有機(jī)熒光染料的硅納米顆粒分散在水中或PBS緩沖液中。

進(jìn)一步的，在步驟(4)中，將聚丙烯酸溶于水中，加入EDC和NHS共價偶聯(lián)劑活化，再加入氨基-聚乙二醇和細(xì)菌靶向分子，攪拌反應(yīng)以將聚丙烯酸分子的羧基與氨基-聚乙二醇和細(xì)菌靶向分子的氨基反應(yīng)，再加入步驟(3)得到的硅納米顆粒和共價偶聯(lián)劑，以使聚丙烯酸與聚陽離子電解質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，從而將聚乙二醇和細(xì)菌靶向分子交聯(lián)到硅納米顆粒表面的聚陽離子電解質(zhì)上。

進(jìn)一步的，本發(fā)明的診療一體化納米探針對體內(nèi)細(xì)菌感染進(jìn)行近紅外熒光成像診斷和光熱治療。

進(jìn)一步的，診療一體化納米探針在無細(xì)菌情況下發(fā)生熒光淬滅，在細(xì)菌存在時，硅納米顆粒外的聚陽離子電解質(zhì)脫落，從而使得其熒光恢復(fù)，最終實(shí)現(xiàn)對體內(nèi)細(xì)菌感染的高靈敏度診斷。

進(jìn)一步的，進(jìn)行光熱治療時，使用近紅外激光器對細(xì)菌感染部位照射以使感染部位局部溫度快速升高，殺滅細(xì)菌。

本發(fā)明在帶有負(fù)電的硅納米顆粒表面包裹帶正電的聚陽離子電解質(zhì)層，二者之間具有靜電相互作用，聚陽離子電解質(zhì)層外部修飾有疏水性的有機(jī)熒光染料分子，由于疏水性有機(jī)熒光染料分子在硅納米顆粒表面的聚集，此納米探針的熒光在正常情況下是淬滅的。在細(xì)菌存在的情況下，由于有機(jī)熒光染料外層的細(xì)菌靶向分子與細(xì)菌發(fā)生相互作用，該相互作用力強(qiáng)于上述硅納米顆粒和聚陽離子電解質(zhì)之間的靜電相互作用力，因此硅納米顆粒表面的聚電解質(zhì)層會發(fā)生脫落，有機(jī)熒光染料分子間的距離加大，從而使得其熒光恢復(fù)，最終可實(shí)現(xiàn)對體內(nèi)細(xì)菌感染的高靈敏度診斷；此外，由于本發(fā)明使用的碳菁類染料除近紅外熒光外還具有光熱轉(zhuǎn)換效應(yīng)，因此通過使用近紅外激光器對細(xì)菌感染部位照射，可以使感染部位局部溫度快速升高，從而在熒光診斷的同時實(shí)現(xiàn)對細(xì)菌感染的高效光熱治療。

借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)：

相比于已經(jīng)報道過的針對細(xì)菌感染的近紅外熒光探針，本發(fā)明所制備的納米探針具有檢測靈敏度高、生物相容性好、檢測準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)；另外本發(fā)明所制備的納米探針在對細(xì)菌感染診斷的同時，還可以實(shí)現(xiàn)對其的高效光熱治療，因此可以作為一種診療一體化探針實(shí)現(xiàn)對體內(nèi)細(xì)菌感染的快速、非侵入、高靈敏度診斷和高效治療。

上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說明書的內(nèi)容予以實(shí)施，以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說明如后。

附圖說明

圖1是本發(fā)明細(xì)菌感染診療一體化納米探針的透射電鏡圖；

圖2是本發(fā)明細(xì)菌感染診療一體化納米探針的紫外吸收圖；

圖3是本發(fā)明細(xì)菌感染診療一體化納米探針的生物毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

圖4是本發(fā)明細(xì)菌感染診療一體化納米探針的光熱升溫實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

圖5是本發(fā)明本發(fā)明細(xì)菌感染診療一體化納米探針對不同濃度MRSA細(xì)菌感染的小鼠的熒光成像圖；

圖6是本發(fā)明細(xì)菌感染診療一體化納米探針在小鼠體內(nèi)的臟器分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

圖7是本發(fā)明細(xì)菌感染診療一體化納米探針對小鼠體內(nèi)細(xì)菌感染進(jìn)行光熱治療的結(jié)果圖；

圖8是本發(fā)明細(xì)菌感染診療一體化納米探針對體內(nèi)細(xì)菌感染進(jìn)行熒光成像診斷和光熱治療的過程示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

(1)硅納米顆粒的制備：取40mL無水乙醇，加入10mL水，混合均勻，然后加入900μL氨水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28-30％)，攪拌5min，然后在攪拌條件下加入600μL TEOS(正硅酸乙酯)，劇烈攪拌1h后，再次加入600μL TEOS，繼續(xù)劇烈攪拌24h。最后，將反應(yīng)液9500r/min離心25min，并用水和乙醇洗三次，最后分散在水里，得到實(shí)心的硅納米顆粒。

(2)聚電解質(zhì)包裹的硅納米顆粒的制備：取100mg的PAH(聚丙烯氯化銨，Mw＝15000g/mol)，將其溶于10mL 1mM的NaCl水溶液里，然后加入1mL步驟(1)中合成的硅納米顆粒，攪拌反應(yīng)3h。最后，將反應(yīng)液9500r/min離心25min，并用水洗三次，最后分散在水里，得到PAH聚電解質(zhì)包裹的硅納米顆粒的。

(3)熒光染料修飾的硅納米顆粒的制備：取1mg吲哚菁綠羧基衍生物(Cypate)溶于3mL DMF(N,N-二甲基甲酰胺)，然后加入共價偶聯(lián)劑0.5mg的EDC和0.6mg的NHS，活化30min，再加入1mL步驟(2)中合成的聚電解質(zhì)包裹的硅納米顆粒，繼續(xù)攪拌16h。最后，將反應(yīng)液9500r/min離心25min，并用水洗三次，最后分散在水里，得到熒光染料修飾的硅納米顆粒。

(4)細(xì)菌感染診療一體化納米探針的制備：取228.6μL PAA(聚丙烯酸，Mw＝15000g/mol)，溶解在1770μL水里，然后加入0.2045g EDC和0.2316g NHS，活化30min，再加入25mL的氨基-聚乙二醇(mPEG-NH₂，20mg/mL，Mw＝5000g/mol)和萬古霉素(0.084mg/mL)的混合水溶液，繼續(xù)攪拌反應(yīng)24h。然后將反應(yīng)液進(jìn)行透析純化，再加入0.3680g EDC和0.4168g NHS活化30min，再加入2mL步驟(3)中合成的熒光染料修飾的硅納米顆粒，繼續(xù)攪拌24h。最后，將反應(yīng)液9500r/min離心25min，并用水洗三次，得到細(xì)菌感染診療一體化納米探針。

圖1是本發(fā)明制備的細(xì)菌感染診療一體化納米探針的透射電鏡圖，從圖中可以看出該納米探針形貌規(guī)整，尺寸均一性比較好。

圖2是本發(fā)明合成的細(xì)菌感染診療一體化納米探針的紫外吸收圖，如圖所示，所制備的納米探針具有明顯的Cypate近紅外特征吸收峰。

將上述納米探針分散到水溶液(純水或PBS緩沖液)中對其進(jìn)行生物毒性實(shí)驗(yàn)測試，圖3是合成的細(xì)菌感染診療一體化納米探針的生物毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如圖3所示，在0-20μg/mL濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞活性接近100％，說明本發(fā)明的納米探針具有良好的生物相容性。

將上述納米探針分散到水溶液(純水或PBS緩沖液)中對其進(jìn)行光熱升溫實(shí)驗(yàn)，如圖4所示，在近紅外激光(808nm，1.5W/cm²)照射下，本發(fā)明制備的納米探針的溫度在300s內(nèi)可以快速升高，具有極強(qiáng)的光熱轉(zhuǎn)換效應(yīng)；且隨著納米探針濃度的增大，其升溫速率變快。

(5)體內(nèi)細(xì)菌感染的高靈敏度診斷：在小鼠右側(cè)尾部靠近大腿處皮下分別注射50μL(10⁵-10⁷CFU)的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA溶液，構(gòu)建小鼠細(xì)菌感染模型，16h后，將步驟(4)中合成的納米探針(以Cypate計算：7.5mg/kg)注入到小鼠尾靜脈中，4h后利用IVIS Lumina成像系統(tǒng)對感染的小鼠進(jìn)行全身熒光成像。

圖5是不同濃度MRSA細(xì)菌(10⁵-10⁷CFU)感染的小鼠熒光成像圖，如圖所示，所制備的納米探針可以在4小時內(nèi)在MRSA感染部位(箭頭處)快速聚集，并發(fā)出熒光，說明本發(fā)明制備的納米探針，可以實(shí)現(xiàn)對小鼠低濃度MRSA細(xì)菌感染的快速、準(zhǔn)確和高靈敏度檢測。對上述感染細(xì)菌后的小鼠臟器進(jìn)行熒光檢測，如圖6所示，第一行的器官從左到右依次為心、肝、脾，第二行從左到右依次為肺、腎、細(xì)菌感染部位，可以看到，圖中只有腎和細(xì)菌感染部位(箭頭所指)發(fā)出熒光，說明所制備的納米探針除了在細(xì)菌感染部位大量聚集外，在腎里也有聚集，其代謝主要以腎為主。

(6)體內(nèi)細(xì)菌感染的光熱治療：在小鼠右側(cè)尾部靠近大腿處皮下注射50μL(10⁷CFU)的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA溶液，構(gòu)建小鼠細(xì)菌感染模型，16h后，將步驟4中合成的納米探針(以Cypate計算：7.5mg/kg)注入到小鼠尾靜脈中，4h后用808nm，功率為1.5W/cm²的激光器對MRSA感染部位照射5min，然后每隔兩天記錄小鼠感染部位的潰爛情況。如圖7所示，與不進(jìn)行激光照射的對照組相比，經(jīng)納米探針光熱治療后，小鼠感染部位的潰爛得到了快速好轉(zhuǎn)，12天后得到了完全治愈，說明本發(fā)明制備的納米探針可以實(shí)現(xiàn)對體內(nèi)細(xì)菌感染的高效光熱治療。

實(shí)施例2

(1)硅納米顆粒的制備：取11.4mL無水乙醇，加入72mL水，混合均勻，然后加入2.9g CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)和625μL氨水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28-30％)，60℃攪拌30min，然后在攪拌條件下加入7.3mL TEOS(正硅酸乙酯)，60℃劇烈攪拌2h。最后，將反應(yīng)液9500r/min離心25min，并用水和乙醇洗三次，最后分散在水里，得到介孔硅納米顆粒，經(jīng)高溫煅燒除去CTAB后分散到水里備用。

(2)聚電解質(zhì)包裹的硅納米顆粒的制備：取100mg的PEI(聚乙烯亞銨，Mw＝20000g/mol)，將其溶于10mL 1mM的NaCl水溶液里，然后加入1mL步驟(1)中合成的硅納米顆粒，劇烈攪拌反應(yīng)3h。最后，將反應(yīng)液9500r/min離心25min，并用水洗三次，最后分散在水里，得到PEI聚電解質(zhì)包裹的硅納米顆粒。

(3)熒光染料修飾的硅納米顆粒的制備：取1mg吲哚菁綠羧基衍生物(Cypate)溶于3mL DMSO(二甲亞砜)，然后加入共價偶聯(lián)劑0.5mg的EDC和0.6mg的NHS，活化30min，再加入1mL步驟(2)中合成的聚電解質(zhì)包裹的硅納米顆粒，繼續(xù)攪拌16h。最后，將反應(yīng)液9500r/min離心25min，并用水洗三次，最后分散在水里，得到熒光染料修飾的硅納米顆粒。

(4)細(xì)菌感染診療一體化納米探針的制備：取228.6μL PAA(聚丙烯酸，Mw＝15000g/mol)，溶解在1770μL水里，然后加入0.2045g EDC和0.2316g NHS，活化30min，再加入25mL的氨基-聚乙二醇(mPEG-NH₂，20mg/mL，Mw＝5000g/mol)和MRSA抗體(8.4mg/mL)的混合水溶液，繼續(xù)攪拌反應(yīng)24h。然后將反應(yīng)液進(jìn)行透析純化，再加入0.3680g EDC和0.4168g NHS活化30min，再加入2mL步驟(3)中合成的熒光染料修飾的硅納米顆粒，繼續(xù)攪拌24h。最后，將反應(yīng)液9500r/min離心25min，并用水洗三次，得到細(xì)菌感染診療一體化納米探針。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。