本發(fā)明涉及一種牛骨多肽緩釋劑及其制備方法，屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
我國每年的肉類總產(chǎn)量可達(dá)5000多噸，然而，除排骨和腔骨可直接用于飲食而被大量需求外，其他骨頭的利用率均不高。尤其對(duì)骨蛋白這一優(yōu)質(zhì)營養(yǎng)源的利用很落后，并且對(duì)骨中的蛋白及其它營養(yǎng)成分沒有充分開發(fā)利用。目前，由于動(dòng)物骨頭價(jià)格低廉，不易儲(chǔ)存，所以往往被加工成附加值比較低的產(chǎn)品或被制成飼料，導(dǎo)致骨的利用率大大降低。這樣不僅會(huì)造成極大的浪費(fèi)，還會(huì)因骨頭極易腐敗變質(zhì)而導(dǎo)致一定的環(huán)境污染。
骨綜合利用的形式主要有兩種，一種是全骨利用，也就是整個(gè)骨頭的利用，該方法能夠比較全面的利用骨中的營養(yǎng)成分，其主要產(chǎn)品是骨粉、骨泥等，可以作為食品添加劑或者是肉類食品的替代物；另一種是骨提取物的利用，該方法是提取骨中的各類營養(yǎng)物質(zhì)并加以利用，其主要產(chǎn)品是骨油、骨膠、骨素等。
在牛骨蛋白質(zhì)的長鏈中，存在著比蛋白質(zhì)和氨基酸抗氧化性更強(qiáng)的抗氧化肽。蛋白酶的水解產(chǎn)物中存在多種抗氧化肽，它們具有較強(qiáng)抑制生物大分子過氧化和清除體內(nèi)自由基的功效?？寡趸囊云浞肿恿啃 ⒁孜铡⒒钚詮?qiáng)等特點(diǎn)受到重視，并在醫(yī)藥、化妝品、保健品和食品及飼料添加劑等方面具有廣闊的前景。
此外，多肽的分子結(jié)構(gòu)很不穩(wěn)定，在口服使用過程中，容易被腸道中的蛋白酶分解失去活性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明首先提供了一種制備牛骨多肽緩釋劑的方法。
所述方法主要包括以下步驟：
(1)將新鮮牛骨剔凈軋成1cm3左右的塊狀，用50℃的熱水沖洗去油脂后置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的鹽酸溶液中浸泡5～6h；牛骨與鹽酸溶液的用量比例為1kg：(1～3)L；
(2)撈出瀝干后粉碎并磨成骨泥，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2％的維生素C水溶液中，浸泡6～8h得到酶解底物；牛骨與維生素C水溶液的用量比例為1kg：(2～4)L；
(3)按質(zhì)量比1％加入酸性蛋白酶在45～50℃條件下酶解2～3h；調(diào)整pH至中性，按質(zhì)量比1％加入中性蛋白酶在42～45℃條件下酶解處理1～2h；
(4)滅酶：酶解結(jié)束后，升溫滅酶；
(5)過濾：加入珍珠巖、硅藻土等助濾劑，板框過濾得到水解液；
(6)濃縮：將水解液采用刮板濃縮器濃縮得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)30％的提取液；
(7)包埋：向步驟(6)所得提取液中添加質(zhì)量終濃度為0.5％的β-環(huán)糊精、質(zhì)量終濃度為0.1％的殼聚糖以質(zhì)量終濃度為0.005％氯化鈣，攪拌均勻后，在室溫下靜置3～6h；
(8)干燥：將步驟(7)所得混合物噴霧干燥得到牛骨多肽粉或者通過流化床造粒機(jī)制成顆粒。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述中性蛋白酶是20萬U/g的酶制劑。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述酸性蛋白酶是20萬U/g的酶制劑。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，還包括包裝、檢驗(yàn)的步驟。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟(6)所得提取液還采用分子截留量為10kDa的超濾膜進(jìn)行過濾。
本發(fā)明在前期對(duì)原料進(jìn)行復(fù)合預(yù)處理，然后復(fù)合使用兩種蛋白酶生產(chǎn)牛骨多肽，制成牛骨多肽產(chǎn)品。所得到的水解液的水解度為52％左右，對(duì)羥自由基清除率為37％左右，凝膠色譜測定步驟(5)水解液中多肽的分子量在5kD以內(nèi)的占80％以上；另外，所得牛骨水解液的抗氧化性能和抗細(xì)胞增殖能力都很好，細(xì)胞增殖抑制指數(shù)IR為70％左右，對(duì)羥自由基清除率為38％左右，可見本發(fā)明方法極大地保留了牛骨的活性成分。通過在多肽提取液中添加β-環(huán)糊精以及殼聚糖，對(duì)多肽活性物質(zhì)形成保護(hù)屏障，延長釋放時(shí)間。
具體實(shí)施方式
甲醛滴定法測定氨基酸含量(ANN)：取步驟(5)得到的20ml樣品置于燒杯中，加水60mL，開動(dòng)磁力攪拌器，用0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液滴定至pH為8.2。加入10mL甲醛溶液混勻，再用0.05mol/L氫氧化鈉溶液繼續(xù)滴定至pH為9.2，記下消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)的毫升數(shù)，同時(shí)取水80mL做試劑空白試驗(yàn)。按X＝(V1-V2)×C×0.014×100/(5×V)計(jì)算氨基氮(ANN)含量，氨基氮含量與水解度成正相關(guān)，其中，X為樣品中氨基氮的含量(g/100mL)；V1為測定用樣品加入甲醛稀釋后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)(mL)；V2為試劑空白試驗(yàn)加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL)；V為樣品液取用量(mL)；C為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液的濃度(mol/L)；0.014為氮的毫摩爾質(zhì)量(g/mmoL)。
抗細(xì)胞增殖能力的測定：采用MTT法進(jìn)行檢測；配制pH值為7.2的PBS溶液和濃度為200μg/ml的步驟(5)得到的水解液；取對(duì)數(shù)生長期的前列腺癌細(xì)胞DU-145制成懸液，接種至96孔板，每孔200μL，于5％CO2，37℃貼壁4h，然后加入步驟(5)得到的水解液，設(shè)3個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)不加藥對(duì)照組，置5％CO2，37℃培養(yǎng)箱中孵育48h，培養(yǎng)結(jié)束加入180μLMTT和20μL PBS繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸取96孔板的液體，加入150μL的DMSO，充分混合，置酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm測吸光度，按IR＝[(對(duì)照組A值—藥物組A值)/對(duì)照組A值]×100％計(jì)算細(xì)胞增殖抑制指數(shù)IR。
清除羥自由基能力的測定：取0.75mmol/L鄰二氮菲1mL裝于試管中，依次加入PBS(0.02mol/LpH 7.4)2mL，蒸餾水1mL，完全混勻后，加入0.75mmol/L的硫酸亞鐵1mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12％的過氧化氫1mL，于37℃水浴反應(yīng)90min，于536nm處測其吸光度，為Ap；用1mL蒸餾水代替1mL過氧化氫，為Ab；用樣品取代1mL蒸餾水，為As。羥自由基清除率按樣品對(duì)羥自由基清除率＝(As-Ap)/(Ab-Ap)×100％計(jì)算。
人工腸液的配制：準(zhǔn)確稱量磷酸二氫鉀6.8g，加入蒸餾水定容至500mL，然后用0.1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8，稱取胰蛋白酶10g，加入適量蒸餾水溶解，將pH值為6.8的磷酸二氫鉀溶液與胰蛋白酶溶液混合均勻，加蒸餾水定容至1000mL，即制成pH值為6.8的人工腸液。
實(shí)施例1
(1)將新鮮牛骨剔凈軋成1cm3左右的塊狀，用50℃的熱水沖洗去油脂后置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的鹽酸溶液中浸泡5h；牛骨與鹽酸溶液的用量比例為1kg：2L；
(2)撈出瀝干后粉碎并磨成骨泥，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2％的維生素C水溶液中，浸泡6h，得到酶解底物；牛骨與維生素C水溶液的用量比例為1kg：2L；
(3)按質(zhì)量比1％加入20萬U/g的酸性蛋白酶在50℃條件下酶解2h；調(diào)整pH至中性，按質(zhì)量比1％加入20萬U/g的中性蛋白酶在45℃條件下酶解處理2h；
(4)滅酶：酶解結(jié)束后，升溫滅酶；
(5)過濾：加入珍珠巖、硅藻土等助濾劑，板框過濾得到水解液；
(6)濃縮：將水解液采用刮板濃縮器濃縮得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)30％的提取液；
(7)包埋：向步驟(6)所得提取液中添加質(zhì)量終濃度為0.5％的β-環(huán)糊精、質(zhì)量終濃度為0.1％的殼聚糖以質(zhì)量終濃度為0.005％氯化鈣，攪拌均勻后，在室溫下靜置4h；
(8)干燥：將步驟(7)所得混合物通過流化床造粒機(jī)制成顆粒。
測得步驟(5)水解液水解度為52％，對(duì)羥自由基清除率為37％，細(xì)胞增殖抑制指數(shù)IR為71％，對(duì)羥自由基清除率為38％。向100mL人工腸液中，添加5g步驟(8)得到的顆粒，通過測定人工腸液中氨基氮的含量占氨基氮總量的百分比來反應(yīng)緩釋效果，結(jié)果顯示：前2h累積釋放率65.60％，2h后呈現(xiàn)緩慢釋放，4h累積釋放率達(dá)到96％，具有較好的緩釋性能。
實(shí)施例2
(1)將新鮮牛骨剔凈軋成1cm3左右的塊狀，用50℃的熱水沖洗去油脂后置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的鹽酸溶液中浸泡5h；牛骨與鹽酸溶液的用量比例為1kg：2L；
(2)撈出瀝干后粉碎并磨成骨泥，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2％的維生素C水溶液中，浸泡6h得到酶解底物；牛骨與維生素C水溶液的用量比例為1kg：2L；
(3)按質(zhì)量比1％加入20萬U/g的酸性蛋白酶在45～50℃條件下酶解3h；調(diào)整pH至中性，按質(zhì)量比1％加入20萬U/g的中性蛋白酶在42～45℃條件下酶解處理1h；
(4)滅酶：酶解結(jié)束后，升溫滅酶；
(5)過濾：加入珍珠巖、硅藻土等助濾劑，板框過濾得到水解液；
(6)濃縮：將水解液采用刮板濃縮器濃縮得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)30％的提取液；
(7)包埋：向步驟(6)所得提取液中添加質(zhì)量終濃度為0.5％的β-環(huán)糊精、質(zhì)量終濃度為0.1％的殼聚糖以質(zhì)量終濃度為0.005％氯化鈣，攪拌均勻后，在室溫下靜置5h；
(8)干燥：將步驟(7)所得混合物噴霧干燥得到牛骨多肽粉。
測得步驟(5)水解液水解度為54％，對(duì)羥自由基清除率為39％，細(xì)胞增殖抑制指數(shù)IR為70％，對(duì)羥自由基清除率為38.5％。向100mL人工腸液中，添加5g步驟(8)得到的牛骨多肽粉，通過測定人工腸液中氨基氮的含量占氨基氮總量的百分比來反應(yīng)緩釋效果，結(jié)果顯示：前2h累積釋放率68.60％，2h后呈現(xiàn)緩慢釋放，4h累積釋放率達(dá)到98％，具有較好的緩釋性能。
實(shí)施例3
(1)將新鮮牛骨剔凈軋成1cm3左右的塊狀，用50℃的熱水沖洗去油脂后置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的鹽酸溶液中浸泡5h；牛骨與鹽酸溶液的用量比例為1kg：2L；
(2)撈出瀝干后粉碎并磨成骨泥，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2％的維生素C水溶液中，浸泡6h，得到酶解底物；牛骨與維生素C水溶液的用量比例為1kg：2L；
(3)按質(zhì)量比1％加入20萬U/g的酸性蛋白酶在45～50℃條件下酶解3h；
(4)滅酶：酶解結(jié)束后，升溫滅酶；
(5)過濾：加入珍珠巖、硅藻土等助濾劑，板框過濾得到水解液；
(6)濃縮：將水解液采用刮板濃縮器濃縮得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)30％的提取液；
(7)包埋：向步驟(6)所得提取液中添加質(zhì)量終濃度為0.5％的β-環(huán)糊精、質(zhì)量終濃度為0.1％的殼聚糖以質(zhì)量終濃度為0.005％氯化鈣，攪拌均勻后，在室溫下靜置3～6h；
(8)干燥：將步驟(7)所得混合物噴霧干燥得到牛骨多肽粉。
測得步驟(5)水解液水解度為43％，對(duì)羥自由基清除率為31％，細(xì)胞增殖抑制指數(shù)IR為36％，對(duì)羥自由基清除率為31％。
實(shí)施例4
(1)將新鮮牛骨剔凈軋成1cm3左右的塊狀，用50℃的熱水沖洗去油脂后置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的鹽酸溶液中浸泡5h；牛骨與鹽酸溶液的用量比例為1kg：2L；
(2)撈出瀝干后粉碎并磨成骨泥，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2％的維生素C水溶液中，浸泡6h得到酶解底物；牛骨與維生素C水溶液的用量比例為1kg：2L；
(3)按質(zhì)量比1％加入20萬U/g的酸性蛋白酶在45～50℃條件下酶解3h；調(diào)整pH至中性，按質(zhì)量比1％加入20萬U/g的中性蛋白酶在42～45℃條件下酶解處理1h；
(4)滅酶：酶解結(jié)束后，升溫滅酶；
(5)過濾：加入珍珠巖、硅藻土等助濾劑，板框過濾得到水解液；
(6)濃縮：將水解液采用刮板濃縮器濃縮得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)30％的提取液；
(7)包埋：向步驟(6)所得提取液中添加終濃度為0.5％的β-環(huán)糊精，攪拌均勻后，在室溫下靜置3～6h；
(8)干燥：將步驟(7)所得混合物噴霧干燥得到牛骨多肽粉。
測得步驟(5)水解液水解度為54％，對(duì)羥自由基清除率為39％，細(xì)胞增殖抑制指數(shù)IR為70％，對(duì)羥自由基清除率為38.5％。向100mL人工腸液中，添加5g步驟(8)得到的牛骨多肽粉，通過測定人工腸液中氨基氮的含量占氨基氮總量的百分比來反應(yīng)緩釋效果，結(jié)果顯示：前2h累積釋放率77.20％，2h后呈現(xiàn)緩慢釋放，3h累積釋放率達(dá)到99％。
實(shí)施例5
(1)將新鮮牛骨剔凈軋成1cm3左右的塊狀，用50℃的熱水沖洗去油脂后置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的鹽酸溶液中浸泡5h；牛骨與鹽酸溶液的用量比例為1kg：2L；
(2)撈出瀝干后粉碎并磨成骨泥，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2％的維生素C水溶液中，浸泡6h得到酶解底物；牛骨與維生素C水溶液的用量比例為1kg：2L；
(3)按質(zhì)量比1％加入20萬U/g的酸性蛋白酶在45～50℃條件下酶解3h；調(diào)整pH至中性，按質(zhì)量比1％加入20萬U/g的中性蛋白酶在42～45℃條件下酶解處理1h；
(4)滅酶：酶解結(jié)束后，升溫滅酶；
(5)過濾：加入珍珠巖、硅藻土等助濾劑，板框過濾得到水解液；
(6)濃縮：將水解液采用刮板濃縮器濃縮得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)30％的提取液；
(7)包埋：向步驟(6)所得提取液中添加終濃度為0.1％的殼聚糖，攪拌均勻后，在室溫下靜置3～6h；
(8)干燥：將步驟(7)所得混合物噴霧干燥得到牛骨多肽粉。
測得步驟(5)水解液水解度為54％，對(duì)羥自由基清除率為39％，細(xì)胞增殖抑制指數(shù)IR為70％，對(duì)羥自由基清除率為38.5％。向100mL人工腸液中，添加5g步驟(8)得到的牛骨多肽粉，通過測定人工腸液中氨基氮的含量占氨基氮總量的百分比來反應(yīng)緩釋效果，結(jié)果顯示：前2h累積釋放率88.60％，2h后呈現(xiàn)緩慢釋放，2.5h累積釋放率達(dá)到98％。
實(shí)施例6
(1)將新鮮牛骨剔凈軋成1cm3左右的塊狀，用50℃的熱水沖洗去油脂后置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的鹽酸溶液中浸泡5h；牛骨與鹽酸溶液的用量比例為1kg：2L；
(2)撈出瀝干后粉碎并磨成骨泥，加入水浸泡6h，得到酶解底物；牛骨與水的用量比例為1kg：2L；
(3)按質(zhì)量比1％加入20萬U/g的酸性蛋白酶在45～50℃條件下酶解3h；調(diào)整pH至中性，按質(zhì)量比1％加入20萬U/g的中性蛋白酶在45℃條件下酶解處理2h；
(4)滅酶：酶解結(jié)束后，升溫滅酶；
(5)過濾：加入珍珠巖、硅藻土等助濾劑，板框過濾得到水解液；
(6)濃縮：將水解液采用刮板濃縮器濃縮得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)30％的提取液；
(7)包埋：向步驟(6)所得提取液中添加質(zhì)量終濃度為0.5％的β-環(huán)糊精、質(zhì)量終濃度為0.1％的殼聚糖以質(zhì)量終濃度為0.005％氯化鈣，攪拌均勻后，在室溫下靜置4h；
(8)干燥：將步驟(7)所得混合物通過流化床造粒機(jī)制成顆粒。
測得步驟(5)水解液水解度為26％，對(duì)羥自由基清除率為29％，細(xì)胞增殖抑制指數(shù)IR為33％，對(duì)羥自由基清除率為31％。向100mL人工腸液中，添加5g步驟(8)得到的多顆粒，通過測定人工腸液中氨基氮的含量占氨基氮總量的百分比來反應(yīng)緩釋效果，結(jié)果顯示：前2h累積釋放率58％，2h后呈現(xiàn)緩慢釋放，4h累積釋放率達(dá)到95％，具有較好的緩釋性能。
實(shí)施例7
(1)將新鮮牛骨剔凈軋成1cm3左右的塊狀，用50℃的熱水沖洗去油脂；
(2)瀝干后粉碎并磨成骨泥，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2％的維生素C水溶液中，浸泡6h，得到酶解底物；牛骨與維生素C水溶液的用量比例為1kg：2L；
(3)按質(zhì)量比1％加入20萬U/g的酸性蛋白酶在45～50℃條件下酶解3h；調(diào)整pH至中性，按質(zhì)量比1％加入20萬U/g的中性蛋白酶在45℃條件下酶解處理2h；
(4)滅酶：酶解結(jié)束后，升溫滅酶；
(5)過濾：加入珍珠巖、硅藻土等助濾劑，板框過濾得到水解液；
(6)濃縮：將水解液采用刮板濃縮器濃縮得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)30％的提取液；
(7)包埋：向步驟(6)所得提取液中添加質(zhì)量終濃度為0.5％的β-環(huán)糊精、質(zhì)量終濃度為0.1％的殼聚糖以質(zhì)量終濃度為0.005％氯化鈣，攪拌均勻后，在室溫下靜置4h；
(8)干燥：將步驟(7)所得混合物通過流化床造粒機(jī)制成顆粒。
測得步驟(5)水解液水解度為28，對(duì)羥自由基清除率為25％，細(xì)胞增殖抑制指數(shù)IR為29％，對(duì)羥自由基清除率為31％。向100mL人工腸液中，添加5g步驟(8)得到的多顆粒，通過測定人工腸液中氨基氮的含量占氨基氮總量的百分比來反應(yīng)緩釋效果，結(jié)果顯示：前2h累積釋放率58％，2h后呈現(xiàn)緩慢釋放，4h累積釋放率達(dá)到95％，具有較好的緩釋性能。
雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。