本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，尤其涉及復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體及其制備方法。

背景技術(shù)：

細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)可以旁分泌、自分泌或內(nèi)分泌多種生物活性因子，用于調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長與分化，促進(jìn)細(xì)胞的營養(yǎng)代謝。研究發(fā)現(xiàn)：生物活性因子能夠促進(jìn)皮膚細(xì)胞的營養(yǎng)代謝，在美容護(hù)膚及醫(yī)療保健方面具有廣闊的應(yīng)用前景，例如，組織工程雙層皮膚培養(yǎng)液中的BFGF(中文：堿性成纖維細(xì)胞生長因子，英文：basic fibroblast growth factor)具有抗皺、預(yù)防衰老、美白、祛斑、防曬與曬后修復(fù)、預(yù)防粉刺、去疤痕等作用，而EGF(中文：表皮生長因子，英文：epidermal growth factor)具有修復(fù)、抗皺、抗衰老、淡化色斑與補(bǔ)水等的功效，與普通的化妝品相比，其中的生物活性成分能夠直接參與皮膚代謝，沒有副作用，能夠從本質(zhì)上解決皮膚問題。

然而，復(fù)合生物活性因子的生物活性直接影響復(fù)合生物活性因子的應(yīng)用。脂質(zhì)體是脂類分子(類脂)的自組裝體，是一種由一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)雙層中間包覆微水相的結(jié)構(gòu)。在脂質(zhì)體的形成過程中，親水的頭部形成膜的內(nèi)外表面層，而親油性的尾部處于膜的中間。脂質(zhì)體的這種結(jié)構(gòu)使其具有一定的包封率，能夠使復(fù)合生物活性因子的生物活性保持在較高水平。

例如，公開號為CN 101444619A的專利提供的脂質(zhì)體包裹重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的制備方法包括：第一步：將單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂GMI、磷脂酰乙醇胺和膽固醇的混合物，用甲醇和氯仿的混合溶劑溶解；第二步：將上述混合液加入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，揮盡乙醇，形成均勻的脂質(zhì)膜；第三步：加入重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的磷酸鹽溶液，得到脂質(zhì)體粗懸液；第四步：對脂質(zhì)體粗懸液進(jìn)行超聲處理，再加以微孔濾膜整粒，得到重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子脂質(zhì)體。通過上述制備方法所獲得的重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子脂質(zhì)體只包含單一的生物活性因子，營養(yǎng)成分不全面，限制了脂質(zhì)體的應(yīng)用。再例 如，公開號為CN 103637989A的專利提供的乙醇注入-動態(tài)高壓微射流制備茶多酚納米脂質(zhì)體的方法包括：第一步：將卵磷脂、膽固醇、吐溫-80和茶多酚的混合物，用大量無水乙醇溶解；第二步：將上述混合液緩慢注入磷酸鹽溶液中，形成乳液；第三：將脂質(zhì)體粗懸液真空旋轉(zhuǎn)去無水乙醇，得到脂質(zhì)體粗懸液；第四步：對脂質(zhì)體粗懸液在110MPa的動態(tài)微射流處理一次，得到納米脂質(zhì)體。在該制備方法中采用大量無水乙醇對后期處理造成麻煩，而整粒過程在高壓下進(jìn)行不利于保持生物活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的在于，提供復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體及其制備方法，能夠提高復(fù)合生物活性因子的生物活性和穩(wěn)定性，且能夠延長復(fù)合生物活性因子的保存時(shí)間。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體的制備方法，包括：

步驟1)將有機(jī)溶劑溶解的1-5份磷脂和0.02-0.2份膽固醇溶液緩慢注入含有0.005-0.01份復(fù)合生物活性因子的溶液中，持續(xù)攪拌，獲得復(fù)合生物活性因子粗脂質(zhì)體；

步驟2)將所獲得的復(fù)合生物活性因子粗脂質(zhì)體超聲整粒得到復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體。

優(yōu)選的，所述有機(jī)溶劑為5-10份的乙醇或者乙醚。

其中，所述超聲整粒具體為：在功率為10-30W的條件下，超聲1s停止1s交替循環(huán)2-5min。

可選的，步驟2)之后還包括：將所述復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體冷凍干燥，獲得復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體凍干粉。

優(yōu)選的，步驟1)還包括：在所述復(fù)合生物活性因子溶液中加入凍干保護(hù)劑。

進(jìn)一步優(yōu)選的，步驟2)還包括：在超聲整粒完成后向所述復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體中加入凍干保護(hù)劑。

可選的，所述凍干保護(hù)劑為5-10份的蔗糖或者乳糖。

另一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體，所述復(fù) 合生物活性因子脂質(zhì)體由上述所述的制備方法制備得到。

優(yōu)選的，所述復(fù)合生物活性因子至少包含：人表皮生長因子hEGF、血管內(nèi)皮生長因子VEGF、成纖維細(xì)胞生長因子FGF、轉(zhuǎn)化生長因子-β1TGF-β1、轉(zhuǎn)化生長因子-β2TGF-β2、類胰島素一號增長因子IGF-1、類胰島素二號增長因子IGF-2。

其中，所述復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體的包封率為50％-60％，粒徑分布范圍為50-100nm。

本發(fā)明實(shí)施例提供的復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體及其制備方法，在步驟1)中，將脂溶液緩慢注入復(fù)合生物活性因子溶液中，能夠形成粒徑較小的復(fù)合生物活性因子粗脂質(zhì)體，可以在保證復(fù)合生物活性因子較高活性的前提下，提高復(fù)合生物活性因子的包封率，再通過超聲整粒可以得到粒徑為50-100nm吸收效果好、穩(wěn)定性好的復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體，該方法制備溫和，工藝簡單，所得復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體所含的生物活性因子的活性可以保持70-80％，包封率達(dá)到50％-60％，且能夠延長保存時(shí)間。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖。

圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體的制備方法流程圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例中利用基因表達(dá)方式檢測復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體和原料的生物活性的檢測結(jié)果示意圖。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)將詳細(xì)地提供本發(fā)明實(shí)施方式的參考，其一個(gè)或多個(gè)實(shí)例描述于下文。提供每一實(shí)例作為解釋而非限制本發(fā)明。實(shí)際上，對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯而易見的是，可以對本發(fā)明進(jìn)行多種修改和變化而不背離本發(fā)明的范圍或精神。例如，作為一個(gè)實(shí)施方式的部分而說明或描述的特征可以用于另一實(shí)施方式中，來產(chǎn)生更進(jìn)一步的實(shí)施方 式。因此，基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明實(shí)施例所涉及的材料均可以通過商業(yè)途徑或通過申請人獲取。

一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體的制備方法，包括：

步驟1)將有機(jī)溶劑溶解的1-5份磷脂和0.02-0.2份膽固醇溶液緩慢注入含有0.005-0.01份的復(fù)合生物活性因子的溶液中，持續(xù)攪拌，獲得復(fù)合生物活性因子粗脂質(zhì)體；

步驟2)將所獲得的復(fù)合生物活性因子粗脂質(zhì)體超聲整粒得到復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體。

其中，將有機(jī)溶劑溶解的1-5份磷脂和0.02-0.2份膽固醇溶液記為脂溶液，將所獲得的脂溶液緩慢注入復(fù)合生物活性因子的溶液中，該操作能夠縮短脂溶液在所述復(fù)合生物活性因子溶液中的分散時(shí)間，所得復(fù)合生物活性因子粗脂質(zhì)體的粒徑相對較小，進(jìn)而提高最終獲得的復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體的包封率與穩(wěn)定性。

本發(fā)明實(shí)施例提供的復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體的制備方法，在步驟1)中，將脂溶液緩慢注入復(fù)合生物活性因子溶液中，能夠形成粒徑較小的復(fù)合生物活性因子粗脂質(zhì)體，可以在保證復(fù)合生物活性因子較高活性的前提下，提高復(fù)合生物活性因子的包封率，再通過超聲整粒可以得到粒徑為50-100nm吸收效果好、穩(wěn)定性好的復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體，該方法制備溫和，工藝簡單，所得復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體所含的生物活性因子的活性可以保持70-80％，包封率達(dá)到50％-60％，且能夠延長保存時(shí)間。

其中，步驟1)中有機(jī)溶劑的種類不做限定，例如，可以為甲醇、氯仿、乙醇等對所述1-5份磷脂和0.02-0.2份膽固醇溶解性較好的任何溶劑，然而，考慮到后期所獲得的復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體的生物應(yīng)用性與環(huán)境友好性，優(yōu)選的，所述有機(jī)溶劑為5-10份的乙醇或者乙醚。

在此，對復(fù)合生物活性因子溶液的獲取不做限定，復(fù)合生物活性因子溶液可以通過公知渠道獲得各種生物活性因子，再進(jìn)行配比而獲 得，當(dāng)然也可通過對組織工程皮膚條件培養(yǎng)液進(jìn)行提純濃縮處理后而得到。

需要說明的是，整粒具有多種實(shí)現(xiàn)方式，例如，可以為高壓均質(zhì)機(jī)整粒、動態(tài)高壓微射流整粒等，為了保持復(fù)合生物活性因子的生物活性，本發(fā)明實(shí)施例采用超聲整粒，避免了高壓均質(zhì)機(jī)整粒與動態(tài)高壓微射流整粒過程中的高壓環(huán)境對生物活性保持不利的缺陷。然而，超聲過程是高能釋放的過程，為了最大程度上保持所述復(fù)合生物活性因子的生物活性，可以設(shè)置溫和的超聲條件。

優(yōu)選的，所述超聲整粒具體為：在功率為10-30W的條件下，超聲1s停止1s交替循環(huán)2-5min。

所述超聲1s停止1s避免了持續(xù)超聲過程中的熱量釋放，能夠減少對所述復(fù)合生物活性因子的生物活性的不良影響。

為了進(jìn)一步延長所述復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體的保存時(shí)間，優(yōu)選的，步驟2)之后還包括：將所述復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體冷凍干燥，獲得復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體凍干粉。

所述冷凍干燥是指將物料冷凍到冰點(diǎn)以下從而使水轉(zhuǎn)變?yōu)楸?，在真空下冰直接轉(zhuǎn)變?yōu)檎羝サ母稍锓椒ǎ鋬龈稍镞m用于熱敏物質(zhì)，例如，具有生物活性的物質(zhì)等，通過冷凍干燥能夠保持物料的穩(wěn)定性與生物活性，并且冷凍干燥后的成品呈多孔狀，具有優(yōu)異的復(fù)溶性，能夠迅速恢復(fù)物料的組織結(jié)構(gòu)。

冷凍干燥過程具體如下表1所示，分為三個(gè)階段：預(yù)凍結(jié)段、一次干燥階段與二次干燥階段，在預(yù)凍階段要嚴(yán)格控制預(yù)凍溫度(通常比預(yù)凍物質(zhì)的共熔點(diǎn)低幾度)。如果預(yù)凍溫度不夠低，則可能會發(fā)生不能被完全凍結(jié)，在抽真空升華時(shí)會膨脹起泡；若預(yù)凍溫度太低，不僅會增加不必要的能量消耗，而且對于某些生物活性物質(zhì)，會降低其凍干后的活性保持率。在一次干燥階段即在真空下升華的階段，為保證冰的升華，應(yīng)開啟加熱系統(tǒng)，不斷供給冰升華所需的熱量；二次干燥階段所除去的水分為結(jié)合水分，此時(shí)固體表面的水蒸氣壓呈不同程度的降低，干燥速度明顯下降。在保證產(chǎn)品質(zhì)量的前提下，在此階段內(nèi)應(yīng)適當(dāng)提高溫度，以利于水分的蒸發(fā)。

表1

在冷凍干燥過程中，不可避免會引起生物活性物質(zhì)的變性、聚集，使得維持所述生物活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)的作用力被破壞，生物活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)的變化會導(dǎo)致其活性的喪失，為了在冷凍干燥過程中保持所述復(fù)合生物活性因子的生物活性，可以在冷凍干燥過程中加入凍干保護(hù)劑，所述凍干保護(hù)劑具有抗冷凍、抗脫水的生物學(xué)功能，能夠維持所述生物活性物質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)，避免發(fā)生活性的喪失。

優(yōu)選的，步驟1)還包括：在所述復(fù)合生物活性因子溶液中加入凍干保護(hù)劑。

或者，步驟2)還包括：在超聲整粒完成后向所述復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體中加入凍干保護(hù)劑。

對所述凍干保護(hù)劑的種類不做限定，例如，可以為單糖、雙糖、寡聚糖、多元醇等，在多種凍干保護(hù)劑中，通過研究發(fā)現(xiàn)雙糖類的保護(hù)效果優(yōu)于其他凍干保護(hù)劑，能夠最大程度上保持復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體凍干后的生物活性。

優(yōu)選的，所述凍干保護(hù)劑為5-10份的蔗糖或者乳糖。

我們通過基因表達(dá)方式檢測所得復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體中復(fù)合生物活性因子的生物活性，即根據(jù)復(fù)合生物活性因子的抗氧化指標(biāo)CAT、GSH、Cu-SOD、Mn-SOD檢測所述復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體中復(fù)合生物活性因子的生物活性。檢測結(jié)果如圖2所示，根據(jù)圖2的檢測結(jié)果可知，所得復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體的生物活性和復(fù)合生物活性因子溶液相比，保持了70％-80％的生物活性。

實(shí)施例

下面的實(shí)施例用來說明本發(fā)明，并不是想限制本發(fā)明的范圍。以 下實(shí)施例僅以原料質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的復(fù)合生物活性因子溶液為例進(jìn)行說明，實(shí)際使用時(shí)，復(fù)合生物活性因子溶液的濃度并不對本發(fā)明目的的實(shí)現(xiàn)構(gòu)成影響。

實(shí)施例1

用5份乙醇溶解1份大豆卵磷脂和0.02份膽固醇獲得脂溶液，將所獲得的脂溶液緩慢注入含0.008份的復(fù)合生物活性因子的溶液中，持續(xù)攪拌，獲得復(fù)合生物活性因子粗脂質(zhì)體；

將所得復(fù)合生物活性因子粗脂質(zhì)體經(jīng)過超聲(超聲條件為：功率為10W，超聲1s停止1s交替進(jìn)行2min)整粒后，加入凍干保護(hù)劑(5份蔗糖)冷凍干燥，制成復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體凍干粉。

結(jié)論：所得復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體的包封率為50％，粒徑為50nm，保持復(fù)合生物活性因子溶液中70％以上的生物活性因子的活性，主要為EGF、BFGF、VEGF、IGF1、IGF2、TGF-B1、TGF-B2、PDGF和KGF，在2-8℃下保存1年以后，包封率為30％，復(fù)合生物活性因子保持70％以上的活性。

實(shí)施例2

用10份乙醚溶解5份大豆卵磷脂和0.2份膽固醇獲得脂溶液，將所獲得的脂溶液緩慢注入含0.01份的復(fù)合生物活性因子的溶液中，持續(xù)攪拌，獲得復(fù)合生物活性因子粗脂質(zhì)體；

將所得復(fù)合生物活性因子粗脂質(zhì)體經(jīng)過超聲(超聲條件為：功率為30W，超聲1s停止1s交替進(jìn)行5min)整粒后，加入凍干保護(hù)劑(10份乳糖)冷凍干燥，制成復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體凍干粉。

結(jié)論：所得復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體的包封率為60％，保持復(fù)合生物活性因子溶液中80％以上的生物活性因子的活性，主要為EGF、BFGF、VEGF、IGF1、IGF2、TGF-B1、TGF-B2、PDGF和KGF，在2-8℃下保存1年以后，包封率為50％，復(fù)合生物活性因子保持72％以上的活性。

實(shí)施例3

用8份乙醇溶解3份大豆卵磷脂和0.1份膽固醇獲得脂溶液，將所獲得的脂溶液緩慢注入溶解有凍干保護(hù)劑(8份蔗糖)的含0.005份的復(fù)合生物活性因子的溶液中，持續(xù)攪拌，獲得復(fù)合生物活性因子 粗脂質(zhì)體；

將所得復(fù)合生物活性因子粗脂質(zhì)體經(jīng)過超聲(超聲條件為：功率為20W，超聲1s停止1s交替進(jìn)行3min)整粒后進(jìn)行冷凍干燥，制成復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體凍干粉。

結(jié)論：所得復(fù)合生物活性因子脂質(zhì)體的包封率為55％，保持復(fù)合生物活性因子溶液中75％以上的生物活性因子的活性，主要為EGF、BFGF、VEGF、IGF1、IGF2、TGF-B1、TGF-B2、PDGF和KGF，在2-8℃下保存1年以后，包封率為50％，復(fù)合生物活性因子保持65％以上的活性。

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以所述權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。