本發(fā)明屬于細(xì)胞治療和脂質(zhì)體藥物精準(zhǔn)輸送
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種DC細(xì)胞膜仿生脂質(zhì)體藥物載體，還涉及一種上述細(xì)胞膜仿生脂質(zhì)體藥物載體的制備方法，還涉及一種上述細(xì)胞膜仿生脂質(zhì)體藥物載體的應(yīng)用，可用于精確靶向體內(nèi)樹突細(xì)胞(DC)。
背景技術(shù)：
：當(dāng)前藥物的靶向給藥系統(tǒng)包括脂質(zhì)體、乳劑、微球、納米粒等，其中脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)是將藥物裝載在由脂類分子包裹(脂質(zhì)體)的超微球狀囊泡中，內(nèi)部為水性空間，可以裝載親水性藥物，外層脂質(zhì)分子為親脂性藥物裝載的空間，大小一般在幾個(gè)nm到幾個(gè)μm，分為被動(dòng)和主動(dòng)靶向脂質(zhì)體兩種。目前人們已經(jīng)發(fā)明的各類脂質(zhì)體對(duì)靶細(xì)胞的融合隨機(jī)性比較大，特異性相對(duì)較低，限于脂質(zhì)體膜上的有限的蛋白的介導(dǎo)，脂質(zhì)體的融合概率相對(duì)較低，由于脂質(zhì)體脂質(zhì)種類和修飾以及缺乏蛋白因子的介導(dǎo)，造成其表面成分與靶細(xì)胞表面成分之間存在較大的差異，造成了這種人工脂質(zhì)體與靶細(xì)胞間的融合概率相對(duì)較低，與非靶細(xì)胞的非特異性融合增大，另外，傳統(tǒng)脂質(zhì)體易被體內(nèi)的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)所吞噬而被清理，導(dǎo)致藥物的半衰期和有效性大大降低。設(shè)計(jì)針對(duì)特定細(xì)胞類型的脂質(zhì)體是該領(lǐng)域的一個(gè)重要發(fā)展目標(biāo)。細(xì)胞的膜融合存在同型融合和異型融合方式，均需要細(xì)胞膜上的特殊蛋白介導(dǎo)，其中同型細(xì)胞膜間的融合較容易發(fā)生，如果這些細(xì)胞膜蛋白用于制作脂質(zhì)體，在理論上將會(huì)模擬同類型細(xì)胞間的融合，而具有特定細(xì)胞的靶向作用，而且可以降低被視為外援物質(zhì)而被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬的可能性。而傳統(tǒng)脂質(zhì)體的制作并未對(duì)細(xì)胞膜蛋白仿生脂質(zhì)體作充分的重視，首先，不同類型的細(xì)胞表面存在的膜受體及膜融合相關(guān)的蛋白種類有差異，通用化運(yùn)用較難，尤其是一些細(xì)胞特異的膜融合蛋白；再者，參與細(xì)胞膜融合的蛋白種類較多，不易做相關(guān)蛋白的分離和脂質(zhì)體膜的整合操作；由于大部分膜蛋白是經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的糖基化修飾，重組蛋白一般缺失這些糖基化修飾，酵母表達(dá)的蛋白存在過度糖基化，使用酵母源的重組蛋白存在產(chǎn)生抗體的風(fēng)險(xiǎn)，而且多種細(xì)胞膜蛋白的重組表達(dá)也將是一個(gè)較大的工作量，上述種種困難，阻礙了人們開發(fā)細(xì)胞膜仿生脂質(zhì)體的開發(fā)。樹突細(xì)胞(Dendriticcell，DC)是體內(nèi)功能強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞，其自身具有免疫刺激能力，能夠激活未致敏初始型T細(xì)胞，DC不僅能夠以抗原特異的形式啟動(dòng)T細(xì)胞，識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞，也可以激發(fā)免疫記憶保護(hù)，當(dāng)宿主再次受到腫瘤細(xì)胞攻擊時(shí)發(fā)揮保護(hù)作用。PBMC(指外周血中具有單個(gè)核的細(xì)胞)可以在特定細(xì)胞因子下誘導(dǎo)形成樹突細(xì)胞。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的解決上述技術(shù)問題，基于同型細(xì)胞膜融合的脂質(zhì)體藥物載體的設(shè)計(jì)，提供一種靶向性的、個(gè)性化的DC細(xì)胞膜仿生脂質(zhì)體藥物載體及其制備方法和應(yīng)用，用于藥物或者抗原的體內(nèi)靶向DC細(xì)胞，提高DC細(xì)胞的抗原提呈能力，提高免疫力，也可以提高免疫耐受。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種DC細(xì)胞膜仿生脂質(zhì)體藥物載體，其特征在于，(1)該脂質(zhì)體藥物載體具有細(xì)胞膜蛋白組分；(2)該脂質(zhì)體藥物載體能夠體外裝載藥物，用于細(xì)胞靶向融合釋放；(3)該脂質(zhì)體所具有的細(xì)胞膜蛋白組分來自于永生化的自體樹突細(xì)胞。進(jìn)一步地，裝載的藥物可以為普通化學(xué)藥物、siRNA藥物、mRNA藥物、DNA藥物、蛋白藥物、多肽類藥物、免疫增強(qiáng)劑、免疫抑制劑、免疫佐劑中的一種或多種的混合，其中的普通化學(xué)藥物可以為親水、疏水性藥物或雙親性化學(xué)藥物。所述DC細(xì)胞膜仿生脂質(zhì)體藥物載體作為DC疫苗的應(yīng)用：(1)該疫苗可包封多肽，如MUC1的胞外短重復(fù)序列；(2)該疫苗可包封多肽，如K-Ras的G12突變短肽序列；(3)該疫苗可包封腫瘤相關(guān)或者腫瘤特異抗原的編碼序列，如編碼MUC1的胞外短重復(fù)序列，編碼K-ras的G12突變短肽序列；(4)該疫苗除含有抗原編碼序列外，還含有共同表達(dá)的DC激活基因序列，DC激活基因編碼元件包括分泌性的CD40L細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和FLT3LG的分泌性細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，以及GM-CSF的編碼序列；(5)該疫苗除含有抗原編碼序列外，還含有共同表達(dá)的DC激活基因序列，如CD80、CD86等共激活基因的編碼序列，以及GM-CSF的編碼序列；(6)該疫苗可共同包封多肽、抗原編碼序列和DC激活基因序列；(6)該疫苗還含有卡介苗或單磷?；|(zhì)A(MPLA)等免疫佐劑；(7)該疫苗所用的質(zhì)粒，還含有S/MAR等基因組非整合性DNA元件。所述DC細(xì)胞膜仿生脂質(zhì)體藥物載體在治療癌癥、細(xì)菌性炎癥、病毒性炎癥、過敏性炎癥、自身免疫性疾病或者皮膚疾病的應(yīng)用。如用永生化的DC制作的仿樹突細(xì)胞脂質(zhì)體，用于包裹抗腫瘤藥物，抗腫瘤特異性抗原和腫瘤相關(guān)抗原TAA；如用于質(zhì)量K-ras突變的腫瘤等，又如用于MUC1糖基化不足的腫瘤等。一種上述DC細(xì)胞膜仿生脂質(zhì)體藥物載體的制備方法，包括以下步驟：(1)原代細(xì)胞的永生化誘導(dǎo)，以獲得永生化能力；(2)進(jìn)一步誘導(dǎo)成為未成熟型或成熟型DC細(xì)胞，或者誘導(dǎo)成為免疫激活型或者免疫抑制型的DC細(xì)胞；(3)提取DC細(xì)胞的細(xì)胞膜蛋白，整合入人工脂質(zhì)體膜中；(4)細(xì)胞膜脂質(zhì)體制備和藥物裝載。其具體方案如下：1.原代DC細(xì)胞的永生化誘導(dǎo)本發(fā)明借助傳統(tǒng)的細(xì)胞永生化方法進(jìn)行細(xì)胞的處理，主要采用hTERT、SV40大T抗原、EB病毒、c-MYC等方法處理，上述方法的單獨(dú)處理和/或組合應(yīng)用。優(yōu)先采用hTERT(GenBank:NM_198253或者NM_001193376)、SV40大T抗原(GenBank:J02400.1)和/或C-MYC共(GenBank:NM_002467)共同刺激細(xì)胞的永生化，hTERT、SV40大T抗原(SV40-LT)和/或hC-MYC的表達(dá)質(zhì)粒，由一個(gè)質(zhì)粒共同編碼，本發(fā)明優(yōu)先采用hTERT、SV40大T抗原和C-MYC由同一個(gè)質(zhì)粒編碼的方式，三者之間采用2A自切肽間隔，用于同一個(gè)編碼框下的彼此的獨(dú)立表達(dá)，可采用來自豬捷申病毒P2A,或者來自四體病毒的T2A,馬鼻炎A病毒的E2A，手足口病毒F2A，細(xì)胞質(zhì)多角體病毒的BmCPV2A或者家蠶傳染性軟化病病毒BmIFV2A，優(yōu)先采用P2A；表達(dá)載體為非病毒載體或者病毒載體，優(yōu)先采用病毒載體，比如慢病毒載體，用于慢病毒的包裝感染，該載體除5’-LTR外，還有內(nèi)置啟動(dòng)子CMV等，用于啟動(dòng)插入的編碼框的高效表達(dá)，表達(dá)框如圖1。該方法提高對(duì)原代細(xì)胞的感染效率和有效穩(wěn)定表達(dá)?？刹捎梦覀儤?gòu)建的基因組整合型或基因組非整合型病毒載體，用于病毒的包裝和感染。該載體可以含有篩選標(biāo)志，比如抗生素篩選標(biāo)志，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)先采用帶嘌呤霉素篩選標(biāo)志的載體進(jìn)行后續(xù)的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞的抗性篩選。分選的原代PBMC細(xì)胞進(jìn)行病毒感染。編碼hTERT和SV40大T抗原的慢病毒感染細(xì)胞24-48小時(shí)后，除去病毒，繼續(xù)培養(yǎng)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，可以適當(dāng)用抗生素篩選，比如加0.3-2ug/ml的嘌呤霉素篩選細(xì)胞，以除去未感染病毒的細(xì)胞。2.永生化PBMC細(xì)胞的進(jìn)一步分化由于某些高度分化的細(xì)胞較難作永生化處理，比如外周血的PBMC細(xì)胞，經(jīng)過永生化處理后，可以進(jìn)一步作分化誘導(dǎo)處理，誘導(dǎo)成為未成熟型和成熟型樹突細(xì)胞，也可以誘導(dǎo)為免疫激活型和免疫耐受型DC，上述不同類型的DC細(xì)胞膜可以用于不同的仿生DC細(xì)胞膜脂質(zhì)體的制作，DC仿生脂質(zhì)體疫苗優(yōu)先未成熟型DC細(xì)胞膜制作，某些情況下也可以用成熟、免疫激活型的DC細(xì)胞制作仿生脂質(zhì)體，比如用IL-4、GM－CSF和IFN-α、LPS誘導(dǎo)可以獲得免疫激活型DC；IL-4、GM－CSF和TNFa誘導(dǎo)，可以獲得免疫耐受型的DC。DC細(xì)胞的誘導(dǎo)：永生化PBMC進(jìn)一步采用IL-4、GM－CSF和/或IFN-α和/或sCD40L進(jìn)行誘導(dǎo)刺激DC細(xì)胞的分化和進(jìn)一步的成熟，提取細(xì)胞膜用于仿生脂質(zhì)體的制作。而已經(jīng)永生化的某些細(xì)胞系可直接用于細(xì)胞膜的提取，用于制作仿生脂質(zhì)體。3.細(xì)胞膜蛋白的提取細(xì)胞膜的低滲和超速離心提取法，細(xì)胞數(shù)量在1×108-2×109個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞膜的提取，一般采用低滲法處理細(xì)胞，機(jī)械破碎膨脹的細(xì)胞膜，然后通過低速離心(500-1500g)除去較大細(xì)胞器，如線粒體和細(xì)胞核，將上清收集后進(jìn)一步采用超高速離心法分離細(xì)胞膜，超高速離心常采用蔗糖梯度或者Percoll梯度密度離心，或者二者混合梯度離心，細(xì)胞膜一般分布在上層區(qū)、低密度區(qū)(38％層上和43-53％密度交界層)。該法的細(xì)胞膜蛋白回收率在40-70％，混有少量的細(xì)胞器膜。收集的細(xì)胞膜沉淀可以放置-80℃冰箱一個(gè)月，液氮罐蒸汽中可以放置3個(gè)月到3年，可用于后續(xù)的細(xì)胞膜脂質(zhì)體的制備，該法提取的蛋白混有來自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜蛋白的污染，少量高爾基體和線粒體的膜蛋白污染。植物凝集素磁珠法提取細(xì)胞膜：利用細(xì)胞膜蛋白具有很高的糖基化原理，可以使用一些特殊的糖基結(jié)合蛋白來純化細(xì)胞膜，使用植物凝集素來吸附細(xì)胞膜，比如WGA、刀豆蛋白A(ConA)等。把植物凝集素ConA偶聯(lián)到磁珠后，就可以使用磁珠沉淀細(xì)胞膜，最后用過量的甘露糖、葡萄糖競爭性與磁珠的ConA結(jié)合，可把結(jié)合的細(xì)胞膜蛋白置換，從而洗脫細(xì)胞膜蛋白。細(xì)胞的裂解可采用低滲法和等滲法，采用電動(dòng)或者手動(dòng)勻漿器勻漿，低速離心后的細(xì)胞膜上清液直接進(jìn)行細(xì)胞膜的提取，細(xì)胞膜的回收率在25-75％，平均為30-40％左右，但細(xì)胞膜的純度是梯度密度分離法所不能比擬的，大大減小了細(xì)胞器膜污染細(xì)胞膜的機(jī)會(huì)，優(yōu)先采用植物凝集素磁珠法提取細(xì)胞膜用于細(xì)胞膜仿生脂質(zhì)體的膜蛋白來源。1×107-1×108個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞膜的小量提取，可采用植物凝集素磁珠試劑盒提取，相關(guān)產(chǎn)品有Qproteome質(zhì)膜蛋白分離試劑盒(Qiagen)或者類似分離機(jī)制的試劑盒MinuteTM質(zhì)膜蛋白分離試劑盒(InventBiotechnologies)。4.細(xì)胞膜脂質(zhì)體制備和藥物裝載可以采用逆向蒸發(fā)法、薄膜法、梯度反向裝載法、超聲法和雙乳化法等，本專利優(yōu)先采用薄膜法進(jìn)行制備細(xì)胞膜脂質(zhì)體，由于該法具有相對(duì)較小的脂質(zhì)體粒徑和較高的藥物包封率。另外為了除去較大粒徑的脂質(zhì)體，制作的脂質(zhì)體還要經(jīng)過高分子膜過濾、擠壓等方法，獲得粒徑更小的脂質(zhì)體。為了增加細(xì)胞膜蛋白脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，降低調(diào)理作用,減少肝臟巨噬細(xì)胞的吞噬，表面可作特殊化學(xué)修飾，如聚乙二醇(PEG)修飾，在制作脂質(zhì)體薄膜的時(shí)候添加偶聯(lián)PEG的脂分子?？扇苄运幬铮喊鼓[瘤藥物、抗炎癥藥物、治療自身免疫性的藥物、化學(xué)小分子、中藥活性成份、siRNA或者miRNA藥物以及一些佐劑成份，另外一些編碼的特定調(diào)控基因、毒性蛋白、編碼shRNA的質(zhì)粒，也可以包裝入DC仿生脂質(zhì)體。脂溶性藥物：上述方法可以制得裝載可溶性藥物的細(xì)胞仿生脂質(zhì)體，也可以制作脂溶性藥物的細(xì)胞仿生脂質(zhì)體，也可以制作二者的混合型細(xì)胞仿生脂質(zhì)體。編碼腫瘤相關(guān)抗原或者腫瘤特異性抗原的基因，如AFP2、WT1、hTERT、Her2、Her3、IDH1、IDH2、TP53、EGFR、EGFRvIII、EGFR(T790M)、EGFR(L858R)、EGFR(L861Q)、EGFR(A767-C775)、K-Ras、N-RAS、EML4-ALK、HER3(V104R)、B-RAF(V600E)、BRCA1、BRCA1、BRCA2、c-Kit、c-MYC、PDGFRA、cMET、MAP2K4、CETN3、SKP1、CDK12、PAK1、PTK2、RIPK2、TLK2、PIK3CA、GNAS,GNAI2、GNAQ、MRE11、APC、MLL1、MLL2、MLL3、RASA1、DPC4、ATM、CDKN2A、EPCAM、MLH1、MSH2、MSH6、PALB2、PMS2、STK11、PRSS1、SPINK1、ARID1A、VCAM1、CDK14、JAK1、β-Catenin、VHL、CEA、MEN1、Ret、BRG1、CDH1、SOX4、PTEN、MLH1、RB1、RUNX3、E2F-1、CRTC1、H-RAS、PRKCA、CDK4、TSHR、AIP、BAP1、BCL-XL、PRAME、FLT3-ITD、JAK2、NPM1、TK、DNMT3A、CEBPA、PTPN11、PRPS1、SEMA3B、SEMA3F、KLF6、XRCC4、ATMPI3K、TP73、TP63、SMAD4、ING1、PBRM1、CDKN2B、CDKN1A、PAK1等基因的相關(guān)突變，但不僅限于上述腫瘤相關(guān)基因及突變構(gòu)建的質(zhì)?；蛘叨嚯木捎糜贒C仿生脂質(zhì)體的裝載；也可以共同表達(dá)可溶性CD40L、可溶性FLT3LG、GM-CSF、共刺激分子CD80、CD86和CD83等，以提高抗原的敏感性；DC仿生脂質(zhì)體裝載物可以是病人腫瘤細(xì)胞的腫瘤抗原提取物、腫瘤細(xì)胞系的提取物或者細(xì)胞反復(fù)凍融產(chǎn)物、紫外照射后的細(xì)胞產(chǎn)物、超聲波破碎的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)物、弱酸洗脫的腫瘤細(xì)胞表面提呈多肽；為增加抗原的致敏能力和DC的提呈能力，常規(guī)的免疫佐劑也可以裝載到仿生脂質(zhì)體內(nèi)，如卡介苗、正霍亂毒素的B亞單位CTB、單磷?；|(zhì)A(MPLA)、KLH、左旋咪唑、Detox和短小棒狀桿菌佐劑等；編碼病毒的RNA也可以作為一類特殊免疫佐劑裝載DC仿生脂質(zhì)體內(nèi)；化學(xué)免疫調(diào)劑也可裝載如脂質(zhì)體中，增加DC細(xì)胞的免疫活性，比如黃芪多糖、靈芝多糖、姜黃素、人參皂苷、丹皮酚、雷公藤甲素、PolyI:C等。這種仿生脂質(zhì)體的治療方法省去了DC細(xì)胞的體外致敏過程，可以靈活多樣的針對(duì)病人進(jìn)行多種仿生DC脂質(zhì)體疫苗的治療操作，可以多次、多種類型的DC疫苗的強(qiáng)化免疫，以提高病人的抗腫瘤細(xì)胞的CTL能力。該類DC仿生脂質(zhì)體可用于治療特定腫瘤和慢性炎癥。一些脂質(zhì)體可以添加磁性納米顆粒，增加靶向性。肺部吸入型的DC疫苗，可以增加膽固醇的比例，以增加脂質(zhì)體的韌性和防止藥物滲漏，如二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、1,2-二油?；字Ｄ憠A(DOPC)、膽固醇，如比例(5:1:2:3或者5:1:2:4或者5:1:2:5)溶于氯仿：甲醇(3:1或者2:1或者1:1，V/V)。附圖說明圖1為細(xì)胞永生化質(zhì)粒讀碼框模式圖；圖2為DC仿生脂質(zhì)體包封質(zhì)粒的讀碼框模式圖；圖3為未包封藥物的仿生DC脂質(zhì)體的粒徑圖；圖4為脂質(zhì)體的細(xì)胞膜整合蛋白測定；圖5為DC仿生脂質(zhì)體藥物包封率測定；圖6為不同K-ras仿生脂質(zhì)體疫苗藥物誘導(dǎo)DC細(xì)胞的體外分化和成熟(標(biāo)志CD83的流式細(xì)胞測定)；圖7為不同K-ras仿生脂質(zhì)體疫苗藥物誘導(dǎo)DC細(xì)胞的體外分化和成熟(標(biāo)志CD86的流式細(xì)胞測定)；圖8為不同K-ras仿生脂質(zhì)體疫苗誘導(dǎo)的DC細(xì)胞所致敏的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性測定(IL-12的分泌測定)；圖9為不同K-ras仿生脂質(zhì)體疫苗誘導(dǎo)的DC細(xì)胞所致敏的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性測定(IFN-γ的分泌測定)；圖10為不同K-ras仿生脂質(zhì)體疫苗誘導(dǎo)的DC細(xì)胞所致敏的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性測定(TNF-α的分泌測定)；圖11為MUC1仿生脂質(zhì)體疫苗誘導(dǎo)的DC細(xì)胞的分化和成熟測定(標(biāo)志CD86的流式細(xì)胞測定)；圖12為MUC1仿生脂質(zhì)體疫苗誘導(dǎo)的DC細(xì)胞所致敏的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性測定(IFN-γ的分泌測定)；圖13為S/MAR序列對(duì)仿生脂質(zhì)體疫苗質(zhì)粒的影響(T細(xì)胞毒性IFN-γ的分泌測定)。具體實(shí)施方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。(1)血液單核細(xì)胞PBMC的分離、培養(yǎng)10ml注射器用肝素抗凝處理，抽取患者或者健康者5-10ml血。將PBS或生理鹽水與血1：1混合；取10mlFICOLL加入另一50ml離心管，將PBS或生理鹽水與血的混合液沿管壁緩慢加入，速度要輕，保證兩者之間有清晰界面。搖擺轉(zhuǎn)頭1300-1800rpm離心30min，巴氏管或者毛細(xì)管緩慢吸取白色細(xì)胞層，轉(zhuǎn)入另一個(gè)15ml離心管，加入3-5mlPBS或生理鹽水，1000-1500rpm離心10min。棄上清液，加入10mlPBS，混勻后1400rpm離心10min；再棄上清液，加入10mlPBS，混勻后1400rpm離心10min，如此重復(fù)3次；計(jì)數(shù)細(xì)胞，1-5X106細(xì)胞/ml接種，接種于培養(yǎng)瓶中，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h后吸出培養(yǎng)基，用37℃預(yù)熱的培養(yǎng)基清洗3遍，除去未貼壁的細(xì)胞，貼壁細(xì)胞即為單核細(xì)胞，培養(yǎng)基為完全的RPMI-1640和雙抗，并添加10％人AB血清或者1％的Nutridoma-SP(Sigma或者Invitrogen)。(2)慢病毒的包裝帶有抗性篩選基因的慢病毒表達(dá)載體，與第二代或者第三代慢病毒包裝載體按比例混合，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，如陽離子脂質(zhì)體或者陽離子聚合物類型的轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染48小時(shí)和72小時(shí)后分別收集上清，混合，離心除去細(xì)胞碎片，測定病毒的效價(jià)，短期放4℃待用或者-80℃凍存?zhèn)溆茫徊《究山?jīng)過60000-120000g于4℃超高速離心1-6小時(shí)，沉淀用無鈣鎂的緩沖液PBS溶解備用或者-80℃凍存。(3)hTERT、SV40-LT和/或c-MYC的質(zhì)粒圖和PBMC的永生化構(gòu)建P2A等間隔的hTERT(GenBank:NM_198253)、SV40大T抗原(GenBank:J02400.1)和/或C-MYC(GenBank:NM_002467)共表達(dá)質(zhì)粒，如圖1，質(zhì)?？蛇x用病毒表達(dá)載體，優(yōu)先選用慢病毒表達(dá)載體或者腺病毒表達(dá)載體，病毒采用第三代病毒包裝系統(tǒng)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞為293T，收集轉(zhuǎn)染后48小時(shí)和72小時(shí)后的上清液，離心處理，經(jīng)過初步的1：3-1:20的稀釋，感染HELA細(xì)胞，1μg/ml嘌呤霉素篩選法，確定病毒的最佳稀釋倍數(shù)為1:3-5。2X106PBMC使用RPMI-1640完全培養(yǎng)基和雙抗培養(yǎng)，培養(yǎng)貼壁后的第二天或者第三天，接種1:6稀釋的病毒進(jìn)行感染，并添加10％人AB血清或者1％的Nutridoma-SP(Sigma或者Invitrogen)。24小時(shí)后，細(xì)胞開始使用0.4-1μg/ml嘌呤霉素篩選，最初的幾天嘌呤霉素的添加采取間隔1-2天的方式添加，防止細(xì)胞死亡過多而影響細(xì)胞的生長狀態(tài)。穩(wěn)定生長的細(xì)胞克隆，可以采用槍頭吸附法，逐一吸取到24孔板中繼續(xù)放大培養(yǎng)，并作表面標(biāo)志的鑒定，DC細(xì)胞通常的細(xì)胞表面標(biāo)志為CD11c+、CD1c+、CD123-，而CD80、CD86、CD83的表達(dá)上調(diào)和CD14的表達(dá)下調(diào)是其成熟標(biāo)志。(4)DC細(xì)胞的質(zhì)粒抗原的構(gòu)建：以pUC來源的質(zhì)粒為基礎(chǔ)，帶有一個(gè)病毒或者人的基因強(qiáng)啟動(dòng)子，如帶有CMV、SV40、EF-1、α-actin、β-actin、UBC、PGK等啟動(dòng)子元件，也可以用于shRNA啟動(dòng)的U6等啟動(dòng)子，其中優(yōu)選CMV啟動(dòng)子，該質(zhì)粒還含有一個(gè)較強(qiáng)的終止子，如牛生長激素的終止子BGH-PA，啟動(dòng)子和終止子之間的多克隆位點(diǎn)連有基因編碼序列或者編碼多肽疫苗的DNA序列。其中編碼序列包括抗原提呈和DC成熟相關(guān)的共激活因子的序列、激活因子、細(xì)胞因子編碼序列、以及編碼抗原相關(guān)的DNA序列。共激活因子和激活因子包括CD80(GenBank：NM_005191)、CD86(GenBank：NM_175862)的全長分子，以及編碼CD40L的細(xì)胞外可溶性結(jié)構(gòu)域(ECD)編碼框(aa113-261)(SeqIDNo.5)和FLT3LG(GenBank：NM_001204502)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)的編碼框(aa1-168)(SeqIDNo.4)，細(xì)胞因子如GM-CSF(GenBank：NM_000758)等；另外腫瘤相關(guān)的抗原，我們選擇了K-ras(G12)位點(diǎn)突變，如G12V的突變多肽序列(aa5-17)，另外選擇MUC1(GenBank：J05582.1,Uniprot：P15941-1)的細(xì)胞外重復(fù)序列，如編碼aa101-160的核酸序列SeqIDNo.8，以及根據(jù)MUC1重復(fù)序列而人工合成的MUC1短肽，如序列和SeqIDNo.6和SeqIDNo.7。這些序列之間插入自切肽的編碼序列，如編碼P2A的自切肽序列(SeqIDNo.1)。分泌性sCD40LG序列除去了CD40LG的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，只保留了aa113-261，為了能夠分泌，添加了一個(gè)信號(hào)肽，本序列使用了CD8的信號(hào)肽，如SeqIDNo.5。所有序列均采用人工合成片段和拼接的方法獲得全長片段，將片段插入載體。作為一種優(yōu)選，為了增加靶質(zhì)粒的長時(shí)間表達(dá)，添加基因組非整合元件S/MAR。以上質(zhì)粒的編碼和調(diào)控序列設(shè)計(jì)如圖2。(5)DC細(xì)胞的誘導(dǎo)永生化的細(xì)胞克隆，鑒定CD11c和CD1c陽性的細(xì)胞克隆，并放大培養(yǎng)，使用RPMI-1640完全培養(yǎng)基和雙抗培養(yǎng)，并添加10％人AB血清或者1％的Nutridoma-SP(Sigma或者Invitrogen)培養(yǎng)，常用的誘導(dǎo)方法是先用GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)成為不成熟DC細(xì)胞，然后使用LPS、IFN-γ進(jìn)一步誘導(dǎo)成熟。第一天PBMC加入2000IU/mLIL-4、2000IU/mLGM-CSF，第3天再加2000IU/mLIL-4和2000IU/mLGM-CSF，第4天開始誘導(dǎo)DC成熟，加入100ng/mLLPS和1000IU/mLIFN-γ，誘導(dǎo)1-2天，2mMEDTA-PBS冰上消化細(xì)胞。也可使用IL-1β(25ng/ml)、IFN-α(1000IU/ml)、IFN-γ(1000IU/ml)和PGE2(1μg/ml)誘導(dǎo)1-2天。(6)未成熟型DC細(xì)胞的細(xì)胞膜提取(植物凝集素ConA磁珠法)：取1ml鏈霉親和素磁珠，放磁力架上，除去其緩沖液，1XPBS洗滌，取150-250μg生物素化的刀豆蛋白A，溶于200μlPBS，將上述磁珠和生物素化的刀豆蛋白A混合，室溫震蕩孵育1-2小時(shí)，PBS洗滌一次，PBS(含1％TritonX-100)洗滌一次，PBS洗滌3次。磁珠懸于50-200μlPBS備用。0.1-10x108細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞刮刮取，離心，PBS洗滌，用低滲溶液(20mMtris、1.5mM的MgCl2、10mMNaCl、pH6.0-6.8，加入適量蛋白酶抑制劑)處理5-10分鐘，離心細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于冷的1XPBS(含蛋白酶抑制劑)，立即勻漿，電動(dòng)勻漿(1500轉(zhuǎn)/分鐘)或者特氟龍勻漿器手動(dòng)勻漿30-60次。1000g離心10分鐘，收集含細(xì)胞膜上清，除去細(xì)胞核和細(xì)胞器碎片沉淀。將上述制備好的磁珠與細(xì)胞膜上清液混合，4℃震蕩孵育1-2小時(shí)，放置磁力架上，除去上清液，用PBS洗滌1-3次，細(xì)胞膜用200μl洗脫液(0.25M甲基-β-D-甘露糖苷溶于1XPBS)孵育10-20分鐘，再重復(fù)洗脫1-2次，取5-10μl溶于含去污劑的蛋白裂解液中，用于測定蛋白濃度。(7)DC仿生脂質(zhì)體的制作和藥物包封薄膜法：二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、1,2-二油?；字Ｄ憠A(DOPC)、膽固醇(AvantiPolarLipids)，按一定比例(6:1:2:3)溶于氯仿：甲醇(3:1或者2:1或者1:1，V/V)，脂溶性的藥物可在此步驟中加入，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸發(fā)溶劑，形成薄層。然后脂質(zhì)薄層復(fù)水，從細(xì)胞中提取的膜蛋白(溶于PBS)以1:100-1:800比例(蛋白：膜脂)加入到薄層中，復(fù)水過程中加入親水性的藥物、腫瘤提取物、細(xì)菌病毒抗原、mRNA、siRNA、質(zhì)粒及免疫佐劑。40-65℃加熱渦旋處理2-6分鐘，重復(fù)2-5次。蛋白在40-65℃下擠過200nm孔徑的醋酸纖維素濾膜或者聚碳酸酯膜，反復(fù)進(jìn)行10-20次，以降低脂質(zhì)體的孔徑和提高脂質(zhì)體的粒徑均勻度，所獲的單層脂質(zhì)體膜泡經(jīng)過半透膜透析過夜純化，或者經(jīng)過SephadexG-50柱或者類似凝膠柱純化，以除去游離的未整合蛋白和雜質(zhì)。對(duì)照脂質(zhì)體的制作，除不添加細(xì)胞膜提取物外，其他步驟、工藝和內(nèi)容物均相同。脂質(zhì)體裝載藥物主要為表達(dá)特異性腫瘤抗原的質(zhì)粒、mRNA、多肽、腫瘤細(xì)胞提取物和siRNA等。對(duì)于質(zhì)粒類裝載成份，為了增強(qiáng)體內(nèi)DC細(xì)胞的成熟，質(zhì)粒還可以同時(shí)編碼CD40L胞外區(qū)(ECD)、FLT3LG胞外區(qū)和GM-CSF的非整合型質(zhì)粒，以增強(qiáng)靶細(xì)胞的抗原提呈能力，質(zhì)粒也可以含CD40L_ECD和FLT3LG_ECD的表達(dá)；為增強(qiáng)DC細(xì)胞的成熟和抗原提呈能力，可以在質(zhì)粒中表達(dá)共激活受體分子CD80、CD86及細(xì)胞因子GM-CSF；Kras突變的表達(dá)序列可以是全長分子，也可以是包括G12突變位點(diǎn)的左側(cè)和右側(cè)多個(gè)氨基酸片段的編碼序列，該片段優(yōu)選圍繞G12突變位點(diǎn)的7-25個(gè)氨基酸的多肽片段，如SeqIDNo.2，也可以是該短肽片段的多次重復(fù)，比如2-10次重復(fù)，也可以是幾種K-RAS的突變短肽的串聯(lián)，人工合成短肽則是圍繞G12突變的7-25個(gè)氨基酸的多肽片段，如SeqIDNo.3，該多肽可以與免疫佐劑共同包裝DC仿生脂質(zhì)體，裝載50-500μg/ml的最終濃度；該仿生脂質(zhì)體可以是人工合成的多肽片段和質(zhì)粒的混合物，比如合成的7-25個(gè)氨基酸的Kras(G12V)突變肽和編碼質(zhì)粒共同裝載仿生脂質(zhì)體，還可以添加免疫佐劑；MUC1的胞外區(qū)在多種腫瘤中存在糖基化不完全的特點(diǎn)，是一個(gè)難得的腫瘤特異性抗原分子，其疫苗可以使用編碼胞外區(qū)重復(fù)序列(不含信號(hào)肽)的序列，比如從第101個(gè)氨基酸開始的胞外區(qū)，含有重復(fù)序列1-10次的區(qū)域用于制作表達(dá)質(zhì)粒；也可以是人工合成的MUC1重復(fù)序列短肽，比如10-20個(gè)aa的短肽，50-500μg/ml的最終裝載濃度。靶向MUC1的仿生脂質(zhì)體中，還可以加入一些佐劑，比如卡介苗或MPLA，以增加抗原提呈能力。對(duì)照脂質(zhì)體為不裝載藥物的DC仿生脂質(zhì)體或者裝載質(zhì)?？蛰d體(Empty)的仿生脂質(zhì)體。該仿生脂質(zhì)體可以裝載化學(xué)藥物小分子或者中藥提取物，如黃芪多糖(100-1000μg/ml)。(8)DC仿生脂質(zhì)體的平均粒徑和Zeta電位包被的DC仿生脂質(zhì)體，使用激光粒度分析儀測定其粒徑和電位，未包封藥物的仿生DC脂質(zhì)體的粒徑圖見圖3，平均粒徑和Zeta電位見表1。表1Empty多肽質(zhì)粒多肽/質(zhì)粒黃芪多糖平均粒徑129127124122131Zeta電位-14.9-14.6-13.7-13.915.4(9)膜蛋白整合脂質(zhì)體的熒光密度測定1μg/mlAlexaFluor555偶聯(lián)的WGA溶于1XPBS，測定仿生脂質(zhì)體膜上的糖蛋白，空白脂質(zhì)體作為對(duì)照，室溫孵育10-20分鐘，然后通過透析除去游離的WGA，然后熒光光度法(540-560nm)測定熒光強(qiáng)度，見圖4，顯示細(xì)胞膜蛋白整合進(jìn)入了脂質(zhì)體。(10)DC仿生脂質(zhì)體的包封率檢測載藥量的計(jì)算是通過計(jì)算總的藥物量減去上清中游離藥物量后除以總量的百分比來計(jì)算，通過12000g-20000g離心10-30分鐘，獲得脂質(zhì)體離心后的上清液中的游離藥物；也可以計(jì)算沉淀中的藥物量，除以總量的百分比，非仿生脂質(zhì)體包被的藥物作為對(duì)照。質(zhì)粒的包封率，18000g離心20分鐘后，分別取上清和沉淀，利用酚/氯仿抽提法處理，18000g離心20分鐘后取上清，加1/10-1/203M醋酸鋰-20℃沉淀1小時(shí)，18000g離心30分鐘，收集沉淀，溶于1XTE溶液中，測定A260比值，計(jì)算DNA含量，包封率計(jì)算：初始總量減去上清中的DNA總量后除以總量的百分比。黃芪多糖仿生脂質(zhì)體1ml，12000g-20000g離心10-30分鐘，沉淀為黃芪多糖脂質(zhì)體，稀釋至2ml，采用蒽酮法測定上清液和/或沉淀物的吸光度，包封率為加入藥物總量減去上清藥物總量后的結(jié)果除以藥物總量的百分率。質(zhì)粒、多肽、黃芪多糖的包封率見圖5，結(jié)果顯示DC仿生脂質(zhì)體的包封率較非仿生脂質(zhì)體略低，但是均達(dá)到50％以上，顯示了較少的包封率。(11)裝載編碼腫瘤特異性的抗原和激活因子的質(zhì)粒的DC仿生脂質(zhì)體的體外提呈第一天PBMC加入2000IU/mLIL-4、2000IU/mLGM-CSF(Peprotech)，第3天再加2000IU/mLIL-4和2000IU/mLGM-CSF，第4天開始誘導(dǎo)DC成熟，事先準(zhǔn)備好裝載質(zhì)?；蛘哔|(zhì)粒/短肽或者質(zhì)粒/短肽/佐劑的DC仿生脂質(zhì)體，未裝載藥物的仿生脂質(zhì)體作為對(duì)照，將誘導(dǎo)的DC細(xì)胞中加入K-RAS(G12V)短肽裝載的DC細(xì)胞膜仿生脂質(zhì)體37℃孵育1小時(shí)，然后加入20ng/ml可溶性CD40L(sCD40L)繼續(xù)誘導(dǎo)24小時(shí)，備用。從健康志愿者體內(nèi)抽血，分離T淋巴細(xì)胞，跟上述抗原致敏的DC細(xì)胞混合培養(yǎng)，效靶比5-20:1，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選10:1，添加10ng/mlIL-17，繼續(xù)培養(yǎng)5天，再加入20U/mlIL-2培養(yǎng)2天，收獲效應(yīng)性T細(xì)胞備用，成熟的DC細(xì)胞則用于測定細(xì)胞表面成熟標(biāo)志CD83(FITC-anti-CD83，BDPharmingen)和CD86(PE-anti-CD86，BDPharmingen)，見圖6-圖7，結(jié)果顯示K-RAS(G12V)短肽激活了DC，提高了CD83和CD86的表達(dá)，而卡介苗或MPLA進(jìn)一步增強(qiáng)了突變體短肽的抗原提呈能力，而短肽、編碼短肽的質(zhì)粒和卡介苗等佐劑的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)DC的激活具有增效作用。(12)ELISA檢測K-Ras(G12V)抗原提呈后的效應(yīng)T細(xì)胞的細(xì)胞毒性：1x105-5x105K-RAS(G12V)致敏的效應(yīng)T細(xì)胞以及對(duì)照致敏的T細(xì)胞，分別加入事先接種K-RAS(G12V)突變細(xì)胞株P(guān)ANC-1的96孔板中，37℃培養(yǎng)12小時(shí)，收集上清，人IL-12/P70ELISA試劑盒(eBioScience)、IFN-γ(PeproTech)、TNF-αELISA檢測試劑盒(PeproTech)檢測K-Ras(G12V)抗原提呈的效應(yīng)T細(xì)胞的細(xì)胞因子釋放，ELISA步驟按生產(chǎn)商提供的說明書操作，結(jié)果見圖8-圖10，結(jié)果顯示結(jié)果顯示K-RAS(G12V)短肽激活了DC，提高了CD83和CD86的表達(dá)，而卡介苗或MPLA進(jìn)一步增強(qiáng)了對(duì)T細(xì)胞致敏能力和細(xì)胞毒性，而短肽、編碼短肽的質(zhì)粒和卡介苗等佐劑的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)DC的激活和T細(xì)胞的致敏具有增效作用。(13)MUC1仿生脂質(zhì)體的抗原提呈和T細(xì)胞活化分析第一天PBMC加入2000IU/mLIL-4、2000IU/mLGM-CSF，第3天再加2000IU/mLIL-4和2000IU/mLGM-CSF，第4天開始誘導(dǎo)DC成熟，事先準(zhǔn)備好裝載質(zhì)?；蛘哔|(zhì)粒/短肽或者質(zhì)粒/短肽/佐劑的DC仿生脂質(zhì)體，未裝載藥物的仿生脂質(zhì)體作為對(duì)照，將誘導(dǎo)的DC細(xì)胞中加入裝載MUC1細(xì)胞外重復(fù)區(qū)編碼質(zhì)粒的仿生脂質(zhì)體，37℃孵育3小時(shí)，然后加入20ng/ml可溶性CD40L(sCD40L)繼續(xù)誘導(dǎo)24小時(shí)，備用。從健康志愿者體內(nèi)抽血，分離T淋巴細(xì)胞，跟上述抗原致敏的DC細(xì)胞混合培養(yǎng)，效靶比5-20:1，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選10:1，添加10ng/mlIL-17，繼續(xù)培養(yǎng)5天，再加入20U/mlIL-2培養(yǎng)2天，收獲效應(yīng)性T細(xì)胞備用，收集DC細(xì)胞用于測定表面標(biāo)志CD86(圖11)。與MUC1陽性的人胰腺癌腫瘤PanC1細(xì)胞孵育，96孔板中加入1x104MUC1陽性的靶腫瘤細(xì)胞PanC1貼壁后，加入P2、P4、P6質(zhì)?；蛘吲cMUC1短肽2共同包封脂質(zhì)體致敏的1x105致敏的T效應(yīng)細(xì)胞，效靶比10:1，孵育12小時(shí)后，收集上清液，EILSA檢測上清液中的IFN-γ含量(圖12)。結(jié)果顯示MUC1胞外區(qū)重復(fù)序列短肽激活了DC，提高了DC細(xì)胞的CD86的表達(dá)，編碼重復(fù)區(qū)序列的質(zhì)粒進(jìn)一步增強(qiáng)了對(duì)T細(xì)胞致敏能力和細(xì)胞毒性，而短肽、編碼短肽的質(zhì)粒的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)DC的激活和T細(xì)胞的致敏具有增效作用。(13)S/MAR元件對(duì)抗原提呈的影響第一天PBMC加入2000IU/mLIL-4、2000IU/mLGM-CSF，第3天再加2000IU/mLIL-4和2000IU/mLGM-CSF，第4天開始加入仿生脂質(zhì)體，包括包封P5、P5SM、P6、P6SM和包未裝載藥物的仿生脂質(zhì)體作為對(duì)照，37℃孵育3小時(shí)，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)5天；然后加入20ng/ml可溶性重組CD40L(sCD40L)繼續(xù)誘導(dǎo)24小時(shí)，備用。從健康志愿者體內(nèi)抽血，分離T淋巴細(xì)胞，跟上述抗原致敏的DC細(xì)胞混合培養(yǎng)，效靶比10:1，添加10ng/mlIL-17，繼續(xù)培養(yǎng)5天，再加入20U/mlIL-2培養(yǎng)2天，收獲效應(yīng)性T細(xì)胞備用。96孔板中加入1x104靶腫瘤細(xì)胞PanC1，貼壁后，加入的1x105致敏的T效應(yīng)細(xì)胞，效靶比10:1，孵育12小時(shí)后，收集上清液，EILSA檢測上清液中的IFN-γ含量(圖13)。結(jié)果顯示帶有S/MAR序列的質(zhì)粒隨著細(xì)胞的增殖，依然表現(xiàn)了較強(qiáng)的DC細(xì)胞激活能力，而無S/MAR的質(zhì)粒，隨著細(xì)胞的傳代，激活DC細(xì)胞的能力降低和致敏T細(xì)胞的能力降低。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出：對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)，這些改進(jìn)應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3