本發(fā)明涉及藍(lán)花側(cè)金盞有效部位及其制備方法和應(yīng)用，屬于植物提取物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

藍(lán)花側(cè)金盞Adonis coerulea Maxim屬毛茛科側(cè)金盞花屬多年生草本植物、高3~15 cm，分布于我國(guó)西藏、四川、青海和甘肅海拔3350~5200m的高山草地或灌叢,為藏藥系統(tǒng)中廣泛使用的用于治療瘡瘍及牛皮癬的藥材[參見(jiàn)：中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志[M].北京科學(xué)出版社,1980.]?！恫厮幹尽酚涊d藍(lán)花側(cè)金盞藥用全草“苦、寒、外用治瘡瘍、癤癰、庖疹、疥癬和牛皮癬”[參見(jiàn)：楊永昌,藏藥志[M]，青海人民出版社,1991]。藍(lán)花側(cè)金盞Adonis coerulea Maxim的相關(guān)活性尚處在空白中。藍(lán)花側(cè)金盞Adonis coerulea Maxim的化學(xué)成分研究從上個(gè)世紀(jì)九十年代開(kāi)始，化學(xué)成分主要有葒草素、側(cè)金盞醇、異葒草苷、木犀草素、芹菜素和胡蘿卜苷等[參見(jiàn)：1、戴 源，張蓓蓓，許柚，等.藍(lán)花側(cè)金盞化學(xué)成分的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2010,22（4）594-596.2、張惠迪，張殊佳，陳耀祖.藏藥藍(lán)花側(cè)金盞化學(xué)成分的研究[J].蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1991（2）:88-92]等。

腫瘤是危害人類(lèi)健康的重大疾病之一，惡性腫瘤的防治已成為醫(yī)學(xué)界所關(guān)注的重要課題。惡性腫瘤就是人們所說(shuō)的癌癥。癌癥是危害人類(lèi)健康的重大疾病之一，惡性癌細(xì)胞的防治已成為醫(yī)學(xué)界所關(guān)注的重要課題。癌癥作為目前人類(lèi)死亡的首要原因，對(duì)其治療仍局限于癌癥疾病的多樣性及反復(fù)性。然而，盡管不同的癌癥的致癌原因可能不盡相同，但其組織觀察均表現(xiàn)出相似的細(xì)胞周期紊亂以及迅速不可控制的細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。因此，對(duì)參與細(xì)胞周期調(diào)控的一些家族蛋白的研究在推動(dòng)癌癥治療中成為重要因素。組蛋白去乙?；福℉DAC）是一類(lèi)蛋白酶，對(duì)染色體的結(jié)構(gòu)修飾和基因表達(dá)調(diào)控發(fā)揮著重要的作用。一般情況下，組蛋白的乙?；欣贒NA與組蛋白八聚體的解離，核小體結(jié)構(gòu)松弛，從而使各種轉(zhuǎn)錄因子和協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子能與DNA結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合，激活基因的轉(zhuǎn)錄。在癌細(xì)胞中，HDAC的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致去乙酰化作用的增強(qiáng)，通過(guò)恢復(fù)組蛋白正電荷，從而增加DNA與組蛋白之間的引力，使松弛的核小體變得十分緊密，不利于特定基因的表達(dá)，包括一些腫瘤抑制基因。組蛋白去乙?；敢种苿╤istone deacetylase inhibitors，HDACi）則可通過(guò)提高染色質(zhì)特定區(qū)域組蛋白乙?；瑥亩{(diào)控細(xì)胞凋亡及分化相關(guān)蛋白的表達(dá)和穩(wěn)定性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及分化，成為一類(lèi)新的抗腫瘤藥物。HDACi不僅對(duì)多種血液系統(tǒng)腫瘤和實(shí)體瘤具有良好的治療作用，而且具有腫瘤細(xì)胞相對(duì)較高選擇性和低毒的優(yōu)點(diǎn)。

申請(qǐng)人在研究中發(fā)現(xiàn)：目前抗腫瘤藥物的原料較少，特別是用于制備抑制HDAC1酶藥物的中藥原料較為匱乏?，F(xiàn)有技術(shù)中主要用于治療瘡瘍及牛皮癬。目前，尚未見(jiàn)到關(guān)于藍(lán)花側(cè)金盞抑制HDAC1酶的活性方面的研究和應(yīng)用的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是：克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供藍(lán)花側(cè)金盞有效部位及其制備方法和應(yīng)用，該藍(lán)花側(cè)金盞有效部位能有效抑制HDAC1酶的活性，用于制備抑制HDAC1酶藥物，具有較好的抗腫瘤作用。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：該藍(lán)花側(cè)金盞有效部位，其特征在于：選自藍(lán)花側(cè)金盞石油醚部位、藍(lán)花側(cè)金盞乙酸乙酯部位、藍(lán)花側(cè)金盞正丁醇部位、藍(lán)花側(cè)金盞水相萃取部位中的一種或兩種以上的任意質(zhì)量比的混合物。

該藍(lán)花側(cè)金盞有效部位，其特征在于：選自藍(lán)花側(cè)金盞乙酸乙酯部位，或者藍(lán)花側(cè)金盞乙酸乙酯部位和藍(lán)花側(cè)金盞水相萃取部位任意質(zhì)量比的混合物。

該藍(lán)花側(cè)金盞有效部位的制備方法，其特征在于，包括下述步驟：將藍(lán)花側(cè)金盞全草粉碎，加入質(zhì)量百分比濃度65%~95%乙醇溶液提取，將所得提取液濃縮、干燥，得浸膏；將浸膏加蒸餾水分散，得浸膏分散液，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作為溶劑萃取浸膏分散液，揮去溶劑后得藍(lán)花側(cè)金盞石油醚部位、藍(lán)花側(cè)金盞乙酸乙酯部位和藍(lán)花側(cè)金盞正丁醇部位；將萃取后的浸膏分散液濃縮、干燥，得藍(lán)花側(cè)金盞水相萃取部位。

優(yōu)選的，所述的提取為超聲波輔助回流提取，超聲波輔助回流提取的具體操作為：將粉碎后的藍(lán)花側(cè)金盞全草加入質(zhì)量百分比濃度65%~95%乙醇溶液超聲波提取0.5~3小時(shí)，過(guò)濾，濾渣回流提取1~3次，合并提取液，即得。

該藍(lán)花側(cè)金盞有效部位的應(yīng)用，其特征在于：在制備抑制HDAC1酶藥物方面的應(yīng)用。

所述抑制HDAC1酶藥物是通過(guò)藍(lán)花側(cè)金盞石油醚部位、藍(lán)花側(cè)金盞乙酸乙酯部位、藍(lán)花側(cè)金盞正丁醇部位和藍(lán)花側(cè)金盞水相萃取部位中的一種或兩種以上的任意質(zhì)量比的混合物，與藥用輔料混合制成的口服制劑或注射制劑。

所述的注射制劑為脂質(zhì)體注射劑、納米粒注射劑或微球注射劑。

所述的口服制劑為散劑、片劑、顆粒劑、膠囊劑或溶液劑。

對(duì)于本發(fā)明的說(shuō)明如下：

現(xiàn)有技術(shù)中，藍(lán)花側(cè)金盞常規(guī)用途為用于治療瘡瘍及牛皮癬，未見(jiàn)其有抗腫瘤功效的相關(guān)報(bào)道。申請(qǐng)人研究發(fā)現(xiàn)：目前抗腫瘤藥物的原料較為匱乏，現(xiàn)有技術(shù)中藍(lán)花側(cè)金盞中的部分提取物還具有抗腫瘤的作用，但是其功效不明顯，不能確定其具體的有效部位。因此通過(guò)怎樣的溶劑、采用怎樣制備方法，才能獲得抑制HDAC1酶活性效果最好的有效部位，是必須要解決的問(wèn)題。申請(qǐng)人通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)：采用本發(fā)明制備方法，篩選出的藍(lán)花側(cè)金盞石油醚部位、藍(lán)花側(cè)金盞乙酸乙酯部位、和藍(lán)花側(cè)金盞水相萃取部位，其抑制HDAC1酶效果較好。

制備方法中，所述的超聲波提取為常溫下進(jìn)行。具體的，超聲波提取后，過(guò)濾獲得超聲波提取液和濾渣，向?yàn)V渣中加質(zhì)量百分比濃度65%~95%乙醇溶液回流提取1~3次，合并超聲波提取和回流提取所得提取液?；亓魈崛?~3次是指：向回流加熱裝置中加入粉碎后的藥材和乙醇溶液，加熱、回流提取，放冷過(guò)濾得一次提取液和藥渣；向藥渣中加入乙醇溶液，加熱、進(jìn)行第二次回流提取，放冷過(guò)濾得二次提取液和藥渣；合并多次提取液，即得回流提取的提取液。優(yōu)選的，每次回流提取0.5~2小時(shí)；每次回流提取時(shí)所加乙醇溶液沒(méi)過(guò)藥材表面1cm~2cm?；亓魈崛〉臏囟葹橐掖蓟亓魈崛〉某Ｒ?guī)溫度，需高于乙醇的沸點(diǎn)，優(yōu)選為80℃~100℃。

制備方法中，浸膏為粗提取物，采用不同的溶劑萃取浸膏分散液，指的是依次將石油醚加入浸膏分散液萃取分離獲得石油醚萃取液、將乙酸乙酯加入浸膏分散液萃取分離獲得乙酸乙酯萃取液、將正丁醇加入浸膏分散液萃取分離獲得正丁醇萃取液；取石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液分別揮發(fā)去除溶劑后，即對(duì)應(yīng)得到藍(lán)花側(cè)金盞石油醚部位、藍(lán)花側(cè)金盞乙酸乙酯部位和藍(lán)花側(cè)金盞正丁醇部位；將萃取后剩余的浸膏分散液（溶劑為水），揮發(fā)去除溶劑即得藍(lán)花側(cè)金盞水相萃取部位。溶劑的部位指的是該溶劑的萃取物，水相萃取部位也可以稱(chēng)作水相萃取物，水相萃取部位易溶于水；而相對(duì)的，石油醚、乙酸乙酯和正丁醇為有機(jī)相，石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位對(duì)應(yīng)易溶于石油醚、乙酸乙酯和正丁醇。其中，藍(lán)花側(cè)金盞石油醚部位主要含有脂肪酸類(lèi)；藍(lán)花側(cè)金盞乙酸乙酯部位主要含有黃酮類(lèi)；藍(lán)花側(cè)金盞正丁醇部位主要含有苷類(lèi)；藍(lán)花側(cè)金盞水相萃取部位主要含有多糖和有機(jī)酸類(lèi)化合物。揮去溶劑即揮發(fā)去除溶劑。揮去溶劑可以采用常壓加熱使溶劑（即石油醚、乙酸乙酯和正丁醇）揮發(fā)。優(yōu)選的，揮去溶劑采用減壓濃縮，該方法效率高，并且能避免熱敏性成分因高溫喪失藥性。

優(yōu)選的，制備的抑制HDAC1酶藥物，為口服制劑或注射制劑。口服制劑和注射制劑為最佳給藥途徑，此處所述口服制劑為經(jīng)腸胃道給藥制劑，優(yōu)選的，口服制劑為緩釋、控釋型口服制劑。也可以為非腸胃給藥的其他，如呼吸道給藥制劑（噴霧劑、氣霧劑、粉霧劑）；皮膚給藥制劑（外用溶液劑、洗劑、搽劑、軟膏劑、硬膏劑、糊劑、貼劑）；膜給藥制劑（滴眼劑、滴鼻劑、眼用軟膏、含漱劑、舌下片劑）；腔道給藥制劑（栓劑）。注射制劑可以為常規(guī)注射制劑。根據(jù)藥物傳遞系統(tǒng)進(jìn)行分類(lèi)，優(yōu)選的，本發(fā)明的注射制劑為脂質(zhì)體注射劑、納米粒注射劑或微球注射劑；其他的，本發(fā)明的注射劑還可以為微囊注射劑、聚合物膠束注射劑、微乳或亞微乳注射劑、亞微粒注射劑或凝膠注射劑，以上藥物傳遞系統(tǒng)的注射劑能延長(zhǎng)藥物載體在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間、延長(zhǎng)載藥微粒在吸收部位的停留時(shí)間、控制藥物在釋放初期的突釋效應(yīng)。藥用輔料包括藥物載體，以及溶劑、增溶劑、助溶劑、乳化劑、助懸劑、澄清劑、反絮凝劑、矯味劑、著色劑、防腐劑、化學(xué)滅菌劑、吸附劑、助濾劑、抗氧劑、pH調(diào)節(jié)劑、等滲調(diào)節(jié)劑、稀釋劑、粘合劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、助流劑、抗粘著劑、緩釋劑、控釋劑、包衣材料、成膜材料、膠囊材料中的一種或多種。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的藍(lán)花側(cè)金盞有效部位及其制備方法和應(yīng)用所具有的有益效果是：

1、該藍(lán)花側(cè)金盞有效部位能有效抑制HDAC1酶的活性，用于制備抑制HDAC1酶藥物，具有較好的抗腫瘤作用。申請(qǐng)人在研究發(fā)現(xiàn)：目前抗腫瘤藥物的原料較為匱乏。而現(xiàn)有技術(shù)中主要用于治療瘡瘍及牛皮癬的藍(lán)花側(cè)金盞，還具有抗腫瘤的新功效。申請(qǐng)人通過(guò)研究確定其所抑制的酶的種類(lèi)，設(shè)計(jì)制備方法獲得藍(lán)花側(cè)金盞各部位，并且首次在HDAC1酶上進(jìn)行藥效篩選，通過(guò)大量研究確定藍(lán)花側(cè)金盞石油醚部位、藍(lán)花側(cè)金盞乙酸乙酯部位、藍(lán)花側(cè)金盞正丁醇部位和藍(lán)花側(cè)金盞水相萃取部位中的一種或兩種以上的任意質(zhì)量比的混合物均具有較好的抑制HDAC1酶活性，其HDAC1酶存活率19.13%~24.56%，適宜開(kāi)發(fā)成抗腫瘤藏藥新藥。申請(qǐng)人在以上發(fā)現(xiàn)問(wèn)題解決問(wèn)題的過(guò)程中，付出了大量的創(chuàng)造性勞動(dòng)。

2、該藍(lán)花側(cè)金盞有效部位的制備方法提取方便，提取效率高。制備方法中，申請(qǐng)人設(shè)計(jì)加入質(zhì)量百分比濃度65%~95%乙醇溶液進(jìn)行超聲波輔助回流提取，提高了提取效率；萃取中，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作為溶劑萃取浸膏分散液，采用以上溶劑萃取順序所得的石油醚部位、藍(lán)花側(cè)金盞乙酸乙酯部位藍(lán)花側(cè)金盞水相萃取部位具有較好的抑制HDAC1酶的效果。

3、本發(fā)明拓展了抑制HDAC1酶藥物的原料渠道，擴(kuò)大了藍(lán)花側(cè)金盞的用途，使藍(lán)花側(cè)金盞發(fā)展成為抑制HDAC1酶藥物的新原料，可顯著提高藍(lán)花側(cè)金盞的附加值。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1~3是本發(fā)明的藍(lán)花側(cè)金盞有效部位及其制備方法和應(yīng)用的具體實(shí)施方式，其中實(shí)施例1為最佳實(shí)施例。

實(shí)施例1

制備方法，包括下述步驟：將藍(lán)花側(cè)金盞全草粉碎，采用質(zhì)量百分比濃度75~85%乙醇溶液超聲波提取1小時(shí)，然后過(guò)濾并回流提取得提取液，合并提取液、濃縮干燥得浸膏；將浸膏加蒸餾水分散，得浸膏分散液，然后依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作為溶劑萃取浸膏分散液，揮去溶劑后得到藍(lán)花側(cè)金盞石油醚部位、藍(lán)花側(cè)金盞乙酸乙酯部位和藍(lán)花側(cè)金盞正丁醇部位；將萃取后剩余的浸膏分散液濃縮、干燥，得藍(lán)花側(cè)金盞水相萃取部位。

實(shí)施例2

制備方法，包括下述步驟：將藍(lán)花側(cè)金盞全草粉碎，采用質(zhì)量百分比濃度85~95%乙醇溶液超聲波提取3小時(shí)，然后過(guò)濾，濾渣回流提取2次，每次1小時(shí)，合并提取液、濃縮干燥得浸膏；將浸膏加蒸餾水分散，得浸膏分散液，然后依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作為溶劑萃取浸膏分散液，揮去溶劑后得到藍(lán)花側(cè)金盞石油醚部位、藍(lán)花側(cè)金盞乙酸乙酯部位和藍(lán)花側(cè)金盞正丁醇部位；將萃取后剩余的浸膏分散液濃縮、干燥，得藍(lán)花側(cè)金盞水相萃取部位。

實(shí)施例3

制備方法，包括下述步驟：將藍(lán)花側(cè)金盞全草粉碎，采用質(zhì)量百分比濃度65~75%乙醇溶液超聲波提取0.5小時(shí)，然后過(guò)濾，濾渣回流提取1次，用時(shí)2小時(shí)，合并提取液、濃縮干燥得浸膏；將浸膏加蒸餾水分散，得浸膏分散液，然后依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作為溶劑萃取浸膏分散液，揮去溶劑后得到藍(lán)花側(cè)金盞石油醚部位、藍(lán)花側(cè)金盞乙酸乙酯部位和藍(lán)花側(cè)金盞正丁醇部位；將萃取后剩余的浸膏分散液濃縮、干燥，得藍(lán)花側(cè)金盞水相萃取部位。

性能測(cè)試

分別各取0.4mg干燥后的藍(lán)花側(cè)金盞石油醚部位、藍(lán)花側(cè)金盞乙酸乙酯部位、藍(lán)花側(cè)金盞正丁醇部位和藍(lán)花側(cè)金盞水相萃取部位，各自溶解于100μL的二甲基亞砜（DMSO）中形成DMSO溶液，超聲5分鐘。再分別取1μL溶解樣品的DMSO溶液，各加入緩沖液99μL，分別得到用于檢測(cè)的藍(lán)花側(cè)金盞石油醚部位的緩沖溶液、藍(lán)花側(cè)金盞乙酸乙酯部位的緩沖溶液、藍(lán)花側(cè)金盞正丁醇部位的緩沖溶液和藍(lán)花側(cè)金盞水相萃取部位的緩沖溶液。緩沖液的配方為：50mM/L的Tris-HCl、0.137 mM/L的NaCl、2.7mM/L的KCl、1mM/L的MgCl₂、0.01%吐溫20，緩沖液pH 8.4。

一、抑制HDAC1酶實(shí)驗(yàn)。

以實(shí)施例1得到的藍(lán)花側(cè)金盞各部位為受試藥物，檢測(cè)藍(lán)花側(cè)金盞各部位抑制HDAC1酶的活性。

其方法是：分別另取4μL的藍(lán)花側(cè)金盞石油醚部位的緩沖溶液（標(biāo)號(hào)F）、藍(lán)花側(cè)金盞乙酸乙酯部位的緩沖溶液（標(biāo)號(hào)G）、藍(lán)花側(cè)金盞正丁醇部位的緩沖溶液（標(biāo)號(hào)H）和藍(lán)花側(cè)金盞水相萃取部位的緩沖溶液（標(biāo)號(hào)I），分別進(jìn)行如下操作：將所取的4μL緩沖溶液（F、G、H、I）置于96孔板中，再分別加入2μL HDAC1酶，室溫條件下反應(yīng)5min，加入4μL H3（1-21）K9底物，37℃，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60分鐘。加入5μL SA-XL665 和5μL H3K9me0 抗體，665nm測(cè)值，得實(shí)驗(yàn)組吸光度。

將4μL的緩沖液置于96孔板中，再分別加入2μL HDAC1酶，室溫條件下反應(yīng)5min，加入4μL H3（1-21）K9底物，37℃，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60分鐘。加入5μL SA-XL665和5μL H3K9me0 抗體，665nm測(cè)值，得對(duì)照組吸光度。計(jì)算HDAC1酶存活率：存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度×100%。。

表1 藍(lán)花側(cè)金盞有效部位抑制HDAC1酶的活性測(cè)試結(jié)果

。

表1中* P＜0.01，通過(guò)表1可以看出：藍(lán)花側(cè)金盞石油醚部位、藍(lán)花側(cè)金盞乙酸乙酯部位、藍(lán)花側(cè)金盞正丁醇部位和藍(lán)花側(cè)金盞水相萃取部位對(duì)于HDAC1酶均有較好的抑制效果。

二、抗腫瘤活性測(cè)試。

利用MTT法測(cè)定藍(lán)花側(cè)金盞有效部位對(duì)人腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。分別取實(shí)施例1所得藍(lán)花側(cè)金盞浸膏、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水相萃取部位適量，DMSO溶解后，利用MTT法分別測(cè)定對(duì)人結(jié)腸癌HCT-8、人肝癌Bel7402細(xì)胞、人胃癌BGC-803細(xì)胞、人肺腺癌A549細(xì)胞和人卵巢癌A-2780細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率。

實(shí)驗(yàn)方法：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用0.25%胰酶-EDTA消化后，配制成一定濃度的單細(xì)胞懸液，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度的差異，按800~2000個(gè)/孔接種于96孔板，每孔加入細(xì)胞懸液100μL。24h后，加入含不同濃度化合物及相應(yīng)溶劑對(duì)照的新鮮培養(yǎng)基，每孔加100μL（DMSO終濃度<0.1%），每種受試化合物設(shè)5~7個(gè)劑量組，每組至少設(shè)3個(gè)平行孔，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)72h后，棄上清液，每孔加入100μL新鮮配制的含0.5mg/mL MTT的無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液后，每孔加入200μL DMSO溶解MTT甲簪沉淀，微型振蕩器振蕩混勻，用酶標(biāo)儀在參考波長(zhǎng)450nm，檢測(cè)波長(zhǎng)570nm條件下測(cè)定光密度值（OD），以溶劑對(duì)照處理的腫瘤細(xì)胞為對(duì)照組，用以下公式計(jì)算化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率，并按中效方程計(jì)算IC₅₀：抑制率=（對(duì)照組平均OD值－給藥組平均OD值）÷對(duì)照組平均OD值×100%。將制備方法中的浸膏、以及所得的藍(lán)花側(cè)金盞石油醚部位、藍(lán)花側(cè)金盞乙酸乙酯部位、藍(lán)花側(cè)金盞正丁醇部位和藍(lán)花側(cè)金盞水相萃取部位進(jìn)行體外腫瘤細(xì)胞毒活性篩選，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 體外腫瘤細(xì)胞毒活性篩選結(jié)果

。

注：1）、HCT-8為人結(jié)腸癌細(xì)胞，Bel-7402為人肝癌細(xì)胞，BGC-823為人胃癌細(xì)胞，A549為人肺癌細(xì)胞，A2780為人卵巢癌細(xì)胞。2）、>50表明不具有抗細(xì)胞毒活性。通過(guò)表2可看出：藍(lán)花側(cè)金盞石油醚部位、藍(lán)花側(cè)金盞乙酸乙酯部位、藍(lán)花側(cè)金盞正丁醇部位和藍(lán)花側(cè)金盞水相萃取部位確實(shí)有較好的抗腫瘤的效果。

三、體外S₁₈₀荷瘤小鼠抗腫瘤實(shí)驗(yàn)。

1、實(shí)施例1各部位的S₁₈₀荷瘤小鼠抗腫瘤實(shí)驗(yàn)方法如下：

a）5~6周齡昆明小鼠，隨機(jī)選鼠分組，每組10只，每組雌雄各半；分組名稱(chēng)為：空白對(duì)照組，環(huán)磷酰胺組，給藥組；給藥組包括：藍(lán)花側(cè)金盞石油醚部位低、中、高劑量組，藍(lán)花側(cè)金盞乙酸乙酯部位低、中、高劑量組，藍(lán)花側(cè)金盞正丁醇部位低、中、高劑量組，藍(lán)花側(cè)金盞水相萃取部位低、中、高劑量組；對(duì)每只小鼠進(jìn)行皮膚消毒；

b）于右前肢皮下接種S₁₈₀瘤液0.2ml（S₁₈₀瘤細(xì)胞數(shù)在2.0×10⁶~2.2×10⁶范圍內(nèi)）；

c）步驟b）接種24小時(shí)后給藥；空白對(duì)照組灌胃給藥10mL/kg注射用生理鹽水；環(huán)磷酰胺組腹腔注射環(huán)磷酰胺20mg/kg；給藥組采用灌胃給藥實(shí)施例1制得的藍(lán)花側(cè)金盞石油醚部位、藍(lán)花側(cè)金盞乙酸乙酯部位、藍(lán)花側(cè)金盞正丁醇部位和藍(lán)花側(cè)金盞水相萃取部位；首次給藥后，隔日稱(chēng)小鼠首次體重；每組每天給藥1次，每次給藥劑量詳見(jiàn)表3，連續(xù)給藥14天；

d）末次給藥1小時(shí)后，處死小鼠，稱(chēng)小鼠末次體重，剝瘤塊稱(chēng)重，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=（空白對(duì)照組平均瘤重－給藥組平均瘤重）÷空白對(duì)照組平均瘤重×100%，將抑瘤率計(jì)算結(jié)果錄入表3。

表3 實(shí)施例1各部位對(duì)小鼠S₁₈₀實(shí)體瘤的影響

。

2、實(shí)施例2各部位的S₁₈₀荷瘤小鼠方法同實(shí)施例1，數(shù)據(jù)錄入表4。

表4 實(shí)施例2各部位對(duì)小鼠S₁₈₀實(shí)體瘤的影響

。

3、實(shí)施例3各部位的S₁₈₀荷瘤小鼠抗腫瘤實(shí)驗(yàn)的方法同實(shí)施例1，數(shù)據(jù)錄入表5。

表5實(shí)施例3各部位對(duì)小鼠S₁₈₀實(shí)體瘤的影響

。

經(jīng)申請(qǐng)人統(tǒng)計(jì)：給藥組與空白對(duì)照組相比，小鼠體重變化無(wú)顯著性差異（P>0.05）。表3~5中：S₁₈₀是指小鼠腹水瘤細(xì)胞，表3~5中S₁₈₀抑瘤率數(shù)值越大表示抗腫瘤效果越好。由表3~5可以看出：首先，實(shí)施例1~3均有較好的抗腫瘤效果，實(shí)施例1~3中相同部位相同劑量時(shí)，各組間的抗腫瘤效果無(wú)明顯差別。其次，與空白對(duì)照組相比，藍(lán)花側(cè)金盞石油醚部位中、高劑量組，藍(lán)花側(cè)金盞乙酸乙酯部位中、高劑量組，藍(lán)花側(cè)金盞正丁醇高劑量組，藍(lán)花側(cè)金盞水相萃取部位高劑量組，環(huán)磷酰胺化療組，均可顯著抑制S₁₈₀腫瘤的生長(zhǎng)。

實(shí)施例4

將藍(lán)花側(cè)金盞有效部位制備為片劑，采用如下步驟：將藍(lán)花側(cè)金盞石油醚部位300mg和淀粉100mg混勻，加質(zhì)量百分比濃度10%的淀粉糊40mg制成軟材，過(guò)篩得濕顆粒，干燥得干顆粒，整粒，加硬脂酸鎂4 mg混勻、壓片，即得。

實(shí)施例5

沖劑的制備方法：按重量份配比將藍(lán)花側(cè)金盞水相萃取部位5份、蔗糖1份、糊精3份混勻，加入適量質(zhì)量百分比95%乙醇溶液2~5份，邊加邊攪拌，制得軟材，將軟材干燥、過(guò)16目篩，分裝即得。

實(shí)施例6

微丸膠囊由以下重量份原料組成：藍(lán)花側(cè)金盞乙酸乙酯部位30份、卵磷脂5份、牛黃膽酸鈉5份、微晶纖維素30份；

微丸膠囊的制備方法：按配比將藍(lán)花側(cè)金盞乙酸乙酯部位、卵磷脂、牛黃膽酸鈉和微晶纖維素混均，倒入乙醇水溶液攪勻獲得軟材，將軟材倒入擠出機(jī)中擠出，經(jīng)滾圓獲得顆粒，擠出轉(zhuǎn)速250r/min，滾圓轉(zhuǎn)速800r/min，滾圓時(shí)間20min，干燥、過(guò)24~30目篩獲得微丸，將微丸灌裝入膠囊殼內(nèi)，即得。

實(shí)施例7

脂質(zhì)體注射劑的制備方法：1）在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將50g膽固醇琥珀酸酯、250g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、40g大豆卵磷脂、50g泊洛沙姆-188、和10g藍(lán)花側(cè)金盞乙酸乙酯部位溶解于1500ml體積比為1:1的乙醇和正丁醇的有機(jī)溶劑中，攪拌使其溶解獲得混懸液；將混懸液通過(guò)減壓濃縮揮去有機(jī)溶劑，獲得磷脂膜；

2）在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，向磷脂膜中加入8000ml pH為6.8的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌，使磷脂膜洗脫并充分溶脹水合，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，得藍(lán)花側(cè)金盞乙酸乙酯部位的脂質(zhì)體；

3）在無(wú)菌條件下，向藍(lán)花側(cè)金盞乙酸乙酯部位的脂質(zhì)體中，加入100g海藻糖，攪拌均勻，超聲波處理0.5~1小時(shí)，加注射用水定容，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，灌裝，即得藍(lán)花側(cè)金盞乙酸乙酯部位的脂質(zhì)體注射劑。

實(shí)施例8

納米粒注射劑的制備方法：取25g藍(lán)花側(cè)金盞石油醚部位和100g泊洛沙姆407用3000ml 無(wú)水乙醇溶解，加入30ml 1mol/L氯化鋅的乙醇溶液，攪拌混合，超聲波處理0.5~1小時(shí)使其溶解，獲得混合液；將混合液減壓濃縮揮去溶劑，放入-20℃冰箱冷凍2小時(shí)；取出加注射用水定容，超聲波處理0.5~1小時(shí)，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，灌裝，即得藍(lán)花側(cè)金盞石油醚部位的納米粒注射劑。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對(duì)本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。