本發(fā)明涉及2-羥基雌激素的醫(yī)藥用途，特別是涉及2-羥基雌激素在制備用于治療與雌激素相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

乳腺增生、多囊卵巢綜合癥、子宮肌瘤、更年期綜合癥、經(jīng)前期綜合癥等良性疾病均與雌激素相關(guān)，其中一個較為突出的危險因素是女性暴露于雌激素時間延長，其原因包括月經(jīng)初潮時間早、絕經(jīng)時間晚等。雌激素的功能和狀態(tài)在這些疾病的發(fā)生和發(fā)展中起到了重要的作用。

雌二醇(E2)是目前所知雌激素家族生物學(xué)活性最強的一種，在很多細胞和器官的正常功能上都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。雌二醇在體內(nèi)的代謝方式主要包括氧化的代謝，其中大部分為羥基化，還包括糖脂化、甲基化等。細胞色素P50家族作為主要酶催化還原型輔酶Ⅱ(NADPH)介導(dǎo)的雌激素羥基化為多種代謝產(chǎn)物；其中，數(shù)量較多的苯鄰二酚雌激素在C2、C4位產(chǎn)生，隨后在甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)的介導(dǎo)下代謝為甲基化雌激素，從而形成水溶性的代謝產(chǎn)物，最終通過尿液或排泄物排出體外。

孕激素受體(PR)、早老素2(PS2)、細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)等基因均屬于雌激素受體下游靶基因；其中，PS2在多種腫瘤中高表達，Cyclin D1也被公認為是一種原癌基因，其過度表達可致細胞增殖失控而惡性化。在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了Cyclin D1基因過表達和基因擴增，包括乳腺癌、膀胱癌、甲狀旁腺腫瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、肺癌及細胞中心型淋巴瘤等。因此，亟待開發(fā)具有拮抗雌激素活性的相關(guān)藥物用以治療與雌激素相關(guān)疾病。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供2-羥基雌激素在制備用于治療與雌激素相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用，該藥物能夠拮抗雌激素活性，從而能夠用于治療與雌激素相關(guān)疾病。

本發(fā)明提供2-羥基雌激素在制備用于治療與雌激素相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用，所述2-羥基雌激素為2-羥基雌酮和2-羥基雌二醇中的至少一種。

本發(fā)明所述的2-羥基雌酮(2-OH-E1)的結(jié)構(gòu)式如下：

本發(fā)明所述的2-羥基雌二醇(2-OH-E2)的結(jié)構(gòu)式如下：

經(jīng)本發(fā)明人大量研究發(fā)現(xiàn)，所述2-羥基雌激素具有拮抗雌激素活性的活性；特別是，所述2-羥基雌激素在與雌激素共用時能夠降低雌激素活性。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，所述2-羥基雌激素拮抗雌激素活性是通過拮抗雌激素對雌激素受體-α(ER-α)的激活而實現(xiàn)的。

此外，所述2-羥基雌激素還能夠拮抗雌激素相關(guān)基因的過表達，例如PR、PS2和Cyclin D1等基因的過表達；特別是，所述雌激素相關(guān)基因的過表達是由E2誘導(dǎo)。

進一步地，所述2-羥基雌激素拮抗雌激素活性存在于乳腺癌細胞和子宮內(nèi)膜細胞。

具體地，所述與雌激素相關(guān)疾病為雌激素依賴的良性疾病，所述雌激素依賴的良性疾病為乳腺增生、多囊卵巢綜合癥、子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位癥、子癇前期、骨質(zhì)疏松、更年期綜合癥、經(jīng)前期綜合征或不孕。

進一步地，所述與雌激素相關(guān)疾病為雌激素依賴的惡性疾病，所述雌激素依賴的惡性疾病為乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、子宮癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌或?qū)m頸癌。

此外，所述與雌激素相關(guān)疾病還可以為受雌激素調(diào)控的基因過表達引起的疾病。其中，所述受雌激素調(diào)控的基因包括孕激素受體(progesterone receptor，PR)基因、組織蛋白酶D(Cathepsin D，CD)基因、早老素2(PS2)基因和細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)基因中的至少一種。

進一步地，所述與雌激素相關(guān)疾病為細胞周期蛋白D1基因過表達引起的良性疾病，所述細胞周期蛋白D1基因過表達引起的良性疾病為乳腺增生、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤或前列腺增生。

進一步地，所述與雌激素相關(guān)疾病為細胞周期蛋白D1基因過表達引起的惡性疾病，所述細胞周期蛋白D1基因過表達引起的惡性疾病為乳腺癌、肺癌、胃癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、膀胱癌、甲狀旁腺腫瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、星形細胞瘤或細胞中心型淋巴瘤。

在本發(fā)明中，對2-羥基雌激素的具體應(yīng)用方式不作嚴格限制。2-羥基雌激素既可以作為單一的主藥成分，從而用于治療與雌激素相關(guān)疾?。淮送?，2-羥基雌激素還可以與其它藥物成分(例如雌激素、生長因子等)組成藥物組合物，從而用于治療與雌激素相關(guān)疾病。

進一步地，所述藥物可以為單位制劑；其中，所述單位制劑為滿足一次給藥所需有效成分的制劑，如一單位(片)片劑等。

可以理解的是，所述藥物還可以包括藥學(xué)上可接受的輔料，從而使得該藥物能夠呈現(xiàn)適于給藥的形式。對所述輔料無嚴格限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)所述藥物的劑型選擇適合的輔料。

在本發(fā)明的具體方案中，所述藥物的劑型可以為口服給藥劑型、注射給藥劑型或陰道給藥劑型。其中，口服給藥劑型例如片劑、膠囊劑等；注射給藥劑型例如皮下注射劑、靜脈注射劑等，特別是皮下緩釋注射劑等；陰道給藥劑型可以為栓劑等。

進一步研究表明，所述2-羥基雌激素在體外的治療有效量可以為1nM-100nM。

本發(fā)明還提供一種治療與雌激素相關(guān)疾病的方法，包括對患有所述疾病的個體施用所述藥物的過程。具體地，施用所述藥物的方式可以為口服給藥、注射給藥、陰道給藥等。

本發(fā)明的實施，至少具有以下優(yōu)勢：

1、本發(fā)明的2-羥基雌激素具有拮抗雌激素活性的活性，因此能夠應(yīng)用于雌激素依賴性疾病的治療。

2、本發(fā)明的2-羥基雌激素能夠拮抗E2對ER-α的活化，因此能夠應(yīng)用于與雌激素相關(guān)疾病的治療。

3、本發(fā)明的2-羥基雌激素能夠拮抗PR、PS2、Cyclin D1等雌激素相關(guān)基因的過表達，從而抑制細胞的過度生長，因此能夠應(yīng)用于相關(guān)疾病的治療。

附圖說明

圖1顯示2-OH-E2對ER的活化作用結(jié)果；

圖2顯示2-OH-E2對PR的mRNA表達量的影響；

圖3顯示2-OH-E2對PS2的mRNA表達量的影響；

圖4顯示2-OH-E2對Cyclin D1的mRNA表達量的影響；

圖5顯示2-OH-E2對ER-α的活化作用結(jié)果；

圖6顯示2-OH-E2和E2對ER-α的拮抗作用結(jié)果；

圖7顯示2-OH-E2對MDA-MB-231-ESR1細胞PS2的mRNA表達量的影響；

圖8顯示2-OH-E2和E2對MDA-MB-231-ESR1細胞PS2的mRNA表達量的影響；

圖9顯示2-OH-E2對MDA-MB-231-ESR1細胞Cyclin D1的mRNA表達量的影響；

圖10顯示子宮內(nèi)膜元代細胞中2-OH-E2對PR的mRNA表達量的影響；

圖11顯示子宮內(nèi)膜元代細胞中2-OH-E2對Cyclin D1的mRNA表達量的影響。

圖中：*：與空白對照組比較P＜0.05；**：與空白對照組比較P＜0.01；***：與空白對照組比較P＜0.001；#：與E2處理組比較P＜0.05；##：與E2處理組比較P＜0.01；###：與E2處理組比較P＜0.001。

具體實施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明的實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

下述各實施例中使用的腫瘤細胞、質(zhì)粒及試劑：

MCF-7人乳腺癌細胞系(簡稱MCF-7細胞)、MDA-MB-231乳腺癌細胞系來自于ATCC細胞庫；

子宮內(nèi)膜原位細胞：來自安徽醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)中心宮腔鏡門診病人；

2-OH-E2(2-Hydrixy-estrodiol；H3131)、E2(17-β-estrodiol；E2758)、4-OH-TAM(4-OH-Tamoxifen；H6278)：均購自Sigma-Aldrich公司，純度均≥95％。

無酚紅DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、活性炭處理胎牛血清(CS-FBS)、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶-EDTA溶液：均購自美國Invitrogen公司和GIBCO-BRL公司；

磷酸鹽緩沖(PBS)粉末、Tris-HCl緩沖鹽(TBS)粉末、二甲基亞砜(DMSO)：購自Sigma-Aldrich公司；

RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime Script ^TM RT reagent Kit)；購自日本Takara公司；

熒光定量試劑盒(FastStart Universal SYBR Green Master)：購自瑞士Roche公司；

Lipofectamine3000試劑：購自美國Invitrogen公司；

用于檢測ER-α轉(zhuǎn)錄活性的雙熒光素酶報告基因測定試劑盒：購自Promega公司。

下述各實施例的實驗分組：

1、空白對照組

以含有DMSO的無酚紅DMEM培養(yǎng)液作為空白對照，記作C；

2、2-OH-E2處理組

共四組，各組濃度依次為1nM、10nM、100nM、1μM，并且依次記作2-OH-E2-1、2-OH-E2-2、2-OH-E2-3、2-OH-E2-4；

3、E2處理組

濃度為1nM，記作E2；

4、E2與2-OH-E2聯(lián)合處理組

共四組，第一組為E2(1nM)+2-OH-E2(1nM)，記作E2+2-OH-E2-1；第二組為E2(1nM)+2-OH-E2(10nM)，記作E2+2-OH-E2-2；第三組為E2(1nM)+2-OH-E2(100nM)，記作E2+2-OH-E2-3；第四組為E2(1nM)+2-OH-E2(1μM)，記作E2+2-OH-E2-4；

5、E2與他莫昔芬(TAM，陽性對照藥)聯(lián)合處理組

E2(1nM)+4-OH-TAM(1μM)，記作E2+TAM；

6、2-OH-E2與TAM聯(lián)合處理組

2-OH-E2(100nM)與TAM(1μM)，記作2-OH-E2+TAM；

上述各處理組的藥物(受試物)采用DMSO溶解后，以無酚紅DMEM培養(yǎng)液稀釋成所需濃度，作為各處理組在下述各試驗中的培養(yǎng)液。

實施例1 2-OH-E2對ER的活化作用

1、構(gòu)建含有雌激素反應(yīng)元件(Estrogen Response Element,ERE)的熒光素酶報告質(zhì)粒

采用常規(guī)方法將雌激素反應(yīng)元件克隆至熒火蟲熒光素酶基因(Firefly Luciferase)的上游，構(gòu)建成含有ERE的熒光素酶報告質(zhì)粒(pERE3-Luc，上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)。

2、對ER的活化作用

將上述構(gòu)建的含有ERE的熒光素酶報告質(zhì)粒與海腎熒光素酶基因(renilla luciferase)質(zhì)粒(內(nèi)參質(zhì)粒pRL-SV40-Luc，作為轉(zhuǎn)錄活力的內(nèi)對照，以提高實驗準確性)共轉(zhuǎn)染ER陽性的MCF-7人乳腺癌細胞系，轉(zhuǎn)染后的MCF-7細胞分別在上述含有各處理組受試物的無酚紅DMEM培養(yǎng)液(含10％CS-FBS)培養(yǎng)24h后，分別采用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)(Dual Luciferase Assay System，Promega)檢測pERE3-Luc和pRL-SV40-Luc熒光素酶活性，取其比值作為熒光素酶的相對活性(relative luciferase activity)，用以判定活化ER的強弱，比值越大，則認為受體配體復(fù)合物與雌激素反應(yīng)元件結(jié)合越強，即雌激素活性越強。

2、結(jié)果

圖1顯示2-OH-E2對ER的活化作用結(jié)果；由圖1可知，經(jīng)濃度為100nM以上的2-OH-E2處理后，ER的活性相對于空白對照組C顯著升高(P＜0.001)，并且明顯弱于E2處理組；此外，TAM能夠拮抗E2和2-OH-E2對ER的活化作用。

實施例2 2-OH-E2對PR的調(diào)節(jié)作用

1、提取總RNA

將MCF-7細胞在上述含有各處理組受試物的無酚紅DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h(受試物處理24h)，隨后提取各組細胞的總RNA，測定260nm、280nm、320nm處的吸光值，計算濃度。

2、逆轉(zhuǎn)錄

調(diào)整各組細胞的總RNA濃度至50mg/L，取2μL，使用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime Script ^TM RT reagent Kit，TaKaRa公司)配制20μL的反應(yīng)體系，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，37℃15min，4℃forever，-20℃保存。

3、Real-time PCR檢測

采用StepOnePlus Real-time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，USA)

PCR引物：

正向引物：TTATGGTGTCCTTACCTGTGGG(SEQ ID NO.1)

反向引物：GCGGATTTTATCAACGATGCAG(SEQ ID NO.2)

PCR反應(yīng)體系(20μL)：

SYBR Green Master：10μL

正向引物(10μM):0.6μL

反向引物(10μM):0.6μL

cDNA模板(50ng/μL)：2μL

RNase Free水：6.8μL

PCR反應(yīng)條件：

95℃預(yù)變性15min；94℃變性15s，60℃退火15s，40個循環(huán)。

Real-Time PCR數(shù)據(jù)分析處理采用ΔΔCt法進行。

4、結(jié)果

圖2顯示2-OH-E2對PR的mRNA表達量的影響；由圖2可知，經(jīng)濃度為100nM以上的2-OH-E2處理后，PR的相對表達量(relative mRNA expression of PR)相對于空白對照組C顯著升高(P＜0.001)，并且較低于E2處理組，由此說明2-OH-E2具有弱雌激素的生物學(xué)活性。

實施例3 2-OH-E2對PS2的調(diào)節(jié)作用

1、提取總RNA

將MCF-7細胞在上述含有各處理組受試物的無酚紅DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h(受試物處理24h)，隨后提取各組細胞的總RNA，測定260nm、280nm、320nm處的吸光值，計算濃度。

2、逆轉(zhuǎn)錄

調(diào)整各組細胞的總RNA濃度至50mg/L，取2μL，使用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime Script ^TM RT reagent Kit，TaKaRa公司)配制20μL的反應(yīng)體系，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，37℃15min，4℃forever，-20℃保存。

3、Real-time PCR檢測

采用StepOnePlus Real-time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，USA)

PCR引物：

正向引物：CCCCGTGAAAGACAGAATTGT(SEQ ID NO.3)

反向引物：GGTGTCGTCGAAACAGCAG(SEQ ID NO.4)

PCR反應(yīng)體系(20μL)：

SYBR Green Master：10μL

正向引物(10μM):0.6μL

反向引物(10μM):0.6μL

cDNA模板(50ng/μL)：2μL

RNase Free水：6.8μL

PCR反應(yīng)條件：

95℃預(yù)變性15min；94℃變性15s，60℃退火15s，40個循環(huán)。

Real-Time PCR數(shù)據(jù)分析處理采用ΔΔCt法進行。

4、結(jié)果

圖3顯示2-OH-E2對PS2的mRNA表達量的影響；由圖3可知，經(jīng)濃度為100nM以上的2-OH-E2處理后，PS2的相對表達量(relative mRNA expression of PS2)相對于空白對照組C顯著升高(P＜0.001)，并且較低于E2處理組，由此說明2-OH-E2具有弱雌激素的生物學(xué)活性。

實施例4 2-OH-E2對Cyclin D1的調(diào)節(jié)作用

1、提取總RNA

將MCF-7細胞在上述含有各處理組受試物的無酚紅DMEM培養(yǎng)液(含10％CS-FBS)培養(yǎng)24h(受試物處理24h)，隨后提取各組細胞的總RNA，測定260nm、280nm、320nm處的吸光值，計算濃度。

2、逆轉(zhuǎn)錄

調(diào)整各組細胞的總RNA濃度至50mg/L，取2μL，使用Prime Script ^TM RT reagent Kit(TaKaRa公司)配制20μL的反應(yīng)體系，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，37℃15min，4℃forever，-20℃保存。

3、Real-time PCR檢測

采用StepOnePlus Real-time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，USA)

PCR引物：

正向引物：GCTGCGAAGTGGAAACCATC(SEQ ID NO.5)

反向引物：CATGGAGGGCGGATTGGAA(SEQ ID NO.6)

PCR反應(yīng)體系(20μL)：

SYBR Green Master：10μL

正向引物(10μM):0.6μL

反向引物(10μM):0.6μL

cDNA模板(50ng/μL)：2μL

RNase Free水：6.8μL

PCR反應(yīng)條件：

95℃預(yù)變性15min；94℃變性15s，60℃退火15s，40個循環(huán)。

Real-Time PCR數(shù)據(jù)分析處理采用ΔΔCt法進行。

4、結(jié)果

圖4顯示2-OH-E2對Cyclin D1的mRNA表達量的影響；由圖4可知，經(jīng)濃度為100nM以上的2-OH-E2處理后，Cyclin D1的相對表達量(relative mRNA expression of Cyclin D1)相對于空白對照組C顯著升高(P＜0.05)，并且較低于E2處理組，由此說明2-OH-E2具有弱雌激素的生物學(xué)活性。

實施例5 2-OH-E2對ER-α的活化作用

1、對ER-α的活化作用

采用過表達ER-α的慢病毒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染野生型三陰性的乳腺癌MDA-MB-231細胞，得到穩(wěn)定過表達ER-α的MDA-MB-231-ESR1細胞系，其中ER-α將上述構(gòu)建的含有雌激素反應(yīng)元件的熒光素酶報告質(zhì)粒，與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-SV40-Luc共轉(zhuǎn)染MDA-MB-231-ESR1細胞。

轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231-ESR1細胞分別在上述含有各處理組受試物的無酚紅DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后，分別檢測pERE3-Luc和的pRL-SV40-Luc熒光素酶活性，取其比值作為熒光素酶的相對活性(relative luciferase activity)，用以判定活化ER-α的強弱。

2、結(jié)果

圖5顯示2-OH-E2對ER-α的活化作用結(jié)果；由圖5可知，經(jīng)濃度為10nM以上的2-OH-E2處理后，ER-α的活性相對于空白對照組C顯著升高(P＜0.01)，并且明顯弱于E2處理組；此外，TAM能夠拮抗2-OH-E2對ER-α的活化作用。

實施例6 2-OH-E2對MDA-MB-231-ESR1雌激素調(diào)節(jié)基因PS2的調(diào)節(jié)作用

將MDA-MB-231-ESR1細胞在上述含有各處理組受試物的無酚紅DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h(受試物處理24h)，隨后提取各組細胞的總RNA，測定260nm、280nm、320nm處的吸光值，計算濃度；按照實施例3中的方法進行逆轉(zhuǎn)錄和PCR檢測。

圖7顯示2-OH-E2對MDA-MB-231-ESR1細胞PS2的mRNA表達量的影響；圖8顯示2-OH-E2和E2對MDA-MB-231-ESR1細胞PS2的mRNA表達量的影響。

由圖7可知，經(jīng)濃度為100nM以上的2-OH-E2處理后，MDA-MB-231-ESR1細胞PS2的相對表達量相對于空白對照組C顯著升高(P＜0.01)，并且明顯低于E2處理組；由圖8可知，在2-OH-E2與E2共同作用下，2-OH-E2顯示出拮抗雌激素的作用，且在2-OH-E2濃度為100nM時，拮抗作用達到最大。

實施例7 2-OH-E2對MDA-MB-231-ESR1雌激素調(diào)節(jié)基因Cyclin D1的調(diào)節(jié)作用

將MDA-MB-231-ESR1細胞在上述含有各處理組受試物的無酚紅DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h(受試物處理24h)，隨后提取各組細胞的總RNA，測定260nm、280nm、320nm處的吸光值，計算濃度；按照實施例4中的方法進行逆轉(zhuǎn)錄和PCR檢測。

圖9顯示2-OH-E2對MDA-MB-231-ESR1細胞Cyclin D1的mRNA表達量的影響。

由圖9可知，經(jīng)濃度為10nM以上的2-OH-E2處理后，MDA-MB-231-ESR1細胞Cyclin D1的相對表達量相對于空白對照組C顯著升高(P＜0.01)，并且明顯低于E2處理組。

實施例8子宮內(nèi)膜異位癥患者體內(nèi)雌激素代謝產(chǎn)物的檢測及分析

人體對性激素的代謝經(jīng)肝臟一相及二相代謝，在血液中，各代謝產(chǎn)物呈不穩(wěn)定的游離狀態(tài)，檢測血液中各項代謝產(chǎn)物的指標，極易產(chǎn)生較大誤差。尿液中，各項代謝產(chǎn)物為穩(wěn)定的共軛結(jié)合狀態(tài)，檢測尿液中代謝產(chǎn)物的指標，準確度將更高。

本發(fā)明人收集了9例臨床確診的子宮內(nèi)膜異位癥患者(來自安徽醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)中心宮腔鏡門診病人)尿液標本，基于GC-MC/MC的原理和技術(shù)手段，利用干燥尿液試紙，全面而準確的檢測出子宮內(nèi)膜異位癥患者及正常女性體內(nèi)雌激素代謝產(chǎn)物種類、含量及各產(chǎn)物之間比值，比對分析代謝產(chǎn)物之間表達差異，從而獲取子宮內(nèi)膜異位癥患者雌激素代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，如表1所示。

表1子宮內(nèi)膜異位癥患者較正常女性雌激素代謝產(chǎn)物分析

由表1的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于正常女性，2-OH-E2/E2的比值比正常女性降低明顯(P＜0.05)，并且2-OH-E2/2-甲基雌二醇(2-Methoxy-E2)的比值也顯著降低(P＜0.001)。

由此說明，子宮內(nèi)膜異位癥患者體內(nèi)雌激素2位羥基化產(chǎn)物2-羥基雌二醇的相對含量減低，而2-羥基雌二醇具有弱雌激素活性及拮抗雌激素的作用，以上患者體內(nèi)雌激素代謝在C-2位代謝降低，這些改變進一步導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位癥患者體內(nèi)整體雌激素活性較正常女性升高，從而促進了子宮內(nèi)膜異位癥疾病的發(fā)生和進展。

實施例9 2-OH-E2對于子宮內(nèi)膜細胞的作用

本發(fā)明人收集并培養(yǎng)了數(shù)例子宮內(nèi)膜原位細胞，經(jīng)過2-OH-E2及E2處理后，Real-time PCR檢測各雌激素調(diào)節(jié)基因表達變化(參見實施例2-4方法)。

子宮內(nèi)膜元代細胞培養(yǎng)方法：將挑取的子宮內(nèi)膜組織在無菌生理鹽水中反復(fù)涮洗去除血污，剪成1mm³(肉眼成糊狀)左右的小塊，置于無菌離心管中，加入2-3ml復(fù)合消化酶(0.25％胰蛋白酶/0.1％EDTA、0.1％膠原酶)，充分混勻后置37℃恒溫靜置消化約30分鐘。加入含20％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，離心400r/min，7分鐘。棄上清，加入約1ml左右培養(yǎng)液，用巴氏吸管吹打成細胞懸液，接種于盛有含20％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液的25cm²無菌培養(yǎng)瓶中，置37℃、5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每1-2天觀察細胞生長情況。

圖10和圖11結(jié)果顯示，2-OH-E2在子宮內(nèi)膜細胞中與E2共同作用，能夠拮抗E2誘導(dǎo)的PR、Cyclin D1基因的過表達(與E2處理組相比，P＜0.05)，證明2-OH-E2在子宮內(nèi)膜細胞中依然具有拮抗雌激素的作用。

從以上實驗結(jié)果可以看出，2-OH-E2在雌激素依賴的子宮內(nèi)膜元代細胞中能夠拮抗E2的作用，降低E2誘導(dǎo)的PR及Cyclin D1的過表達。

最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍。