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擬缺香茶菜中2a,3β,19a?三羥基?12烯?28?烏蘇酸在制備抗腫瘤藥物中的應用的制作方法

文檔序號:11897022閱讀:515來源:國知局

本發(fā)明涉及天然產(chǎn)物提取技術領域,具體涉及從擬缺香茶菜中分離得到的2a,3β,19a-三羥基-12烯-28-烏蘇酸及其用途。



背景技術:

擬缺香茶菜別名野紫蘇,為唇形科香茶菜屬植物,香茶菜屬植物是多年生草本、半灌木或灌木唇形科植物,大多具有清熱解毒、活血化瘀、抗菌消炎、抗腫瘤等功效。該屬植物在世界各地都有所發(fā)現(xiàn),共150余種,主要產(chǎn)于熱帶和亞熱帶的亞洲地區(qū)。中國有90個種、21個變種,除新疆、青海及內(nèi)蒙古外幾乎遍布全國,但西南各省種數(shù)最多。香茶菜屬植物是我國有著很長歷史且廣受歡迎的中草藥,最早應用記載于明代朱繡所著的《救荒本草》。所述2a,3β,19a-三羥基-12烯-28-烏蘇酸是從河南洛陽龍浴灣采摘的擬缺香茶菜中提取分離到的五環(huán)三萜類化合物【李火云,焦珂,張鵬,等.擬缺香茶菜化學成分研究{J}.中草藥:2014,45(2):154-160;鄧芳葉,王國才,王春華等.理肺散化學成分研究.中草藥,2012,43(5):861-865】。三萜類化合物是香茶菜屬植物中最重要的有效活性成分之一,該屬植物中的三萜類化合物主要指母體結構為五個六元環(huán)相連的烏蘇烷型或齊墩果酸型五環(huán)三萜,其結構具有顯著的特點。三萜是一類具有獨特空間結構的生物活性天然產(chǎn)物,不僅在抗炎、抗菌、保肝護腎等方面有著重要的應用價值,還具有很強的抗腫瘤活性,極有可能被開發(fā)為新一代的抗癌藥物。三萜類化合物是自然界中數(shù)量最多的天然產(chǎn)物之一,主要以游離、苷或酯的形式廣泛存在于蕨類、菌類、單子葉和雙子葉植物中,少數(shù)存在于動物體內(nèi)。由于目前治療癌癥的藥物普遍具有較大的副作用,抑制腫瘤細胞的同時會給正常細胞帶來傷害,三萜類化合物憑借其“靶向殺傷”特征成為近年來國內(nèi)外抗腫瘤藥物研究的焦點之一。大量研究表明,其對乳腺癌、肺癌、直腸癌和中樞神經(jīng)癌等多種腫瘤均具有顯著的抑制效果。但至今未見有關2a,3β,19a-三羥基-12烯-28-烏蘇酸具有抗腫瘤活性報道。該化合物的化學結構式如下:



技術實現(xiàn)要素:

本發(fā)明對2a,3β,19a-三羥基-12烯-28-烏蘇酸活性進行了研究,目的在于提供2a,3β,19a-三羥基-12烯-28-烏蘇酸在制備抗癌藥物方面的用途。

為實現(xiàn)本發(fā)明目的,本發(fā)明采用MTT法,用食管癌(EC-9706)、淋巴瘤(SUDHL-4)、肝癌(SMMC-7721)細胞株對2a,3β,19a-三羥基-12烯-28-烏蘇酸進行了細胞毒活性實驗,實驗結果發(fā)現(xiàn)它均具有顯著的細胞毒活性,因此可用于制備抗癌藥物。本發(fā)明為尋求抗癌藥物提供了一種新的來源。

2a,3β,19a-三羥基-12烯-28-烏蘇酸的性質(zhì)

分子式:C30H48O5;分子量:488;MP:222-224℃

性狀:白色無定型粉末,溶于氯仿,丙酮,乙酸乙酯等

英文名:(2α,3β,19α-trihydroxy-urs-12-en-28-oic acid)

提取來源:擬缺香茶菜全草【提取方法參見李火云,焦珂,張鵬,等.擬缺香茶菜化學成分研究{J}.中草藥:2014,45(2):154-160;陳慧平,馬方,鄒敏,等】。

本發(fā)明優(yōu)點:以EC-9706、SUDHL-4和SMMC-7721細胞株為模型,對2a,3β,19a-三羥基-12烯-28-烏蘇酸的體外抗腫瘤活性進行實驗,發(fā)現(xiàn)該化合物對多種腫瘤細胞株具有較強的抑制作用,可作為研制新的抗腫瘤藥物的先導化合物,也可作為治療各種臨床常見多發(fā)癌癥的藥物。

具體實施方案

下面通過體外抗腫瘤實驗,對本發(fā)明作詳細描述。

實施例1

1、供試細胞

人食管癌細胞EC-9706、人淋巴瘤細胞SUDHL-4、人肝癌細胞SMMC-7721均為普通市售商品。

2、主要儀器與耗材

生物安全柜,力康發(fā)展有限公司,HFsafe-1200TE;

CO2培養(yǎng)箱,力康發(fā)展有限公司,HF160W;

倒置生物顯微鏡,奧林巴斯,BDS200;

恒溫振蕩器,國華,ZD-85型;

EXL800uv全自動酶標儀,Bio-Rad(美國)公司,168-1000XC;

精密可調(diào)微量移液器,Eppendorf(德國)公司;

96孔細胞培養(yǎng)板,LabServ

細胞培養(yǎng)瓶,LabServ

3、主要試劑

優(yōu)級胎牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司;

胰蛋白酶,Sigma公司;

RPMI1640培養(yǎng)基、DMSO和四甲基偶氮唑藍(methylthiazolyl tetrazolium,MTT),美國Solarbio公司。

4、主要試劑配制

PBS緩沖液配制(PH7.4):NaCl 8.0g,KCl 0.20g,Na2HPO4 3.48g,KH2PO4 0.20g,溶于1000ml超純水中,高壓蒸汽滅菌,4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

MTT配制:稱取10mg MTT,加2ml PBS(PH7.4)攪拌30min,用0.22μm微孔濾器過濾除菌,分裝4℃避光保存,兩周內(nèi)有效;

胰蛋白酶消化液:用PBS溶液溶解胰酶,配置成質(zhì)量百分濃度為0.25%的胰酶溶液,調(diào)PH值為7.4左右,過濾除菌,分裝-20℃保存。

臺盼藍:稱取0.4g臺盼藍粉,溶于100ml超純水中,過濾除菌分裝后,-4℃保存?zhèn)溆谩J褂脮r,用超純水稀釋至質(zhì)量百分濃度為0.04%。

5、方法

5.1細胞培養(yǎng)

人食管癌細胞EC-9706、人肝癌細胞SMMC-7721為貼壁細胞,人淋巴瘤細胞SUDHL-4為懸浮細胞,均使用含質(zhì)量百分濃度10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基,在37℃飽和濕度、體積百分濃度5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng);每2-3d換液1次。實驗過程中用臺盼藍染色法檢測細胞活性。

EC-9706、SMMC-7721細胞消化傳代方法:倒掉原培養(yǎng)基,加入PBS緩沖液潤洗兩次,向培養(yǎng)瓶加1ml胰蛋白酶,在倒置顯微鏡下觀察,至細胞變圓、有間隙時將胰蛋白酶倒出,加入含質(zhì)量百分濃度10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基1ml,反復吹打細胞使其脫壁直至散開成單個,分裝到新培養(yǎng)瓶中,加入含質(zhì)量百分濃度10%胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

SUDHL-4細胞消化傳代方法:將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液連同細胞一起倒入離心管中,1000rpm/min離心5min,棄去上清,加入2ml新鮮培養(yǎng)液重懸細胞,向兩個培養(yǎng)瓶中各吸取1ml細胞懸液,并分別加入適量新鮮的培養(yǎng)液進行傳代培養(yǎng)。

5.2MTT法體外篩選抗腫瘤藥物

5.2.1原理

MTT全稱為3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽,簡稱噻唑藍?;罴毎€粒體中的琥珀酸脫氧酶能夠使MTT還原為不溶于水的藍紫色針狀結晶甲瓚,并沉積在細胞中,而死細胞則沒有該功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚顆粒,使細胞著色,用酶標儀在490mn波長處測定其吸光度(A),根據(jù)A值大小分析活細胞多少,A值可間接反映活細胞數(shù)量。

5.2.2實驗方法

MTT:收集對數(shù)生長期細胞,用細胞計數(shù)板計數(shù),調(diào)整細胞懸液濃度為5×107·L-1(SUDHL-4細胞為8×107·L-1),96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入100μl,(SUDHL-4細胞實驗孔加入含有不同藥物濃度的培養(yǎng)基各100μl),每個濃度設四個復孔,細胞培養(yǎng)箱(5%CO2,37℃)中孵育24h,待細胞貼壁后,小心吸去上清,加入含有不同藥物濃度的培養(yǎng)基100μl,并設陰性對照孔、空白孔及陽性對照孔。連續(xù)培養(yǎng)48h后,每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml),繼續(xù)培養(yǎng)4h后,將培養(yǎng)板取出(SUDHL-4細胞需離心25min),用移液器吸棄上清液,每孔加入150μL DMSO,震蕩混勻后,用酶聯(lián)免疫檢測儀,在570nm波長下檢測各孔的吸光度(A)值;實驗重復三次,按以下公式求取細胞增殖抑制率,用SPSS軟件計算其IC50值。抑制率(%)=(1-給藥孔A值/對照孔A值)×100%。

6、結果

本研究以EC-9706、SUDHL-4和SMMC-7721細胞株為模型,對2a,3β,19a-三羥基-12烯-28-烏蘇酸的體外抗腫瘤活性進行篩選,結果顯示:2a,3β,19a-三羥基-12烯-28-烏蘇酸對上述3種細胞均有不同程度的抗腫瘤活性,其中對食管癌細胞EC-9706的抑制作用最強,IC50為2.88uM,對淋巴瘤細胞SUDHL-4的作用次之,IC50為5.97uM,對肝癌細胞SMMC-7721的IC50為31.38uM,結果見表1、表2,提示可用于制備抗腫瘤藥物。

表1 2a,3β,19a-三羥基-12烯-28-烏蘇酸對EC-9706、SUDHL-4細胞72h體外抑制活性結果

表2 2a,3β,19a-三羥基-12烯-28-烏蘇酸對SMMC-7721細胞72h體外抑制活性結果

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