本發(fā)明屬于細胞生物學和藥理學技術領域，具體涉及人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞損傷模型的建立，特別涉及吳茱萸堿在制備保護人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的藥物中的應用。

背景技術：

高血壓為臨床常見病和多發(fā)病，其主要并發(fā)癥有中風、心肌梗死及腎功能衰竭，嚴重危害人們的身心健康，其是心腦血管病死亡的主要因素之一。由于高血壓的發(fā)病多為遺傳、環(huán)境、生物等多因素共同決定的，其發(fā)病涉及體內(nèi)物質(zhì)代謝的紊亂和多系統(tǒng)多器官的病變及功能失調(diào)。大量西藥的降壓藥物只能通過單靶點的對抗作用降壓，存在藥物副作用大、耐藥性高、常需聯(lián)合用藥等問題，給患者帶來沉重的經(jīng)濟負擔，這些都影響著患者的依從性及降壓療效。而與之相比，中藥治療高血壓不僅副作用小，價格低廉，且是通過多靶點、多層次等途徑降低血壓，不在于單純降低血壓，更在于調(diào)整機體陰陽的平衡從而明顯改善癥狀，提高生存質(zhì)量，在降低心腦血管系統(tǒng)并發(fā)癥及靶器官損傷，改善物質(zhì)代謝，促進心、腦、腎、血管病理改變的恢復等多方面具有作用。中藥療效持久，在治療高血壓病方面具有獨特的優(yōu)勢。因此研制開發(fā)療效確切的治療高血壓的純中藥制劑具有良好的市場前景和積極的社會效益，符合醫(yī)藥發(fā)展趨勢。

高血壓發(fā)病機制復雜，除了腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、腎臟因素和遺傳因素等，多項研究表明高同型半胱氨酸(Hcy)水平也是高血壓病發(fā)病機制中重要的環(huán)節(jié)。Hcy是導致心血管疾病重要的危險因子。血液中同型半胱氨酸的濃度比半胱氨酸的濃度要更高，但是半胱氨酸并不對細胞造成損傷，同時也有研究表明同型半胱氨酸通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應，引起未折疊蛋白反應使蛋白不能正常折疊最終導致細胞損傷。許多研究表明，Hcy能夠誘導促凝血因子，誘導細胞壞死和凋亡。同型半胱氨酸對內(nèi)皮細胞損傷涉及多條機制，包括促進氧化劑的活性，抑制谷胱甘肽過氧化物酶活性，通過激活NF-kB增加炎癥反應，促進血管平滑肌細胞的生長，導致膠原合成增加。Hcy促進活性氧(ROS)的產(chǎn)生導致內(nèi)皮細胞的損傷。Hcy通過減少一氧化氮(NO)的釋放損傷內(nèi)皮細胞的功能，降低NO的生物活性和內(nèi)皮依賴的血管松弛。內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)通過連接到小凹蛋白(Cav-1)特定位點以調(diào)節(jié)其活性。在靜息條件下，Cav-1對eNOS有負調(diào)控作用；在激動劑的作用下，通過調(diào)控蛋白的介導，eNOS可以和Cav-1解離，但不會離開，這增加了合成NO的能力。當Cav-1過表達，eNOS和Cav-1結合過多導致NO合成減少。以上這些均會導致高血壓的發(fā)生。因此，選用Hcy對實驗細胞進行損傷。

高血壓病和內(nèi)皮細胞功能障礙之間有密不可分的關系。高血壓是內(nèi)皮損傷的始動因素之一，在高血壓病理狀態(tài)下，主要表現(xiàn)為內(nèi)皮依賴性舒張功能減弱或內(nèi)皮依賴性收縮功能增強以及血管壁炎癥反應的增強。高血壓患者血流動力增加，影響血管內(nèi)皮細胞的PI3K和AKT的分泌，可引起血管內(nèi)皮損害，形態(tài)和結構的改變和功能的失調(diào)，同時使氧自由基增多，進而引起收縮血管物質(zhì)增加，使擴張血管物質(zhì)減少而導致血管變形。因此，選用人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞為實驗細胞，通過檢測ROS和PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達，確證吳茱萸堿對細胞的保護作用及其機制。

目前明確有降壓作用的中藥和有效成份較多，如鉤藤、葛根、天麻、牛膝、吳茱萸等。吳茱萸具有降血壓的作用來源已久，其降血壓機制是通過多種活性成分和多種機制產(chǎn)生的。其中主要包括吳茱萸堿，次吳茱萸堿以及去氫吳茱萸堿等，但是關于降血壓的作用現(xiàn)在只有去氫吳茱萸堿有過報道，關于吳茱萸堿的降血壓作用并未見報道。因此，選用吳茱萸堿作為藥物對研究吳茱萸在臨床應用中具有指導意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的在于提供吳茱萸堿在制備保護人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的藥物中的應用。本發(fā)明確證了吳茱萸中吳茱萸堿具有藥物活性，對同型半胱氨酸損傷的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞具有保護作用。

優(yōu)選地，所述的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞為HUVEC。

優(yōu)選地，吳茱萸堿在同型半胱氨酸損傷的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞有效作用濃度為7.5-30μmol/L。

本發(fā)明的第二個目的在于提供吳茱萸堿在制備降血壓的藥物中的應用。

有益效果：本發(fā)明提供了吳茱萸堿在制備保護人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的藥物中的應用，證實了吳茱萸堿對同型半胱氨酸損傷的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞有效作用濃度7.5-60μmol/L，效果好，用量少，副作用小。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了吳茱萸堿保護人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的作用機制其保護人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞作用通路是通過PI3K/Akt信號通路。

附圖說明

圖1為Hcy對HUVEC損傷的時間和劑量關系圖；

圖2為吳茱萸堿濃度和細胞相對活力關系圖；

圖3為吳茱萸堿濃度和活性氧關系圖；

圖4為吳茱萸堿濃度和PI3K關系圖；

圖5為吳茱萸堿濃度和p-Akt/Akt關系圖。

具體實施方式

實施例1細胞損傷模型的建立

分組：實驗分為空白組、對照組、不同濃度Hcy組；每組設置6個復孔。

細胞模型建立：

(1)收集對數(shù)期HUVEC細胞，待細胞長滿85％后，吸出原來培養(yǎng)基，實驗組加入不同濃度Hcy溶液200μL，對照組和空白組加入培養(yǎng)基200μL，每孔終體積200μL。

(2)放置在5％CO2，37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育6、12、18、24、30h，倒置顯微鏡下觀察；每孔加入20μLMTT溶液，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。

(3)將上清液吸凈，每孔加入150μLDMSO，搖床避光震蕩10min使藍色結晶物充分溶解。

(4)用酶標儀在490nm波長處測量各孔的吸光度。

設對照組的細胞相對活力為1，其他組的細胞相對活力為實驗組與對照組的比值，圖1中縱坐標為細胞相對活力，橫坐標為6、12、18、24、30h下空白組、4、2、1、0.5mmol/L濃度Hcy損傷的細胞相對活力。根據(jù)圖1確定Hcy最終損傷濃度為0.5mmol/L，時間為6h。

表1：Hcy對HUVEC損傷的時間和劑量關系

實施例2吳茱萸堿對細胞活性的影響

藥物作用濃度建立：

(1)收集對數(shù)期HUVEC細胞，待細胞長滿85％后，吸出原來培養(yǎng)基，實驗組加入1mmol/L Hcy溶液100μL和不同藥物濃度溶液各100μL，造模組加入0.5mmol/L Hcy 200μL，對照組和空白組加入培養(yǎng)基200μL，陽性對照組加入1mmol/L Hcy溶液100μL和200μmol/L去氫吳茱萸堿100μL，每孔終體積200μL。

(2)放置在5％CO₂，37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育6h，倒置顯微鏡下觀察；每孔加入20μL MTT溶液，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。

(3)將上清液吸凈，每孔加入150μL DMSO，搖床避光震蕩10min使藍色結晶物充分溶解。

(4)用酶標儀在490nm波長處測量各孔的吸光度。

設對照組的細胞相對活力為1，其他組的細胞相對活力為實驗組與對照組的比值，圖2中為對照組、陽性對照組、模型組以及不同濃度吳茱萸堿下細胞相對活力。根據(jù)圖2確定吳茱萸堿最終有效濃度為7.5-30μmol/L，相對已知降壓藥物去氫吳茱萸堿具有更高的活性且濃度低，副作用小。

表2：吳茱萸堿濃度和細胞活力關系

注：與對照組相比**P＜0.01，*P＜0.05

實施例3吳茱萸堿對ROS的影響

(1)將細胞鋪于6孔板，待細胞長到50％左右后，吸出原來培養(yǎng)基，實驗組加入1mmol/L Hcy溶液1mL和不同藥物濃度溶液各1mL，造模組加入0.5mmol/L Hcy 2mL，對照組加入培養(yǎng)基2mL，每孔終體積2mL。

(2)放置在5％CO₂，37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育6h，倒置顯微鏡下觀察，吸出原來培養(yǎng)基，預冷的PBS洗3遍，加入含1μmol/L DCFH-DA預冷的PBS，37℃孵育細胞60min。

(3)吸出原來PBS，用預冷的PBS洗3遍，加入500μL多聚甲醛，放置37℃恒溫箱中固定15min。

(4)倒去多聚甲醛，用預冷的PBS洗3遍，最后加入2mL預冷的PBS。在熒光顯微鏡下觀察細胞。

圖3分別為對照組、30μmol/L、15μmol/L、7.5μmol/L濃度吳茱萸堿、模型組下ROS的熒光。根據(jù)圖3表明Hcy能夠增加ROS，吳茱萸堿可以降低ROS，其中ROS與吳茱萸堿濃度呈負相關性。

實施例4吳茱萸堿對PI3K/Akt蛋白的影響

(1)將細胞培養(yǎng)于60mm細胞培養(yǎng)皿，待細胞長到80％左右后，吸出原來培養(yǎng)基，實驗組加入1mmol/L Hcy溶液1mL和不同藥物濃度溶液各2mL，造模組加入0.5mmol/L Hcy 4mL，對照組加入培養(yǎng)基4mL，每皿終體積4mL。

(2)放置在5％CO₂，37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育6h，倒置顯微鏡下觀察，吸出原來培養(yǎng)基，預冷的PBS洗3遍，用試劑盒提取細胞總蛋白。

(3)Western Blot檢測蛋白表達。

根據(jù)圖4和圖5確定Hcy能夠降低PI3K和p-Akt/Akt的表達，藥物能夠增加PI3K和p-Akt/Akt，并且PI3K和p-Akt/Akt表達量與吳茱萸堿濃度呈劑量依賴性。