尼泊爾黃堇有效部位及其制備方法和應(yīng)用，屬于植物提取物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

尼泊爾黃堇(Corydalis hendersoniiHemsl .)主要分布于我國的新疆西部、青海西部、西藏中部至西部，生于海拔4200-5200米的河灘地或流石灘?？耸裁谞柡湍岵礌栆灿蟹植?。尼泊爾黃堇作為傳統(tǒng)藏藥“日棍” , 主要用于治療發(fā)熱和高血壓, 另外對(duì)肝炎也有一定的療效[參見：中國科學(xué)院.西北高原生物研究所.藏藥志[ M] .青海：青海人民出版社, 1991 ：350-351. ]。該藏藥材含有豐富的異喹啉生物堿[參見：FU Y, ZHOU Y , LIAO X, et al.A new alkaloidfrom Cory dalis hendersonii [ J] .Planta Medica ,2009 , 75：547-549 .]?！恫乇静荨酚涊d全草治脈管炎，血熱病，高山多血癥，腸炎，潰瘍，“木呆”病，脈熱病，神經(jīng)發(fā)燒，熱性腹瀉。

惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病之一，已成為人類致死的首要原因。惡性癌細(xì)胞的防治已成為醫(yī)學(xué)界所關(guān)注的重要課題。但是，惡性腫瘤發(fā)病隱匿，病因復(fù)雜，病理變化多樣，對(duì)其治療仍局限于癌癥疾病的多樣性及反復(fù)性。盡管不同的癌癥的致癌原因可能不盡相同，但其組織觀察均表現(xiàn)出相似的細(xì)胞周期紊亂以及迅速不可控制的細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移。因此，對(duì)參與細(xì)胞周期調(diào)控的一些家族蛋白的研究在推動(dòng)癌癥治療中成為重要因素。其中，細(xì)胞分裂周期激酶（Cdk/cyclins）作為真核細(xì)胞周期的主要調(diào)控蛋白，負(fù)責(zé)推動(dòng)相應(yīng)階段的細(xì)胞分裂。CDC25 磷酸蛋白酶（CDC25 phosphatases）作為細(xì)胞分裂周期蛋白激酶家族（Cdk/cyclins）的活化蛋白酶，在真核細(xì)胞的分裂周期中起了十分重要的調(diào)節(jié)作用。目前臨床研究表明，這一家族的蛋白酶在多種癌癥組織中均表現(xiàn)出過量的表達(dá)，且往往與較差的癌癥早期預(yù)測(cè)有關(guān)，這些均使CDC25磷酸蛋白酶成為具有巨大潛力的癌癥治療藥物靶標(biāo)。近年來，許多關(guān)于CDC25磷酸蛋白酶家族的酶學(xué)研究為相關(guān)抑制劑及癌癥藥物的研發(fā)提供了相當(dāng)重要的信息。

申請(qǐng)人在研究中發(fā)現(xiàn)：目前抗腫瘤藥物的原料較少，特別是用于制備抑制CDC25 磷酸蛋白酶（簡稱CDC25 酶）藥物的中藥原料較為匱乏?，F(xiàn)有技術(shù)中，尼泊爾黃堇主治脈管炎，血熱病，高山多血癥，腸炎，潰瘍，“木呆”病，脈熱病，神經(jīng)發(fā)燒，熱性腹瀉。目前，尚未見到尼泊爾黃堇及其有效部位抗CDC25A和CDC25B酶作用研究和應(yīng)用方面的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供尼泊爾黃堇有效部位及其制備方法和應(yīng)用，該尼泊爾黃堇有效部位能有效抑制CDC25A酶和CDC25B酶的活性，用于制備抑制CDC25酶藥物，具有較好的抗腫瘤作用。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：該尼泊爾黃堇有效部位，其特征在于：選自尼泊爾黃堇乙酸乙酯部位、尼泊爾黃堇正丁醇部位、尼泊爾黃堇水相萃取部位中的一種或兩種以上的任意質(zhì)量比的混合物。

該尼泊爾黃堇有效部位，其特征在于：選自尼泊爾黃堇乙酸乙酯部位。

該尼泊爾黃堇有效部位的制備方法，其特征在于，包括下述步驟：將尼泊爾黃堇全草粉碎，加入體積百分比濃度65%~95%乙醇溶液回流提取，將所得提取液濃縮、干燥，得浸膏；將浸膏加蒸餾水分散，得浸膏分散液，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作為溶劑萃取浸膏分散液，揮去溶劑后得尼泊爾黃堇乙酸乙酯部位、尼泊爾黃堇正丁醇部位；將萃取后的浸膏分散液濃縮、干燥，得尼泊爾黃堇水相萃取部位。

優(yōu)選的，所述的回流提取為超聲波輔助回流提取，超聲波輔助回流提取的具體操作為：將粉碎后的尼泊爾黃堇全草加入體積百分比濃度65%~95%乙醇溶液超聲波提取0.5~3小時(shí)，過濾，濾渣加入體積百分比濃度65%~95%乙醇溶液回流提取1~3次，合并提取液，即得。

該尼泊爾黃堇有效部位的應(yīng)用，其特征在于：在制備抑制CDC25酶藥物方面的應(yīng)用。

所述抑制CDC25酶藥物是通過尼泊爾黃堇乙酸乙酯部位、尼泊爾黃堇正丁醇部位、尼泊爾黃堇水相萃取部位中的一種或兩種以上的任意質(zhì)量比的混合物，與藥用輔料混合制成的口服制劑或注射制劑。

所述的注射制劑為脂質(zhì)體注射劑、納米粒注射劑或微球注射劑。

所述的口服制劑為散劑、片劑、顆粒劑、膠囊劑或溶液劑。

申請(qǐng)人對(duì)于本發(fā)明的說明如下：現(xiàn)有技術(shù)中，尼泊爾黃堇常規(guī)用途為治療脈管炎和血熱病，未見其有抗腫瘤功效的相關(guān)報(bào)道。申請(qǐng)人通過大量研究發(fā)現(xiàn)：尼泊爾黃堇中的部分提取物還具有抗菌、抗腫瘤的作用，但是其功效不明顯，不能確定其具體的有效部位。因此通過怎樣的溶劑、采用怎樣制備方法，才能獲得抑制CDC25酶活性效果最好的有效部位，是必須要解決的問題。申請(qǐng)人通過研究發(fā)現(xiàn)：采用本發(fā)明制備方法，篩選出的尼泊爾黃堇乙酸乙酯部位、尼泊爾黃堇正丁醇部位和尼泊爾黃堇水相萃取部位，其抑制CDC25酶效果較好。經(jīng)申請(qǐng)人進(jìn)一步分析，尼泊爾黃堇乙酸乙酯部位對(duì)于CDC25A酶和CDC25B酶的抑制效果最優(yōu)。

制備方法中，可以只采用回流提取。優(yōu)選采用超聲波輔助回流提取，具有較高的收率和提取效率。超聲波輔助回流提取的具體操作為：超聲波提取后，過濾獲得超聲波提取液和濾渣，向?yàn)V渣中加質(zhì)量百分比濃度65%~95%乙醇水溶液回流提取，合并超聲波提取液和回流提取液。進(jìn)一步的說明，回流提取的具體操作為：向回流加熱裝置中直接加入粉碎后的藥材或加入超聲波提取后的濾渣，加入乙醇水溶液，加熱提取，放冷過濾得一次提取液和濾渣；再向?yàn)V渣中加入乙醇水溶液，加熱、進(jìn)行第二次回流提取，放冷過濾得二次提取液和濾渣（以上為回流提取2次）；合并多次提取液，即得回流提取液。優(yōu)選的，每次回流提取0.5~2小時(shí)；每次回流提取時(shí)所加乙醇溶液沒過藥材表面1cm~2cm?；亓魈崛〉臏囟葹橐掖蓟亓魈崛〉某Ｒ?guī)溫度，需高于乙醇的沸點(diǎn)，優(yōu)選為80℃~100℃。

制備方法中，浸膏為粗提取物，采用不同的溶劑萃取浸膏分散液，指的是依次將石油醚加入浸膏分散液萃取分離獲得石油醚萃取液、將乙酸乙酯加入浸膏分散液萃取分離獲得乙酸乙酯萃取液、將正丁醇加入浸膏分散液萃取分離獲得正丁醇萃取液；取乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液分別揮發(fā)去除溶劑后，所得即選自尼泊爾黃堇乙酸乙酯部位和尼泊爾黃堇正丁醇部位；將萃取后剩余的浸膏分散液（溶劑為水），揮發(fā)去除溶劑即得尼泊爾黃堇水相萃取部位。水相萃取部位也可以稱作水相萃取物，水相萃取部位易溶于水。其中，尼泊爾黃堇乙酸乙酯部位含有游離生物堿、黃酮類化合物；尼泊爾黃堇正丁醇部位含有皂苷和酚類化合物；尼泊爾黃堇水相萃取部位含有多糖和有機(jī)酸類化合物。揮去溶劑即揮發(fā)去除溶劑。揮去溶劑可以采用常壓加熱使溶劑（石油醚、乙酸乙酯和正丁醇）揮發(fā)。優(yōu)選的，揮去溶劑采用減壓濃縮，該方法效率高，并且能避免熱敏性成分因高溫喪失藥性。

優(yōu)選的劑型為口服制劑或注射制劑?？诜苿┖妥⑸渲苿樽罴呀o藥途徑，此處所述口服制劑為經(jīng)腸胃道給藥制劑，優(yōu)選的，口服制劑為緩釋、控釋型口服制劑。也可以為非腸胃給藥的其他，如呼吸道給藥制劑（噴霧劑、氣霧劑、粉霧劑）；皮膚給藥制劑（外用溶液劑、洗劑、搽劑、軟膏劑、硬膏劑、糊劑、貼劑）；膜給藥制劑（滴眼劑、滴鼻劑、眼用軟膏、含漱劑、舌下片劑）；腔道給藥制劑（栓劑）。注射制劑可以為常規(guī)注射制劑。根據(jù)藥物傳遞系統(tǒng)進(jìn)行分類，優(yōu)選的，本發(fā)明的注射制劑為脂質(zhì)體注射劑、納米粒注射劑或微球注射劑；其他的，本發(fā)明的注射劑還可以為微囊注射劑、聚合物膠束注射劑、微乳或亞微乳注射劑、亞微粒注射劑或凝膠注射劑，以上藥物傳遞系統(tǒng)的注射劑能延長藥物載體在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間、延長載藥微粒在吸收部位的停留時(shí)間、控制藥物在釋放初期的突釋效應(yīng)。藥用輔料包括藥物載體，以及溶劑、增溶劑、助溶劑、乳化劑、助懸劑、潤濕劑、澄清劑、反絮凝劑、矯味劑、著色劑、防腐劑、化學(xué)滅菌劑、吸附劑、助濾劑、抗氧劑、pH調(diào)節(jié)劑、等滲調(diào)節(jié)劑、稀釋劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、抗粘著劑、緩釋劑、控釋劑、包衣材料、成膜材料、膠囊材料中的一種或多種。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的尼泊爾黃堇有效部位及其制備方法和應(yīng)用所具有的有益效果是：

1、該尼泊爾黃堇有效部位能有效抑制CDC25A酶和CDC25B酶的活性，用于制備抑制CDC25酶藥物，具有較好的抗腫瘤作用。申請(qǐng)人在研究中發(fā)現(xiàn)抑制CDC25酶藥物原料匱乏，經(jīng)大量研究確定現(xiàn)有技術(shù)中功效為治療脈管炎和血熱病的尼泊爾黃堇，還具有抗腫瘤的功效。申請(qǐng)人設(shè)計(jì)制備方法提取有效部位，并且首次在CDC25A酶和CDC25B酶上進(jìn)行藥效篩選，通過大量研究確定尼泊爾黃堇乙酸乙酯部位、尼泊爾黃堇正丁醇部位、尼泊爾黃堇水相萃取部位中的一種或兩種以上的任意質(zhì)量比的混合物均具有較好的抑制CDC25A酶和CDC25B酶活性，其CDC25A酶存活率6.0%~37.3%、CDC25B酶存活率12.6%~45.3%，能夠用于開發(fā)成抗腫瘤藏藥新藥。由于不同溶劑萃取獲得的各有效部位對(duì)CDC25A酶和CDC25B酶活抑制能力不同，申請(qǐng)人通過進(jìn)一步的研究確定：尼泊爾黃堇乙酸乙酯部位的抑制CDC25酶效果最優(yōu)，其 CDC25A酶存活率6.0%、CDC25B酶存活率12.6%。申請(qǐng)人在以上過程中付出了大量的創(chuàng)造性勞動(dòng)。

2、該尼泊爾黃堇有效部位的制備方法提取方便，提取效率高。制備方法中，申請(qǐng)人設(shè)計(jì)加入體積百分比濃度65%~95%乙醇溶液進(jìn)行超聲波輔助回流提取，提高了提取效率；萃取中，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作為溶劑萃取浸膏分散液，采用以上溶劑萃取順序所得的尼泊爾黃堇乙酸乙酯部位、尼泊爾黃堇正丁醇部位和尼泊爾黃堇水相萃取部位具有較好的抑制CDC25酶的效果。

3、本發(fā)明拓展了抑制CDC25A酶和CDC25B酶藥物的原料渠道，擴(kuò)大了尼泊爾黃堇的用途，使尼泊爾黃堇發(fā)展成為抑制CDC25A酶和CDC25B酶藥物的新原料，可顯著提高尼泊爾黃堇的附加值。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1~3是本發(fā)明的尼泊爾黃堇有效部位及其制備方法的具體實(shí)施方式，其中實(shí)施例1為最佳實(shí)施例。

實(shí)施例1

制備方法，包括下述步驟：將尼泊爾黃堇全草粉碎，采用體積百分比濃度75~85%乙醇溶液超聲波提取1小時(shí)，然后過濾得超聲波提取液和濾渣，濾渣加入體積百分比濃度75~85%乙醇溶液回流提取3次，每次0.5小時(shí)，得回流提取液，合并聲波提取液和回流提取液、濃縮干燥得浸膏；將浸膏加蒸餾水分散，得浸膏分散液，然后依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作為溶劑萃取浸膏分散液，取乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液分別揮去溶劑，得到尼泊爾黃堇乙酸乙酯部位；將浸膏分散液萃取后剩余液體濃縮、干燥，得尼泊爾黃堇水相萃取部位。

實(shí)施例2

制備方法，包括下述步驟：將尼泊爾黃堇全草粉碎，采用體積百分比濃度85~95%乙醇溶液超聲波提取3小時(shí)，然后過濾得超聲波提取液和濾渣，濾渣加入體積百分比濃度85~95%乙醇溶液回流提取3次，每次1小時(shí)，得回流提取液，合并聲波提取液和回流提取液、濃縮干燥得浸膏；將浸膏加蒸餾水分散，得浸膏分散液，然后依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作為溶劑萃取浸膏分散液，取乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液分別揮去溶劑，得到尼泊爾黃堇乙酸乙酯部位；將浸膏分散液萃取后剩余液體濃縮、干燥，得尼泊爾黃堇水相萃取部位。

實(shí)施例3

制備方法，包括下述步驟：將尼泊爾黃堇全草粉碎，采用體積百分比濃度65~75%乙醇溶液超聲波提取0.5小時(shí)，然后過濾得超聲波提取液和濾渣，濾渣加入體積百分比濃度65~75%乙醇溶液回流提取2次，每次2小時(shí)，得回流提取液，合并聲波提取液和回流提取液、濃縮干燥得浸膏；將浸膏加蒸餾水分散，得浸膏分散液，然后依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作為溶劑萃取浸膏分散液，取乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液分別揮去溶劑，得到尼泊爾黃堇乙酸乙酯部位；將浸膏分散液萃取后剩余液體濃縮、干燥，得尼泊爾黃堇水相萃取部位。

將實(shí)施例1~3萃取所得石油醚萃取液分別揮去溶劑，得實(shí)施例1~3尼泊爾黃堇石油醚部位，留作后續(xù)性能測(cè)試使用。

性能測(cè)試

分別各取0.4mg干燥后的尼泊爾黃堇石油醚部位、尼泊爾黃堇乙酸乙酯部位、尼泊爾黃堇水相萃取部位，各自溶解于100μL的二甲基亞砜（DMSO）中形成DMSO溶液，超聲5分鐘。再分別取1μL溶解樣品的DMSO溶液，各加入緩沖液99μL，分別得到用于檢測(cè)尼泊爾黃堇抑制HDAC1酶的尼泊爾黃堇石油醚部位的緩沖溶液、尼泊爾黃堇乙酸乙酯部位的緩沖溶液、尼泊爾黃堇正丁醇部位的緩沖溶液和尼泊爾黃堇水相萃取部位的緩沖溶液。緩沖液的配方為：分別取0.2423gTris-HCl、0.5138gNaCl、0.0330gBSA、0.0154gDTT、0.0167g EDTA于50mL燒杯中，加蒸餾水溶解并混勻，再加入0.5mol/L NaOH水溶液將pH調(diào)節(jié)至 8.4，然后定容至100mL容量瓶中，于4℃保存，作為儲(chǔ)備緩沖液（buffer）。

一、抑制CDC25A酶和CDC25B酶實(shí)驗(yàn)。

主要實(shí)驗(yàn)材料為：

CDC25A酶、CDC25B酶，北京樂博生物科技有限公司產(chǎn)品；

Tris-HCl，上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；

EDTA，上海居里生物科技有限公司；

DTT，上海生工生物工程股份有限公司；

BSA，上海江萊生物科技有限公司；

DMSO，上海伊卡生物技術(shù)有限公司；

Na Cl（分析純），天津紅巖化學(xué)試劑廠；

NaOH（分析純），天津河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠。

主要實(shí)驗(yàn)儀器為：

FLUOstar Omega全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀，廣東省廣州伯齊生物科技有限公司；

MP511型pH計(jì)電計(jì)，上海三信有限公司；

BRAND8道移液槍，浙江杭州匯爾儀器有限公司；

500μL移液槍、50μL移液槍，上海榮泰生化儀器有限公司；

電子天平XPE105，梅特勒-托利多儀器有限公司。

以實(shí)施例1得到的尼泊爾黃堇各部位為測(cè)試物，檢測(cè)尼泊爾黃堇各部位抑制CDC25A酶和CDC25B酶的活性。

其方法是：分別取2.7μL 330μmol/L FDP、1.8μL 100μmol/L測(cè)試物、2μL 0.1μmol/L CDC25A/CDC25B、11.5μL FDP buffer組成18μL體系的實(shí)驗(yàn)組；然后取2.7μL 330μmol/L FDP、2μL 0.1 μmol/L CDC25A/CDC25B、13.3μL FDP buffer組成18μL體系的對(duì)照組1；再取2.7μL 330μmol/L FDP、1.8μL 100μmol/L測(cè)試物、13.5μL FDP buffer組成18μL體系的對(duì)照組2；將需要加CDC25A/CDC25B酶的體系于37℃條件下孵育60 min，之后加酶，于同樣條件下反應(yīng)60 min，待反應(yīng)完全，檢測(cè)在485nm激發(fā)光作用下反應(yīng)產(chǎn)物于520nm處的熒光強(qiáng)度。對(duì)照組在不加入測(cè)試物在同樣條件下進(jìn)行：酶存活效率（%）= 實(shí)驗(yàn)組測(cè)定值/對(duì)照組1測(cè)定值×100%其中酶存活效率越低，說明測(cè)試樣品對(duì)組蛋白磷酸化酶CDC25A/CDC25B的抑制效果越強(qiáng)。

表1 尼泊爾黃堇有效部位抑制CDC25A酶和CDC25B酶的活性測(cè)試結(jié)果

。

通過表1可以看出：尼泊爾黃堇乙酸乙酯部位、尼泊爾黃堇乙酸乙酯部位和尼泊爾黃堇水相萃取部位對(duì)于CDC25A酶CDC25B酶存在較好的抑制效果。

二、抗腫瘤活性測(cè)試。

利用MTT法測(cè)定尼泊爾黃堇有效部位對(duì)人腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。分別取實(shí)施例1所得尼泊爾黃堇浸膏、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水相萃取部位適量，作為受試化合物，加DMSO溶解后，利用MTT法分別測(cè)定對(duì)人結(jié)腸癌HCT-8、人肝癌Bel-7402細(xì)胞、人胃癌BGC-803細(xì)胞、人肺腺癌A549細(xì)胞和人卵巢癌A2780細(xì)胞生長的抑制率。

實(shí)驗(yàn)方法：將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，用0.25%胰酶-EDTA消化后，配制成一定濃度的單細(xì)胞懸液，根據(jù)細(xì)胞生長速度的差異，按800~2000個(gè)/孔接種于96孔板，每孔加入細(xì)胞懸液100 μL。24h后，加入含不同濃度受試化合物及相應(yīng)溶劑對(duì)照的新鮮培養(yǎng)基，每孔加100 μL（DMSO終濃度<0.1%），每種受試化合物設(shè)5~7個(gè)劑量組，每組至少設(shè)3個(gè)平行孔，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)72h后，棄上清液，每孔加入100 μL新鮮配制的含0.5mg/mL MTT的無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清液后，每孔加入200 μL DMSO溶解MTT甲簪沉淀，微型振蕩器振蕩混勻，用酶標(biāo)儀在參考波長450nm，檢測(cè)波長570nm條件下測(cè)定光密度值(OD)，以溶劑對(duì)照處理的腫瘤細(xì)胞為對(duì)照組，用以下公式計(jì)算受試化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率，并按中效方程計(jì)算IC₅₀：抑制率=（對(duì)照組平均OD值－給藥組平均OD值）÷對(duì)照組平均OD值×100%。將制備方法中的浸膏、以及所得的尼泊爾黃堇石油醚部位、尼泊爾黃堇乙酸乙酯部位、尼泊爾黃堇正丁醇部位、尼泊爾黃堇水相萃取部位進(jìn)行體外腫瘤細(xì)胞毒活性篩選，結(jié)果見表2。

表2 體外腫瘤細(xì)胞毒活性篩選結(jié)果

。

注：1）、HCT-8為人結(jié)腸癌細(xì)胞，Bel-7402為人肝癌細(xì)胞，BGC-823為人胃癌細(xì)胞，A549為人肺癌細(xì)胞，A2780為人卵巢癌細(xì)胞。2）、>50表明不具有抗細(xì)胞毒活性。通過表2可看出：尼泊爾黃堇乙酸乙酯部位、尼泊爾黃堇正丁醇部位、尼泊爾黃堇水相萃取部位確實(shí)有較好的抗腫瘤的效果。

三、體外S₁₈₀荷瘤小鼠抗腫瘤實(shí)驗(yàn)。

1、實(shí)施例1各部位的S₁₈₀荷瘤小鼠抗腫瘤實(shí)驗(yàn)方法如下：

a）5~6周齡昆明小鼠，隨機(jī)選鼠分組，每組10只，每組雌雄各半；分組名稱為：空白對(duì)照組，環(huán)磷酰胺組，給藥組；給藥組包括：尼泊爾黃堇石油醚部位低、中、高劑量組，尼泊爾黃堇乙酸乙酯部位低、中、高劑量組，尼泊爾黃堇正丁醇部位低、中、高劑量組，尼泊爾黃堇水相萃取部位低、中、高劑量組；對(duì)每只小鼠進(jìn)行皮膚消毒；

b）于右前肢皮下接種S₁₈₀瘤液0.2ml（S₁₈₀瘤細(xì)胞數(shù)在2.0×10⁶~2.2×10⁶范圍內(nèi)）；

c）步驟b）接種24小時(shí)后給藥；空白對(duì)照組灌胃給藥10mL/kg注射用生理鹽水；環(huán)磷酰胺組腹腔注射環(huán)磷酰胺20mg/kg；給藥組采用灌胃給藥實(shí)施例1制得的尼泊爾黃堇石油醚部位、尼泊爾黃堇乙酸乙酯部位、尼泊爾黃堇正丁醇部位和尼泊爾黃堇水相萃取部位；首次給藥后，隔日稱小鼠首次體重；每組每天給藥1次，每次給藥劑量詳見表3，連續(xù)給藥14天；

d）末次給藥1小時(shí)后，處死小鼠，稱小鼠末次體重，剝瘤塊稱重，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=（空白對(duì)照組平均瘤重－給藥組平均瘤重）÷空白對(duì)照組平均瘤重×100%，將抑瘤率計(jì)算結(jié)果錄入表3。

表3 實(shí)施例1各部位對(duì)小鼠S₁₈₀實(shí)體瘤的影響

。

2、實(shí)施例2各部位的S₁₈₀荷瘤小鼠方法同實(shí)施例1，數(shù)據(jù)錄入表4。

表4 實(shí)施例2各部位對(duì)小鼠S₁₈₀實(shí)體瘤的影響

。

3、實(shí)施例3各部位的S₁₈₀荷瘤小鼠抗腫瘤實(shí)驗(yàn)的方法同實(shí)施例1，數(shù)據(jù)錄入表5。

表5實(shí)施例3各部位對(duì)小鼠S₁₈₀實(shí)體瘤的影響

。

經(jīng)申請(qǐng)人統(tǒng)計(jì)：給藥組與空白對(duì)照組相比，小鼠體重變化無顯著性差異（P>0.05）。表3~5中：S₁₈₀是指小鼠腹水瘤細(xì)胞，表3~5中抑瘤率數(shù)值越大表示抗腫瘤效果越好。由表3~5可以看出：首先，實(shí)施例1~3均有較好的抗腫瘤效果，實(shí)施例1~3各部位的抗腫瘤效果無明顯差別。其次，與空白對(duì)照組相比，尼泊爾黃堇乙酸乙酯部位中、高劑量組，尼泊爾黃堇正丁醇中、高劑量組，尼泊爾黃堇水相萃取部位中、高劑量組，環(huán)磷酰胺化療組，均可顯著抑制S₁₈₀腫瘤的生長。

實(shí)施例4

將尼泊爾黃堇有效部位制備為片劑，采用如下步驟：將尼泊爾黃堇乙酸乙酯部位300mg和淀粉100mg混勻，加體積百分比濃度10%的淀粉糊40mg制成軟材，過篩得濕顆粒，干燥得干顆粒，整粒，加硬脂酸鎂4mg混勻、壓片，即得。

實(shí)施例5

沖劑的制備方法：按重量份配比將尼泊爾黃堇水相萃取部位5份、蔗糖1份、糊精3份混勻，加入適量質(zhì)量百分比95%乙醇溶液2~5份，邊加邊攪拌，制得軟材，將軟材干燥、過16目篩，分裝即得。

實(shí)施例6

微丸膠囊由以下重量份原料組成：尼泊爾黃堇正丁醇部位30份、卵磷脂5份、牛黃膽酸鈉5份、微晶纖維素30份；

微丸膠囊的制備方法：按配比將尼泊爾黃堇正丁醇部位、卵磷脂、牛黃膽酸鈉和微晶纖維素混均，倒入乙醇水溶液攪勻獲得軟材，將軟材倒入擠出機(jī)中擠出，經(jīng)滾圓獲得顆粒，擠出轉(zhuǎn)速250r/min，滾圓轉(zhuǎn)速800r/min，滾圓時(shí)間20min，干燥、過24~30目篩獲得微丸，將微丸灌裝入膠囊殼內(nèi)，即得。

實(shí)施例7

脂質(zhì)體注射劑的制備方法：

1）在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將50g膽固醇琥珀酸酯、250g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、40g大豆卵磷脂、50g泊洛沙姆-188、和10g尼泊爾黃堇正丁醇部位溶解于1500ml體積比為1：1的乙醇和正丁醇的有機(jī)溶劑中，攪拌使其溶解獲得混懸液；將混懸液通過減壓濃縮揮去有機(jī)溶劑，獲得磷脂膜；

2）在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，向磷脂膜中加入8000ml pH為6.8的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌，使磷脂膜洗脫并充分溶脹水合，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，得尼泊爾黃堇正丁醇部位的脂質(zhì)體；

3）在無菌條件下，向尼泊爾黃堇正丁醇部位的脂質(zhì)體中，加入100g海藻糖，攪拌均勻，超聲波處理0.5~1小時(shí)，加注射用水定容，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，灌裝，即得尼泊爾黃堇正丁醇部位的脂質(zhì)體注射劑。

實(shí)施例8

納米粒注射劑的制備方法：取25g尼泊爾黃堇乙酸乙酯部位和100g泊洛沙姆407用3000ml 無水乙醇溶解，加入30ml 1mol/L氯化鋅的乙醇溶液，攪拌混合，超聲波處理0.5~1小時(shí)使其溶解，獲得混合液；將混合液減壓濃縮揮去溶劑，放入-20℃冰箱冷凍2小時(shí)；取出加注射用水定容，超聲波處理0.5~1小時(shí)，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，灌裝，即得尼泊爾黃堇乙酸乙酯部位的納米粒注射劑。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對(duì)本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。