本發(fā)明涉及多肽提取
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種動物睪丸提取物的制備方法。
背景技術(shù)：
：隨著現(xiàn)代化生活節(jié)奏的加快，社會競爭日趨激烈，人際關(guān)系復雜緊張，人的心理失衡所致亞健康狀態(tài)的情況日趨嚴重。亞健康狀態(tài)是指無臨床癥狀或癥狀感覺輕微，但已有潛在病理信息的機體狀態(tài)，這是一類次等健康狀態(tài)，界乎健康與疾病之間。世界衛(wèi)生組織將機體無器質(zhì)性病變，但是有一些功能改變的狀態(tài)稱為“第三狀態(tài)”，即為亞健康狀態(tài)。亞健康狀態(tài)表現(xiàn)為一定時間的活力下降、功能和適應(yīng)能力減退的癥狀。處于亞健康狀態(tài)的人，如果及時進行疏導，會走出亞健康陰影，如果任其發(fā)展，則會轉(zhuǎn)成疾病。亞健康高危人群中，糖尿病、高血壓、腫瘤又是高危中的高危，如果不及時干預(yù)，會威脅人的生命，導致40歲就早亡的局面。根據(jù)病情的嚴重程度，亞健康狀態(tài)包含著前后銜接的幾個階段：其中，與健康緊緊相鄰的可稱作“輕度心身失調(diào)”，它常以疲勞、失眠、胃口差、情緒不穩(wěn)定等為主癥，但是這些失調(diào)容易恢復，恢復了則與健康人并無不同，輕度心身失調(diào)狀態(tài)人群約占總?cè)巳旱?5％～28％。這種失調(diào)若持續(xù)發(fā)展，可進入“潛臨床”狀態(tài)，此時已呈現(xiàn)出發(fā)展成某些疾病的高危傾向，潛伏著向某病發(fā)展的高度可能，潛臨床狀態(tài)人群超過總?cè)巳旱?/3，且在40歲以上的人群中比例陡增。可見，以慢性疲勞為主要癥狀的亞健康問題是21世紀威脅人類健康的重大問題，且發(fā)生率呈逐年增加的趨勢。因此，如何減少亞健康狀態(tài)人群，增加健康狀態(tài)人群成為近來國內(nèi)外醫(yī)學研究的熱點。動物睪丸內(nèi)含豐富的睪酮、動物蛋白和多肽，具有補腎壯陽、滋陰益精、抗疲勞、促進男性腺發(fā)育等的作用。睪酮又稱睪丸素或睪丸酮，由男性的睪丸或女性的卵巢分泌，腎上腺亦分泌少量睪酮，具有維持肌肉強度及質(zhì)量、維持骨質(zhì)密度及強度、提神及提升體能等作用。睪酮會影響許多身體系統(tǒng)和功能，包括：血生成，體內(nèi)鈣平衡，骨礦化作用，脂代謝，糖代謝和前列腺增長。它是主要的男性性激素及同化激素。不論是男性或女性，它對健康有著重要的影響，包括增強力量、免疫功能、對抗骨質(zhì)疏松癥等功效。養(yǎng)殖動物睪丸具有食材的的典型屬性，與其它補腎藥食同源原料相比，安全特性更高。目前公開的睪丸提取技術(shù)，多采用水提或酶輔助提取方法實現(xiàn)，提取產(chǎn)物未經(jīng)精制。而且，由于睪酮不溶于水，現(xiàn)有的提取方法損失了90％以上的睪酮，造成活性成分的極大損失，提取效率和產(chǎn)物活性都比較低。因此需要提供一種收率高且活性成分含量高的睪丸提取物制備方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供了一種動物睪丸提取物的制備方法。該制備方法獲得活性多肽的含量高，且產(chǎn)率較高。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種動物睪丸提取物的制備方法，包括以下步驟：步驟1：將動物睪丸勻漿，酶解提取，得到酶解粗提液和濾渣；步驟2：酶解粗提液經(jīng)超濾得到超濾液，超濾液再經(jīng)瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜方法去除高分子雜質(zhì)，得到酶解提取精制液；濾渣采用乙醇提取濃縮，得到濃縮醇提液；步驟3：將酶解提取精制液與濃縮醇提液混合，冷凍干燥，得到動物睪丸提取物。在本發(fā)明提供的一些實施例中，動物睪丸選自豬、牛、馬、羊、兔、狐貍中任意一種或幾種動物的睪丸。作為優(yōu)選，步驟1中酶解提取包括以下步驟：睪丸勻漿與水混合，調(diào)節(jié)pH至7.0～9.0；加入蛋白酶，37～50℃條件下酶解2～8小時，得到酶解液；酶解液升溫至80～95℃，保溫5～20分鐘，使酶滅活；滅酶后的酶解液經(jīng)過濾，得到酶解粗提液和濾渣。作為優(yōu)選，蛋白酶為胰蛋白酶或堿性蛋白酶的一種或兩種。作為優(yōu)選，蛋白酶的添加量為睪丸勻漿重量的0.1％～0.5％。在本發(fā)明提供的一些實施例中，步驟1中酶解提取包括以下步驟：步驟1：睪丸勻漿與水1:1混合，調(diào)節(jié)pH至7.0～9.0。步驟2：加入蛋白酶，37～50℃條件下酶解2～8小時。蛋白酶，為胰蛋白酶或堿性蛋白酶的一種或兩種，添加量為睪丸勻漿重量的0.1％-0.5％。步驟3：酶解液升溫至80～95℃，保溫5～20分鐘，使酶滅活。步驟4：滅酶后的酶解液經(jīng)300目紗布過濾，得到酶解粗提液和濾渣。作為優(yōu)選，步驟2中超濾采用的超濾膜的截留分子量為10KD。作為優(yōu)選，瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜為：采用具有親和配基的瓊脂糖凝膠為填料的親和層析色譜；親和配基為槲皮素配基、沒食子酸配基、β-環(huán)糊精配基的一種。在本發(fā)明提供的一些實施例中，瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜方法具體為：用水調(diào)節(jié)超濾液的多肽含量為15～45mg/mL，采用5～8mL/min的流速上樣吸附，上樣量為柱體積的10～20％；依次用初始流動相洗脫2倍柱床體積，純水洗脫2倍柱床體積，2％～9％乙酸線性梯度洗脫6～10倍柱床體積，最后用9％乙酸洗脫2倍柱床體積，洗脫流速10～30mL/min；收集吸光度為280nm、活性大于10％的洗脫峰，合并為酶解提取精制液。作為優(yōu)選，初始流動相為乙醇、乙酸和水組成的溶液，乙醇在初始流動相中的體積百分濃度為20％-30％，乙酸在初始流動相中的體積百分濃度為2～5％。作為優(yōu)選，乙醇提取濃縮包括以下步驟：(1)濾渣與乙醇水溶液按重量體積比1：(3～8)混合，50～100轉(zhuǎn)/分鐘攪拌提取1～3小時，所得提取液經(jīng)離心，收集上清液；重復提取2～3次后，合并上清液；(2)所得上清液經(jīng)減壓濃縮至原體積的1/10～1/8，得到濃縮醇提液，回收乙醇；減壓濃縮的濃縮壓力為0.05～0.15MP，減壓濃縮過程中控制上清液的溫度不超過65℃。在本發(fā)明提供的一些實施例中，乙醇提取濃縮包括以下步驟：(1)濾渣與95％乙醇按重量體積比1：3～8混合，50～100轉(zhuǎn)/分鐘攪拌提取1～3小時。提取物經(jīng)3000轉(zhuǎn)/分鐘離心10～20分鐘，收集上清液。重復提取2～3次后，合并離心上清液。(2)離心上清液經(jīng)減壓濃縮，至體積為原來的1/10～1/8，得到濃縮醇提液，回收乙醇。在本發(fā)明提供的實施例中，動物睪丸提取物的制備包括以下具體步驟：(1)動物睪丸剝離附睪脂肪，清洗除去表面少量血污后，膠體磨磨碎，得到睪丸勻漿。(2)睪丸勻漿與水按重量體積比1：1混合，調(diào)節(jié)混合液的pH值至7.0～9.0。(3)加入按睪丸勻漿重量的0.1％～0.5％加入蛋白酶，37～50℃酶解2～8小時。(4)酶解液升溫至80～95℃，保溫5～20分鐘，使酶滅活。(5)滅酶后的酶解液用300目紗布過濾，得到酶解粗提液和濾渣。(6)步驟(5)所得酶解粗提液經(jīng)10KD超濾膜超濾，得到超濾液。(7)步驟(6)所得超濾液經(jīng)瓊脂糖凝膠親和層析，收集合并，得到酶解精制液。(8)步驟(5)所得濾渣與95％乙醇按重量體積比1：3～8混合，50～100轉(zhuǎn)/分鐘攪拌提取1～3小時。提取物經(jīng)3000轉(zhuǎn)/分鐘離心10～20分鐘，收集上清液。重復提取2～3次后，合并離心上清液。(9)醇提上清液在0.05～0.15MP，溫度不超過65℃條件下減壓濃縮，回收乙醇，使醇提上清液體積濃縮至原來的1/10～1/8，得到濃縮醇提液。(10)步驟(7)得到的酶解提取精制液與濃縮醇提液混合，冷凍干燥，粉碎混勻，得到富含睪酮和活性肽的動物睪丸提取物。在本發(fā)明提供的實施例中，為提高提取物的生物活性，采用含親和配基的瓊脂糖凝膠層析色譜富集酶解提取超濾液中的活性肽類。瓊脂糖凝膠親和層析色譜是按下述步驟實現(xiàn)的：(1)瓊脂糖凝膠溶脹：含有親和配基的瓊脂糖凝膠與蒸餾水按1:10的重量體積比混合，60℃加熱2h后，室溫靜止22h；親和配基為槲皮素配基、沒食子酸配基、β-環(huán)糊精配基的一種；(2)裝柱：溶脹后的瓊脂糖凝膠裝入中空玻璃管柱，用蒸餾水沖洗5～10倍柱床體積，沖洗流速為50～80mL/min；(3)平衡：用2～5倍柱床體積的初始流動相沖洗層析柱，流速為15～30mL/min。初始流動相為乙醇、乙酸和水組成的溶液，乙醇濃度為20％-30％，乙酸濃度為2％～5％；(4)上樣：用水調(diào)節(jié)睪丸酶解提取超濾液的多肽含量為15～45mg/mL，采用5～8mL/min流速連續(xù)上樣，上樣體積為柱床體積的10％～20％；(5)洗脫：依次用初始流動相洗脫2倍柱床體積，純水洗脫2倍柱床體積，2％～9％乙酸線性梯度洗脫6～10倍柱床體積，最后用9％乙酸洗脫2倍柱床體積，洗脫流速10～30mL/min；(6)收集：收集吸光度為280nm、活性大于10％的脫峰，合并為酶解提取精制液。在本發(fā)明中使用過的瓊脂糖凝膠親和吸附層析柱，可經(jīng)初始流動相再次平衡后，可重新使用。本發(fā)明提供了一種動物睪丸提取物的制備方法。該動物睪丸提取物的制備方法包括：步驟1：將動物睪丸勻漿，酶解提取，得到酶解粗提液和濾渣；步驟2：酶解粗提液經(jīng)超濾得到超濾液，超濾液再經(jīng)瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜方法去除高分子雜質(zhì)，得到酶解提取精制液；濾渣采用乙醇提取濃縮，得到濃縮醇提液；步驟3：將酶解提取精制液與濃縮醇提液混合，冷凍干燥，得到動物睪丸提取物。本發(fā)明具有的有益效果為：1、睪丸提取制備工藝中采用工具酶提取、過濾、超濾、瓊脂糖氫鍵吸附色譜分離純化相結(jié)合的方法，使提取物中小分子多肽類活性物質(zhì)得到富集；2、通過濾渣醇提，回收了濾渣中不溶于水的睪酮，不僅減少了睪丸中活性成分的損失，還提高了提取物的活性成分含量；3、該制備工藝得到的提取物產(chǎn)品純度高，雜質(zhì)少，安全性好，質(zhì)量穩(wěn)定；4、睪丸提取物的制備工藝不涉及過多化學試劑，溶劑易于回收安全有效，經(jīng)濟實用性好。具體實施方式本發(fā)明公開了一種動物睪丸提取物的制備方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。各項指標的具體檢測方法：A.多肽含量：采用福林酚測定法檢測多肽含量。所用試劑和具體操作法如下：試劑：堿性銅試液取氫氧化鈉10g，碳酸鈉50g，加水400mL使溶解，作為甲液；取酒石酸鉀0.5g，加水50mL使溶解，另取硫酸酮0.25g，加水30mL使溶解，將兩液混合，作為乙液。臨用前，合并兩液，并加水至500mL。操作法：(1)對照品溶液的制備取牛血清白蛋白對照品，加水制成每1mL含0.3mg的溶液。(2)供試品溶液的制備照各藥品項下的方法制備。(3)標準曲線的制備精密量取對照品溶液0.0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mL，分別置具塞試管中，各加水至1.0mL，再分別加入堿性銅試液1.0mL，搖勻，各加入福林酚試液(1→16)4.0mL，立即混勻，置55℃水浴中準確反應(yīng)5分鐘，置冷水浴中10分鐘，在650nm的波長處測定吸收度；同時以0號管作為空白。以吸收度與相應(yīng)的對照品溶液濃度計算回歸方程。(4)測定法精密量取供試品溶液1.0mL，照標準曲線的制備項下的方法，自“加入堿性銅試液”起，依法測定，由回歸方程計算供試品溶液的濃度，并乘以稀釋倍數(shù)，即為多肽含量。B.睪酮：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定樣品中的睪酮含量(參照食品國家標準GB/T20758《牛肝和牛肉中睪酮、表睪酮、孕酮殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定》)C.總氮：半微量法測定樣品中的總氮(參照中國藥典2010版二部附錄ⅦD)。D.脂肪含量：利用酸水解法測定脂肪含量。精確稱取樣品1.0g左右，放入50ml大試管中，加入8ml的水用玻璃棒充分攪勻，加10ml鹽酸，混勻后于70～80℃水浴，每隔10min左右攪勻一次直至脂肪游離為止，約需40～50min。取出靜止冷卻后，加入10ml乙醇，混合，冷卻后將混合物移入100ml具塞筒中，用25ml乙醚分次沖洗試管，洗液一并倒入具塞筒中，加塞震搖1min，將塞子慢慢轉(zhuǎn)松放氣后再塞好，靜止15min，小心開塞，用石油醚-乙醚等量混合液沖洗塞及筒中附著的脂肪，靜止10～20min，待上清液體清晰，吸出上清于已恒重的錐形瓶中，再加5ml乙醚于具塞筒內(nèi)震搖，靜置后仍將上層乙醚吸出放入錐形瓶。將錐形瓶水浴蒸干，置105℃烘箱干燥2h，稱重。E.活性：采用T細胞活性檢測(脫E受體法)。①脫E受體胸腺T細胞懸液的制備：取新鮮豬胸腺，去脂肪并剪碎，加適量Hank’s液使成細胞懸液，經(jīng)100目篩過濾，每分鐘1500轉(zhuǎn)離心3～5分鐘，棄去上清液，加入少量Hank’s液打勻，將此溶液加入已具有1/3濾液量的分離液的離心管中，以每分鐘2000轉(zhuǎn)離心20分鐘，小心吸出中間層的胸腺細胞，放入另一離心管中，加適量Hank’s液洗滌，搖勻，以每分鐘1500轉(zhuǎn)離心3～5分鐘，棄去上清液，洗滌一次后，在沉淀物中加入適量Hank’s液，混勻，45℃恒溫水浴保溫30分鐘(每隔5分鐘振搖一次)。以每分鐘1500轉(zhuǎn)離心3～5分鐘，棄去上清液，再加入適量Hank’s液，混勻后，置45℃恒溫水浴保溫30分鐘，取出后以每分鐘1500轉(zhuǎn)離心3～5分鐘，棄去上清夜。用Hank’s洗滌三次(操作同前)，最后用Hank’s液適當稀釋并計數(shù)，使最終濃度為每1ml中(3×106)～(5×106)個細胞。②綿羊紅血球懸液的制備：取適量羊血，用Hank’s液洗三次(同前)。棄去上清液，加適量Hank’s液稀釋并計數(shù)，使最終濃度為脫E受體胸腺T細胞懸液濃度的8～10倍。③供試品溶液的制備：取供試品，用Hank’s液配制成每1ml中含1mg的溶液。④測定：取小試管6支，其中3支各加Hank’s液0.1ml作對照管，另3支各加供試品溶液0.1ml作測定管，每管中各加脫E受體胸腺T細胞懸液0.2ml，37℃保溫1小時后，加入綿羊紅血球懸液0.2ml，搖勻，以每分鐘500轉(zhuǎn)離心3分鐘，放入4℃冰箱過夜，次日取出，棄去上清夜，每管中各加入固定液一滴，輕輕搖勻，靜置10分鐘，加入染色液2滴并搖勻，靜置15分鐘后開始計數(shù)，顯微鏡視野中淡藍色的較大的細胞為淋巴細胞，共數(shù)計數(shù)板16個大方格上所有淋巴細胞的個數(shù)(不少于200個)，統(tǒng)計其中的E玫瑰花結(jié)形成的細胞數(shù)(結(jié)合3個以上綿羊紅細胞的淋巴細胞)，求得結(jié)花百分率，取平均值。即為供試品管或?qū)φ展艿钠骄?。樣品活力＝供試品測定管E玫瑰花結(jié)百分率—對照管E玫瑰花結(jié)百分率。本發(fā)明提供的動物睪丸提取物的制備方法中所用材料、試劑或儀器均可由市場購得。下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明：實施例1不同配基瓊脂糖凝膠吸附色譜分離效果比較1、羊睪丸酶解提取精制液的制備(1)取新鮮冷凍的兔睪丸5kg，去除脂肪且沖洗干凈，得凈重3.86Kg。加入等重量純化水，常溫下勻漿2次。(2)將勻漿液調(diào)節(jié)pH至9.0，加入3.8g(0.1％)堿性蛋白酶，50℃進行酶解溫度3小時。反應(yīng)完之后95℃變性5min以終止酶解反應(yīng)，冷卻至室溫。(3)調(diào)節(jié)酶解液pH至7.5，加入7.6g(0.2％)胰蛋白酶，37℃酶解2小時后，升溫至85℃，保持15分鐘，300目無紡布過濾，得酶解粗提液和濾渣1.6kg。(4)上述羊睪丸酶解粗提液用10KD超濾膜超濾澄清，得到微黃色澄清透明溶液5.66升，多肽含量為46.95mg/L。2、層析柱準備1)凝膠溶脹含槲皮素配基、沒食子酸配基和β-環(huán)糊精配基的瓊脂糖凝膠分別與蒸餾水按1:10的重量體積比混合，60℃加熱2h后，室溫靜止22h。2)裝柱溶脹后的瓊脂糖凝膠裝入中空玻璃管柱，用蒸餾水沖洗10倍柱床體積，沖洗流速為50mL/min。3)平衡用5倍柱床體積的初始流動相沖洗層析柱，沖洗流速為25mL/min。始流動相為乙醇-乙酸水溶液，乙醇濃度為25％，乙酸濃度為3％。按上述方法，準備好實驗型槲皮素配基瓊脂糖凝膠親和層析柱、沒食子酸配基瓊脂糖凝膠親和層析柱和β-環(huán)糊精配基瓊脂糖凝膠親和層析柱各1根。層析柱直徑1.5cm，高60cm。3、上樣用水調(diào)節(jié)羊睪丸酶解超濾液的多肽含量為15mg/mL，用蠕動泵連續(xù)上樣，上樣流速為8mL/min。上述三根層析柱上樣體積為20mL，為柱床體積的18.8％。4、洗脫先用初始流動相，15mL/min洗脫2倍柱床體積；再蒸餾水10mL/min洗脫2倍柱床體積；再用8倍柱床體積的乙酸溶液進行線性梯度洗脫。線性梯度洗脫期間，乙酸濃度逐步從2％升高9％，乙酸線性梯度流速逐步從15mL/min升高到30mL/min。最后用9％乙酸溶液，30mL/min洗脫2倍柱床體積。5、收集收集吸光度為280nm、活性大于10％的洗脫峰，合并為羊睪丸酶解提取精制液。6、結(jié)果檢測計算檢測酶解提取精制液的體積，檢測其活性指數(shù)，結(jié)果見下表1。表1不同方法檢測酶解提取精制液的活性結(jié)果方法精制液體積(mL)活性(％)槲皮素配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附層析15.520.2沒食子酸配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附層析16.315.4B-環(huán)糊精配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附層析12.912.8比較后發(fā)現(xiàn)，三種配基瓊脂糖凝膠的分離能力依次為：槲皮素配基＞沒食子酸配基＞β環(huán)糊精配基，因此，優(yōu)選槲皮素配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜進行活性肽分離。實施例2乳豬睪丸酶解提取1、乳豬睪丸酶解提取精制液的制備(1)取新鮮冷凍的乳豬睪丸4.2kg，去除脂肪且沖洗干凈，得凈重3.1Kg，加入等重量蒸餾水，常溫下勻漿2次。(2)將勻漿液調(diào)節(jié)pH至7.5后，加入9g(0.3％)胰蛋白酶，37℃酶解時間3h后，升溫至90℃，保溫10min使酶變性，冷卻至室溫，300目無紡布過濾，得乳豬睪丸酶解粗提液和濾渣1.3kg。(3)上述酶解粗提液用10KD超濾膜超濾澄清，得到微黃色澄清透明溶液4.83升，多肽含量為36.35mg/mL。(4)上述超濾液經(jīng)槲皮素配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附層析色譜分離純化，得到酶解提取精制液3.6L，多肽含量為9.63mg/mL，活性為25.8％。步驟(4)中槲皮素配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜層析純化乳豬睪丸酶解液試驗具體為：層析柱準備(1)凝膠溶脹含槲皮素配基的瓊脂糖凝膠與蒸餾水按1:10的重量體積比混合，60℃加熱2h后，室溫靜止22h。(2)裝柱溶脹后的瓊脂糖凝膠裝入不銹鋼層析柱，用蒸餾水沖洗5倍柱床體積，沖洗流速為75mL/min。(3)平衡用2倍柱床體積的初始流動相沖洗層析柱，沖洗流速為15mL/min。始流動相為乙醇-乙酸水溶液，乙醇濃度為20％，乙酸濃度為2％。參照上述方法，準備好直徑20cm，高145cm的層析柱，柱床體積為45.53L。上樣用水調(diào)節(jié)乳豬睪丸酶解超濾液的多肽含量為15mg/mL，用蠕動泵連續(xù)上樣，上樣流速為8mL/min。洗脫先用初始流動相，15mL/min洗脫2倍柱床體積；再蒸餾水10mL/min洗脫2倍柱床體積；再用8倍柱床體積的乙酸溶液進行線性梯度洗脫。線性梯度洗脫期間，乙酸濃度逐步從2％升高9％，乙酸線性梯度流速逐步從15mL/min升高到30mL/min。最后用9％乙酸溶液，30mL/min洗脫2倍柱床體積。收集收集吸光度為280nm、活性大于10％的洗脫峰，合并為酶解提取精制液，體積為3.6L。經(jīng)檢測，乳豬睪丸酶解提取精制液的活性為25.8％，多肽含量為9.63mg/mL。2、乳豬睪丸醇提濃縮液的制備(1)乳豬睪丸酶解濾渣1.3kg與6.5L95％乙醇混合,75轉(zhuǎn)/分攪拌提取2h后，3000轉(zhuǎn)/分離心15min，得上清液5.9L；(2)第1次離心沉淀與4L95％酒精酒精混合，100轉(zhuǎn)/分攪拌提取2h后，3000轉(zhuǎn)/分離心15min，得上清液3.6L；(3)合并2次離心得到的上清液，于0.1MPa，60℃減壓濃縮至體積約為1L的混懸液，睪酮含量為86.15mg/L。3、乳豬睪丸提取物的制備3.6L酶解提取精制液與1L混合，冷凍干燥，得乳豬睪丸提取物138.65g。實施例3大豬睪丸的酶解提取1、大豬睪丸酶解提取精制液的制備(1)取新鮮冷凍的大豬睪丸10kg，去除脂肪且沖洗干凈，得凈重7.86Kg。加入等重量蒸餾水，常溫下勻漿2次。(2)將勻漿液調(diào)節(jié)pH至8.5后，加入31.4g(0.4％)堿性蛋白酶進行反應(yīng)，酶解溫度為50℃，酶解時間為5h。反應(yīng)完之后85℃變性15min以終止酶解反應(yīng)。變性后冷卻至室溫，300目無紡布過濾，得酶解粗提液和3.2kg濾渣。(3)上述大豬睪丸酶解粗提液用10KD超濾膜超濾澄清，得到微黃色澄清透明溶液11.26升，多肽含量為48.09mg/L。(4)上述超濾液經(jīng)槲皮素配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜層析分離純化，得到大豬酶解提取精制液7.3L，多肽含量為11.63mg/mL，活性為21.6％。步驟(4)中槲皮素配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜層析純化大豬睪丸酶解液試驗具體為：層析柱準備采用制備過乳豬睪丸酶解精制液的槲皮素配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附層析柱，用5倍柱床體積的初始流動相沖洗層析柱，沖洗流速為30mL/min。始流動相為乙醇-乙酸水溶液，乙醇濃度為30％，乙酸濃度為5％。上樣用水調(diào)節(jié)大豬睪丸酶解超濾液的多肽含量為45mg/mL，用蠕動泵連續(xù)上樣，上樣流速為5mL/min。洗脫先用初始流動相，15mL/min洗脫2倍柱床體積；再蒸餾水10mL/min洗脫2倍柱床體積；再用6倍柱床體積的乙酸溶液進行線性梯度洗脫。線性梯度洗脫期間，乙酸濃度逐步從2％升高9％，乙酸線性梯度流速逐步從15mL/min升高到30mL/min。最后用9％乙酸溶液，30mL/min洗脫2倍柱床體積。收集收集吸光度為280nm、活性大于10％的洗脫峰，合并為酶解提取精制液，體積為7.3L。2、大豬睪丸醇提濃縮液的制備(1)上述3.2kg濾渣與16L95％乙醇混合，75轉(zhuǎn)/分攪拌提取3小時，3000轉(zhuǎn)/分離心15min，得上清液14.8L；(2)第1次離心沉淀與10L95％乙醇混合，50轉(zhuǎn)/分攪拌提取3小時，3000轉(zhuǎn)/分離心20min，得上清液9.1L；(3)兩次離心所得上清液合并，0.05MPa，60℃減壓濃縮至體積約為2.5L混懸液，檢測睪酮含量為199.37mg/L。3、大豬睪丸提取物的制備上述7.3L大豬酶解提取精制液與2.5L醇提濃縮液混合，冷凍干燥，得大豬睪丸提取物265.29g。實施例4牛睪丸的酶解提取1、牛睪丸酶解提取精制液的制備(1)取10kg新鮮冷凍的牛睪丸，去除脂肪且沖洗干凈，得凈重8.16Kg。加入等重量蒸餾水，常溫下勻漿2次。(2)將勻漿液調(diào)節(jié)pH至9.0后，加入24.5g(0.3％)堿性蛋白酶50℃酶解3小時后，80℃滅酶20分鐘，冷卻至室溫。(3)冷卻后的酶解液調(diào)pH至7.5，加入胰蛋白酶16.3g(0.2％)繼續(xù)酶解5小時，之后90℃變性10min以終止酶解反應(yīng)，變性后冷卻至室溫，300目無紡布過濾，得酶解粗提液和濾渣3.6kg。(4)上述牛睪丸酶解粗提液用10KD超濾膜超濾澄清，得到微黃色澄清透明溶液12.10升，多肽含量為54.78mg/L。(5)上述超濾液經(jīng)槲皮素配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜層析分離純化，得到酶解提取精制液8.2L，多肽含量為12.56mg/mL，活性為18.2％。步驟(5)中槲皮素配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜層析純化牛睪丸酶解液試驗具體為：層析柱準備采用制備過大豬睪丸酶解精制液的槲皮素配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附層析柱，用4倍柱床體積的初始流動相沖洗層析柱，沖洗流速為25mL/min。始流動相為乙醇-乙酸水溶液，乙醇濃度為25％，乙酸濃度為3.5％。上樣用水調(diào)節(jié)牛睪丸酶解超濾液的多肽含量為40mg/mL，用蠕動泵連續(xù)上樣，上樣流速為6mL/min。洗脫先用初始流動相，15mL/min洗脫2倍柱床體積；再蒸餾水10mL/min洗脫2倍柱床體積；再用6倍柱床體積的乙酸溶液進行線性梯度洗脫。線性梯度洗脫期間，乙酸濃度逐步從2％升高9％，乙酸線性梯度流速逐步從15mL/min升高到30mL/min。最后用9％乙酸溶液，30mL/min洗脫2倍柱床體積。收集收集吸光度為280nm、活性大于10％的洗脫峰，合并為酶解提取精制液。由于牛酶解超濾液體積較大，上述上樣、洗脫分2次完成，第一次上樣體積為10L，洗脫完成后，收集5.1L酶解提取精制液。再用4倍柱床體積的流動相(乙醇-乙酸水溶液，乙醇濃度為25％，乙酸濃度為5％)，30mL/min重新平衡層析柱后，再次上樣6.6L，洗脫后，收集到3.1升酶解提取精制液，兩次精制液合并使用。經(jīng)檢測，牛睪丸酶解提取精制液的活性為18.2％，多肽含量為12.56mg/mL。2、牛睪丸醇提濃縮液的制備(1)牛睪丸酶解濾渣3.6kg與18L95％酒精混合,100轉(zhuǎn)/分攪拌提取3h后，3000轉(zhuǎn)/分離心20min，得上清液16.7L；(2)第1次離心沉淀與12L95％酒精混合，75轉(zhuǎn)/分攪拌提取2h后，3000轉(zhuǎn)/分離心15min，得上清液11.2L；(3)第2次離心沉淀與12L95％酒精混合，50轉(zhuǎn)/分攪拌提取1h后，3000轉(zhuǎn)/分離心10min，得上清液10.5L；(4)合并3次離心得到的上清液，于0.05MPa，65℃減壓濃縮至體積約為3.9L混懸液，睪酮含量為251.60mg/L。3、牛睪丸提取物的制備8.2L酶解提取精制液與3.9L醇提濃縮液混合，冷凍干燥，得牛睪丸提取物484.55g。實施例5兔睪丸的酶解提取1、兔睪丸酶解提取精制液的制備(1)取新鮮冷凍的兔睪丸3kg，去除脂肪且沖洗干凈，得凈重1.95Kg。加入等重量蒸餾水，常溫下勻漿2次。(2)勻漿液調(diào)節(jié)pH至7.5，加入1.95g(0.1％)胰蛋白酶，40℃酶解2小時，升溫80℃后保持20min以終止酶解反應(yīng)，冷卻至室溫，300目無紡布過濾，得酶解粗提液和濾渣0.8kg。(3)上述兔睪丸酶解粗提液用10KD超濾膜超濾澄清，得到微黃色澄清透明溶液2.6升，多肽含量為29.75mg/L。(4)上述超濾液用槲皮素配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜層析分離純化，得到酶解提取精制液1.9L，多肽含量為7.13mg/mL，活性為22.5％。步驟(4)中槲皮素配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜層析純化兔睪丸酶解液試驗具體為：層析柱準備采用制備過牛睪丸酶解精制液的槲皮素配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附層析柱，用3倍柱床體積的初始流動相沖洗層析柱，沖洗流速為20mL/min。始流動相為乙醇-乙酸水溶液，乙醇濃度為25％，乙酸濃度為2.5％。上樣用水調(diào)節(jié)兔睪丸酶解超濾液的多肽含量為25mg/mL，用蠕動泵連續(xù)上樣，上樣流速為7.5mL/min。洗脫先用初始流動相，15mL/min洗脫2倍柱床體積；再蒸餾水10mL/min洗脫2倍柱床體積；再用8倍柱床體積的乙酸溶液進行線性梯度洗脫。線性梯度洗脫期間，乙酸濃度逐步從2％升高9％，乙酸線性梯度流速逐步從15mL/min升高到30mL/min。最后用9％乙酸溶液，30mL/min洗脫2倍柱床體積。收集收集吸光度為280nm、活性大于10％的洗脫峰，合并為酶解提取精制液。2、兔睪丸醇提濃縮液的制備(1)兔睪丸酶解濾渣0.8kg與6.4L95％乙醇混合,50轉(zhuǎn)/分攪拌提取1h后，3000轉(zhuǎn)/分離心10min，得上清液5.1L；(2)第1次離心沉淀與4L95％酒精混合，75轉(zhuǎn)/分攪拌提取1h后，3000轉(zhuǎn)/分離心20min，得上清液3.3L；(3)合并2次離心得到的上清液，于0.1MPa，65℃減壓濃縮至體積約為1L的混懸液，睪酮含量為148.38mg/L。3、兔睪丸提取物的制備1.9L酶解提取精制液與1L醇提濃縮液混合，冷凍干燥，得兔睪丸提取物102.57g。實施例6羊睪丸的酶解提取1、羊睪丸酶解提取精制液的制備(1)取新鮮冷凍的兔睪丸5kg，去除脂肪且沖洗干凈，得凈重3.86Kg。加入等重量純化水，常溫下勻漿2次。(2)將勻漿液調(diào)節(jié)pH至9.0，加入3.8g(0.1％)堿性蛋白酶，50℃進行酶解溫度3小時。反應(yīng)完之后95℃變性5min以終止酶解反應(yīng)，冷卻至室溫。(3)調(diào)節(jié)酶解液pH至7.5，加入7.6g(0.2％)胰蛋白酶，37℃酶解2小時后，升溫至85℃，保持15分鐘，300目無紡布過濾，得酶解粗提液和濾渣1.6kg。(4)上述羊睪丸酶解粗提液用10KD超濾膜超濾澄清，得到微黃色澄清透明溶液5.66升，多肽含量為46.95mg/L。(5)上述超濾液用槲皮素配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜層析分離純化，得到酶解提取精制液4.5L，多肽含量為10.63mg/mL，活性為22.3％。步驟(5)中槲皮素配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜層析純化兔睪丸酶解液試驗具體為：采用制備過兔睪丸酶解精制液的槲皮素配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附層析柱，用3.5倍柱床體積的初始流動相沖洗層析柱，沖洗流速為20mL/min。始流動相為乙醇-乙酸水溶液，乙醇濃度為25％，乙酸濃度為3％。上樣用水調(diào)節(jié)羊睪丸酶解超濾液的多肽含量為30mg/mL，用蠕動泵連續(xù)上樣，上樣流速為6.5mL/min。洗脫先用初始流動相，15mL/min洗脫2倍柱床體積；再蒸餾水10mL/min洗脫2倍柱床體積；再用10倍柱床體積的乙酸溶液進行線性梯度洗脫。線性梯度洗脫期間，乙酸濃度逐步從2％升高9％，乙酸線性梯度流速逐步從15mL/min升高到30mL/min。最后用9％乙酸溶液，30mL/min洗脫2倍柱床體積。收集收集吸光度為280nm、活性大于10％的洗脫峰，合并為酶解提取精制液，體積為4.5L。2、羊睪丸醇提濃縮液的制備(1)羊睪丸酶解濾渣1.6kg與8L95％酒精混合,100轉(zhuǎn)/分攪拌提取3h后，3000轉(zhuǎn)/分離心20min，得上清液6.9L；(2)第1次離心沉淀與5L95％酒精混合，75轉(zhuǎn)/分攪拌提取2h后，3000轉(zhuǎn)/分離心15min，得上清液4.2L；(3)第2次離心沉淀與5L95％酒精混合，50轉(zhuǎn)/分攪拌提取12h后，3000轉(zhuǎn)/分離心10min，得上清液4.1L；(4)合并3次離心得到的上清液，于0.1MPa，60℃減壓濃縮至體積約為1.9L混懸液。檢測睪酮含量為203.91mg/L。3、羊睪丸提取物的制備上述4.5L酶解提取精制液與1.8L醇提濃縮液混合，冷凍干燥，得羊睪丸提取物201.73g。對比例1羊睪丸提取液制備方法取新鮮羊睪丸，經(jīng)組織搗碎機搗碎，加入三蒸水后反復凍融，用低溫超速離心機離心，上清液經(jīng)中空纖維超濾裝置過柱，在無菌條件下過濾，封裝成無色透明羊睪丸提取液。對比例2牛睪丸顆粒物制備方法選取新鮮健康的牛睪丸，純化水洗3遍以上，至干凈為止；將初洗凈的牛睪丸放置于pH為7.0的緩沖生理鹽水中浸泡，快速去除血水和其他附著物；將去除血水的牛睪丸切碎成8cm的小塊，向牛睪丸小塊中加入為牛睪丸重量2倍的蒸餾水，并加入牛睪丸重量2％的木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)pH為3在15℃酶解4h；去掉上清液，再將酶解后的牛睪丸小顆粒塊過100目篩過濾，留取篩上固體物質(zhì)，備用。試驗例對比試驗將實施例2-6和對比例1-2所獲產(chǎn)品進行檢測，檢測結(jié)果見表2：表2各項指標檢測結(jié)果對比上表試驗數(shù)據(jù)可知，對比例1和對比例2的脂肪含量明顯高于實施例2～6，睪酮含量(對比例1未檢出睪酮含量)、多肽含量、產(chǎn)品活性明顯低于實施例2～6。由此可知本專利制備方法能使睪丸分解的更加徹底，產(chǎn)生更多高價值的小分子，同時處理后的產(chǎn)品中雜質(zhì)減少，產(chǎn)品純度提高，產(chǎn)品活性也明顯提高。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁1 2 3