專利名稱：一種從豬睪丸中提取玻璃酸酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及從新鮮動物睪丸中提取玻璃酸酶的方法。
背景技術(shù)：
玻璃酸酶又名透明質(zhì)酸酶，在哺乳動物的睪丸里含量很豐富，能水解透明質(zhì)酸，使其粘滯性明顯下降，有利于受精時精子進入卵子。也存在于精子、頜下腺、蜂毒、蛇毒、皮膚、 脾臟、水蛭及細胞的溶酶體中。
玻璃酸酶的穩(wěn)定性較好，42°C加熱60分鐘活力不損失；100°C加熱5分鐘，活力可保留80%。受熱失活后進行冷卻可恢復(fù)部分活力。在pH5以下或pH8以上酶仍較穩(wěn)定。在低濃度水溶液中較易失活，但可加入0. 2%或0. 5%阿拉伯膠或0. 2%明膠保護。Fe2+、Cu2+ 對酶有可逆抑制作用，Pb2+、Hg2+、N12+等對酶活性沒有明顯影響。硫酸軟骨素B(皮膚素)、 硫酸類肝素、硫酸角質(zhì)素、肝素及高濃度玻璃酸酶對酶均有抑制作用，但可被0. 15m0l/L氯化鈉或硫酸魚精蛋白所逆轉(zhuǎn)。
藥用玻璃酸酶為白色或微黃色粉末，無氣味，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚、乙醇等有機溶劑。生化制藥主要用牛、羊睪丸為原料進行提取制備。
國外50年代初已投入生產(chǎn)，并收載于英國和日本藥典中，商品名R0ndas。我國 1965年正式投入生產(chǎn)，從羊睪丸中提取，收入1977版中國藥典。王彥，周淑敏等曾在2002 年15卷(1)期的《黑龍江醫(yī)藥》上發(fā)表了一篇名為《透明質(zhì)酸酶提取工藝的研究》的論文， 較詳細的介紹了工業(yè)生產(chǎn)中從羊睪丸中提取玻璃酸酶的傳統(tǒng)工藝以及在此基礎(chǔ)上由他們改良的新工藝；李丹，郭育濤等曾在2011年8月第40卷第8期的《應(yīng)用化工》上發(fā)表了一篇名為《牛睪丸中透明質(zhì)酸酶提取工藝研究》的論文，介紹了用鹽酸和乙酸的混合液溶解、 硫酸銨鹽析方法，從牛睪丸中玻璃酸酶的實驗研究。但是關(guān)于從豬睪丸中提取玻璃酸酶的工藝，暫時還沒有相關(guān)記載。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種從豬睪丸中提取玻璃酸酶的方法，采用酸液提取和硫酸銨鹽析得玻璃酸酶粗品，粗品再經(jīng)超濾、熱原處理、凍干得玻璃酸酶精品。具體步驟如下
1.提取
將豬睪丸除內(nèi)外皮層及付睪丸，絞成糜漿。稱取糜漿，按每1kg糜漿加酸液1.0-1. 5L的比例，加酸液攪拌，浸出4小時后，將浸出液過濾，濾液調(diào)PH3. 2 4. 0。
取濾渣，按每1kg開始加入的糜漿加酸液1. 2-0. 3L的比例，加酸液攪拌1小時后， 再次過濾，濾液調(diào)PH3. 2 4. 1。
所述酸液為冰醋酸，鹽酸，氯化鈉和水的混合酸液。
2.粗制:
合并兩次過濾液，在不斷攪拌下，以每1L加硫酸銨230一種從豬睪丸中提取玻璃酸酶的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及從新鮮動物睪丸中提取玻璃酸酶的方法。
背景技術(shù)：
玻璃酸酶又名透明質(zhì)酸酶，在哺乳動物的睪丸里含量很豐富，能水解透明質(zhì)酸，使其粘滯性明顯下降，有利于受精時精子進入卵子。也存在于精子、頜下腺、蜂毒、蛇毒、皮膚、 脾臟、水蛭及細胞的溶酶體中。
玻璃酸酶的穩(wěn)定性較好，42°C加熱60分鐘活力不損失；100°C加熱5分鐘，活力可保留80%。受熱失活后進行冷卻可恢復(fù)部分活力。在pH5以下或pH8以上酶仍較穩(wěn)定。在低濃度水溶液中較易失活，但可加入0. 2%或0. 5%阿拉伯膠或0. 2%明膠保護。Fe2+、Cu2+ 對酶有可逆抑制作用，Pb2+、Hg2+、N12+等對酶活性沒有明顯影響。硫酸軟骨素B(皮膚素)、 硫酸類肝素、硫酸角質(zhì)素、肝素及高濃度玻璃酸酶對酶均有抑制作用，但可被0. 15m0l/L氯化鈉或硫酸魚精蛋白所逆轉(zhuǎn)。
藥用玻璃酸酶為白色或微黃色粉末，無氣味，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚、乙醇等有機溶劑。生化制藥主要用牛、羊睪丸為原料進行提取制備。
國外50年代初已投入生產(chǎn)，并收載于英國和日本藥典中，商品名R0ndas。我國 1965年正式投入生產(chǎn)，從羊睪丸中提取，收入1977版中國藥典。王彥，周淑敏等曾在2002 年15卷(1)期的《黑龍江醫(yī)藥》上發(fā)表了一篇名為《透明質(zhì)酸酶提取工藝的研究》的論文， 較詳細的介紹了工業(yè)生產(chǎn)中從羊睪丸中提取玻璃酸酶的傳統(tǒng)工藝以及在此基礎(chǔ)上由他們改良的新工藝；李丹，郭育濤等曾在2011年8月第40卷第8期的《應(yīng)用化工》上發(fā)表了一篇名為《牛睪丸中透明質(zhì)酸酶提取工藝研究》的論文，介紹了用鹽酸和乙酸的混合液溶解、 硫酸銨鹽析方法，從牛睪丸中玻璃酸酶的實驗研究。但是關(guān)于從豬睪丸中提取玻璃酸酶的工藝，暫時還沒有相關(guān)記載。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種從豬睪丸中提取玻璃酸酶的方法，采用酸液提取和硫酸銨鹽析得玻璃酸酶粗品，粗品再經(jīng)超濾、熱原處理、凍干得玻璃酸酶精品。具體步驟如下
1.提取
將豬睪丸除內(nèi)外皮層及付睪丸，絞成糜漿。稱取糜漿，按每1kg糜漿加酸液1.0-1. 5L的比例，加酸液攪拌，浸出4小時后，將浸出液過濾，濾液調(diào)PH3. 2 4. 0。
取濾渣，按每1kg開始加入的糜漿加酸液0. 2-0. 3L的比例，加酸液攪拌1小時后， 再次過濾，濾液調(diào)PH3. 2 4. 0。
所述酸液為冰醋酸，鹽酸，氯化鈉和水的混合酸液。
2.粗制:
合并兩次過濾液，在不斷攪拌下，以每1L加硫酸銨230-260克的比例，加入固體硫-260克的比例，加入固體硫酸銨，攪拌溶解，靜置10小吋，過濾，留固體。量取濾液，在不斷攪拌下，按IL濾液加硫酸銨280-310克的比例，加入固體硫酸銨，攪拌溶解，靜置10小時，過濾，合并兩次固體，得粗品。3.精制3.1 超濾粗品溶于少量水中，進超濾裝置進行超濾。3. 2熱原處理將超濾液離心20-30分鐘，轉(zhuǎn)速2700-3200r/min，過濾，將濾液放冰浴中冷卻，カロ入濾液0.1體積的15%磷酸三鈉(Na3PO4 12H20)溶液，在不斷攪拌下，緩緩加入濾液0. 06體積的20%醋酸鈣(Ca(CH3COO)2 -H2O)溶液，并以NaOH溶液調(diào)pH8_9，離心，時間20分鐘 30分鐘，轉(zhuǎn)速2700-3200r/min。收集上清液，之后上清液調(diào)pH6. 5 7. O。3. 3 凍干將濾液冷凍干燥，即得無熱原的玻璃酸酶精品。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是本發(fā)明技術(shù)是從豬睪丸中提取玻璃酸酶，國內(nèi)暫時沒有相關(guān)記載。本發(fā)明技術(shù)在采用酸液溶解、硫酸銨鹽析方法的基礎(chǔ)上，增加超濾技術(shù)、去熱原操作，得到的玻璃酸酶效價更高，340iu/mg,且玻璃酸酶不含熱原，藥品質(zhì)量符合國家質(zhì)量標準。生產(chǎn)エ藝簡易、成本低，原材料來源廣泛，適合大規(guī)模エ業(yè)化生產(chǎn)。該項成果有良好的經(jīng)濟效益和社會效益，它不但解決國內(nèi)外醫(yī)療用藥的需求，還為養(yǎng)殖產(chǎn)品的綜合利用開拓了新路，對養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展有積極意義。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進ー步說明。實施例11.提取稱取糜漿5kg加酸液6. 3L，攪拌浸出4小時后，將浸出液過濾，濾液調(diào)pH3. 46。取濾渣加酸液1. 1L，攪拌I小時后，再次過濾，濾液調(diào)pH3. 37。2.粗制合并兩次過濾液7. 5L，在不斷攪拌下，加入固體硫酸銨1803g，完全溶解后靜置10小時，過濾，留固體。量取濾液6. 2L，在不斷攪拌下，加入硫酸銨1807g，完全溶解后靜置10小時，過濾，合并兩次固體，得粗品637. 04g。3.精制3.1 超濾粗品溶于少量水中，進超濾裝置進行超濾。3. 2熱原處理將超濾液離心30分鐘，轉(zhuǎn)速3000r/mi n，過濾，將濾液放冰浴中冷卻，加入15%磷酸三鈉(Na3PO4* 12H20)溶液10ml，在不斷攪拌下，緩緩加入20%醋酸鈣(Ca(CH3COO)2^H2O)溶液6ml，并以NaOH溶液調(diào)pH8. 5，離心，收集上清液，之后上清液調(diào)pH6. 86。3. 3 凍干將濾液冷凍干燥，即得無熱原的玻璃酸酶精品217. 18g。
實施例2
1.提取
稱取糜漿400g加酸液O. 5L，攪拌浸出4小時后，將浸出液過濾，濾液調(diào)pH3. 83。
取濾渣加酸液O. 1L,攪拌I小時后，再次過濾，濾液調(diào)pH3. 75。
2.粗制
合并兩次過濾液600mL，在不斷攪拌下，加入固體硫酸銨148g，完全溶解后靜置10 小時，過濾，留固體。量取濾液510mL，在不斷攪拌下，加入硫酸銨148g，完全溶解后靜置10 小時,過濾,合并兩次固體,得粗品51. 88g。
3.精制
3.1 超濾
粗品溶于少量水中，進超濾裝置進行超濾。
3. 2熱原處理
將超濾液離心30分鐘，轉(zhuǎn)速2900r/min，過濾，將濾液放冰浴中冷卻，加入15%磷酸三鈉(Na3PO4 · 12H20)溶液O. 8ml，在不斷攪拌下，緩緩加入20%醋酸鈣 (Ca(CH3COO)2 · H2O)溶液O. 5ml，并以NaOH溶液調(diào)pH8. 5，離心，收集上清液，之后上清液調(diào) pH6. 82。
3. 3 凍干
將濾液冷凍干燥，即得無熱原的玻璃酸酶精品17. 48g。
經(jīng)測算，實施例1中玻璃酸酶精品效價為341. 67iu/mg,收率4. 34% ;實施例2中玻璃酸酶精品效價為342. 63iu/mg，收率4. 37%。
以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作 的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種從豬睪丸中提取玻璃酸酶的方法，其特征在于，采用酸液提取和硫酸銨鹽析得玻璃酸酶粗品，粗品再經(jīng)超濾、熱原處理、凍干得玻璃酸酶精品，所述玻璃酸酶精品的效價可以達到340iu/mg。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟 (一)提取 將豬睪丸除內(nèi)外皮層及付睪丸，絞成糜漿，稱取糜漿加酸液，攪拌、浸潰，過濾，濾液調(diào)PH ;取濾渣再加酸液，攪拌、過濾，濾液調(diào)pH ;所述酸液為冰醋酸，鹽酸，氯化鈉和水的混合酸液； (ニ)粗制 合并兩次過濾液，在不斷攪拌下，加入固體硫酸銨，攪拌溶解，靜置10小時，過濾，留固體；量取濾液，在不斷攪拌下，加入固體硫酸銨，溶解，靜置10小時，過濾，合并兩次固體，得粗品； (ニ)精制 (1)超濾 粗品溶于少量水中，進超濾裝置進行超濾； (2)熱原處理 將超濾液離心，過濾，將濾液放冰浴中冷卻，加入濾液0.1體積的15 %磷酸三鈉(Na3PO4 12H20)溶液，在不斷攪拌下，緩緩加入濾液0. 06體積的20 %醋酸鈣(Ca(CH3COO)2 H2O)溶液，并以NaOH溶液調(diào)pH8_9，離心，收集上清液，之后上清液調(diào)pH6. 5 7. 0 ; (3)凍干 將濾液冷凍干燥，即得無熱原的玻璃酸酶精品。
3.權(quán)利要求書2所述的方法，其特征在于，在步驟(一)中，第一次每Ikg糜漿加酸液1.0-1. 5L，第二次酸液仍根據(jù)開始糜漿量加入，每Ikg糜漿加酸液0. 2-0. 3し
4.權(quán)利要求書2所述的方法，其特征在于，在步驟(一)中，酸液提取后調(diào)節(jié)濾液的pH值均為3. 2 4.0。
5.權(quán)利要求書2所述的方法，其特征在于，在步驟(ニ)中，第一次每IL濾液加固體硫酸銨230-260克，第二次每IL濾液加固體硫酸銨280-310克。
6.權(quán)利要求書2所述的方法，其特征在于，步驟(三)的(2)中的透析液在過濾前以及調(diào)PH值至8-9后都要進行離心，離心時間20分鐘 30分鐘，轉(zhuǎn)速2700 3200r/min。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從豬睪丸中提取玻璃酸酶的方法，采用酸液提取和硫酸銨鹽析得玻璃酸酶粗品，粗品再經(jīng)超濾、熱原處理、凍干得玻璃酸酶精品。本發(fā)明選用豬睪丸為原材料，采用高速離心和過濾提取方法，對玻璃酸酶進行分離和純化，使玻璃酸酶效價可以達到340iu/mg。
文檔編號C12N9/26GK103060288SQ20121059800
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月30日
發(fā)明者宋超龍, 劉振海, 劉翠珍, 王議鋒 申請人:青島九龍生物醫(yī)藥有限公司