本發(fā)明涉及的是一種新型多功能靶向納米膠囊抗癌藥物的設(shè)計(jì)與合成技術(shù)，特別是一種包載紫杉醇的納米膠囊表面偶聯(lián)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體TRAIL蛋白的抗癌藥物的設(shè)計(jì)與制備。

背景技術(shù)：

在全球范圍內(nèi)，惡性腫瘤的治療是當(dāng)今生命科學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)難點(diǎn)?；熓钱?dāng)前腫瘤治療的主要手段之一，化療常用的藥物有紫杉醇（PTX）、阿霉素、柔紅霉素、絲裂霉素等，但由于化療藥物的選擇性不強(qiáng)，在殺滅癌細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)不可避免地?fù)p傷人體正常的細(xì)胞，常常出現(xiàn)藥物不良反應(yīng)，存在毒性、非特異性和耐藥性問(wèn)題。

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand ,TRAIL)是一種人源性蛋白，作為一種新的抗腫瘤藥物，可以在體內(nèi)選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞系凋亡而不會(huì)對(duì)正常細(xì)胞有毒性，在腫瘤的治療中有廣泛的潛在應(yīng)用前景。但是，單獨(dú)使用TRAIL蛋白也存在不足之處，有些癌腫瘤對(duì)TRAIL蛋白不敏感。

目前國(guó)內(nèi)外的研究多集中在TRAIL蛋白與化療藥物的聯(lián)合用藥上，試圖發(fā)揮TRAIL蛋白和化療藥物的雙重功效以解決TRAIL蛋白敏感性問(wèn)題并增強(qiáng)殺癌療效。聯(lián)合使用紫杉醇等化療藥物雖可提高非敏感性腫瘤細(xì)胞表面TRAIL蛋白受體，但仍缺乏靶向性和存在毒性問(wèn)題。近年來(lái)TRAIL在動(dòng)物體內(nèi)的靶向性已經(jīng)得到證實(shí)，綜合利用TRAIL的抗腫瘤作用和靶向作用是新的研究方向。

隨著科技的發(fā)展，性能優(yōu)良的高分子材料在醫(yī)藥行業(yè)發(fā)展迅速。載藥納米微粒是納米技術(shù)與現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)結(jié)合的產(chǎn)物，是一種新型的藥物輸送載體。它能緩釋藥物、延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間，透過(guò)生物屏障輸送藥物等，尤其在藥物控釋方面顯示出其它輸送體系無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)。因此，我們?cè)噲D將化療藥物包載進(jìn)羧基化的嵌段共聚物F127-COOH和P123納米微粒內(nèi)，并在膠束中添加四甲氧基硅烷形成一層二氧化硅殼以穩(wěn)定膠束結(jié)構(gòu)，形成載藥納米膠囊；然后通過(guò)載藥納米膠囊表面的羧基（-COOH）與 TRAIL蛋白的氨基（-NH₂）偶聯(lián)，形成一種在細(xì)胞和腫瘤水平均具有良好殺癌效果的新型多功能靶向納米膠囊抗癌藥物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提出一種新型多功能靶向納米膠囊抗癌藥物的分子設(shè)計(jì)與制備方法。首先通過(guò)嵌段共聚物F127羧基化修飾獲得F127-COOH，然后將化療藥物包載進(jìn)羧基化的嵌段共聚物F127-COOH和P123納米微粒內(nèi)，并添加四甲氧基硅烷形成一層二氧化硅殼以穩(wěn)定膠束結(jié)構(gòu)，形成載藥納米膠囊，最后通過(guò)載藥膠囊表面的羧基（-COOH）與 TRAIL蛋白的氨基（-NH₂）偶聯(lián)，制備出一種同時(shí)兼具靶向、抗癌、緩釋等特點(diǎn)的新型多功能靶向納米膠囊抗癌藥物，其分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。這種新型人工合成的納米紫杉醇荷載膠囊-TRAIL蛋白藥物（TRAIL-PTX-NCs））既具有靶向性、緩釋化學(xué)藥物又具有TRAIL蛋白和化學(xué)藥物雙重殺癌作用。同時(shí)，它有效地發(fā)揮了TRAIL蛋白和化學(xué)藥物的殺癌特性，克服彼此存在的缺點(diǎn)。納米紫杉醇荷載膠囊-TRAIL蛋白藥物既可用于治療TRAIL蛋白敏感的瘤細(xì)胞又可用于治療TRAIL蛋白不敏感的癌細(xì)胞。

一種新型多功能靶向納米膠囊抗癌藥物的設(shè)計(jì)與合成技術(shù)，其步驟為：

1、嵌段共聚物F127的羧基化修飾

將F127加入到無(wú)水甲苯中，攪拌至F127完全溶解，形成溶液A；向溶液A中加入與F127等重的丁二酸酐，攪拌后形成溶液B；將溶液B在150℃下沸浴加熱5h，減壓下蒸餾將甲苯蒸發(fā)，蒸餾后殘液用二氯甲烷洗滌，然后加入乙醚沉淀產(chǎn)物，產(chǎn)物用乙醚重結(jié)晶，最后得到F127-COOH；所述F127與無(wú)水甲苯的質(zhì)量體積比為1:1，質(zhì)量體積比單位為mg:ml。

2、載藥納米膠囊的制備

稱(chēng)取P123和F127-COOH超聲溶解于氯仿溶液，并加入紫杉醇或其它疏水性藥物，100 W超聲分散15 min，得到的混合溶液在75℃下真空干燥1 h以上，待氯仿完全蒸發(fā)完后得到一層納米薄膜，向薄膜內(nèi)加入去離子水，200 W超聲分散12 min即得到包載紫杉醇的載藥納米膠束；取四甲氧基硅烷超聲分散于四氫呋喃溶液中，逐滴加入到載藥納米膠束中，并置于磁力攪拌儀上以750 rpm轉(zhuǎn)速攪拌3天，四甲氧基硅烷在膠束中水解形成一層二氧化硅殼，形成載藥納米膠囊；

所述P123與F127-COOH的質(zhì)量比為2:1-0.5, 紫杉醇與P123、F127-COOH混合物的質(zhì)量比為1: 70-300；

所述的四甲氧基硅烷與四氫呋喃的用量為：四甲氧基硅烷與四氫呋喃的體積比為7:100，四甲氧基硅烷與載藥納米膠束的體積比為1:100-1000。

3、載藥納米膠囊與TRAIL蛋白的偶聯(lián)

在pH7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）以及載藥納米膠囊，室溫避光旋轉(zhuǎn)反應(yīng)1 h活化膠囊表面的羧基；將反應(yīng)后的溶液裝入截留分子量為8000 g/mol的透析袋，置于PBS溶液中透析24 h以除去未反應(yīng)的EDC和NHS，再向透析后的溶液中加入TRAIL蛋白，4℃避光旋轉(zhuǎn)反應(yīng)8-16 h，即得到偶聯(lián)TRAIL蛋白的載藥納米膠囊，所述磷酸鹽緩沖液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺、載藥納米膠囊的用量比為3:5:6:1,單位為ml:mg:mg:ml；

所述TRAIL蛋白用量與載藥納米膠囊用量比為1:10-40；單位為mg:ml。

4、載藥納米膠囊的形態(tài)檢測(cè)和穩(wěn)定性測(cè)定

取20 μl載藥納米膠囊滴加在碳支持膜型銅網(wǎng)上，室溫條件下晾干。然后使用Tecanai G² 20 S-TWIN透射電子顯微鏡觀察和拍照。使用Malvern Zetasizer Nano-S粒度分析儀測(cè)定載藥納米膠囊的粒徑，并將膠囊稀釋100倍、200倍、500倍、1000倍后測(cè)定膠囊粒徑變化。

5、納米紫杉醇荷載膠囊載藥量和緩釋的測(cè)定

取1 mL制備的載藥納米膠囊，加入2 mL乙腈超聲溶脹后使用島津分光光度計(jì)測(cè)定229nm處吸光值，并結(jié)合紫杉醇濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算紫杉醇含量以及膠囊載藥量、包封率以及載藥濃度。載藥量=載藥膠囊中實(shí)際負(fù)載的PTX含量/膠囊質(zhì)量，包封率=載藥膠囊中實(shí)際負(fù)載的PTX含量/反應(yīng)加入的紫杉醇含量，載藥濃度=載藥膠囊中實(shí)際負(fù)載的PTX含量/膠囊溶液體積。取3 mL制備的載藥納米膠囊裝入截留分子量為8000 g/mol的透析袋，置于30 mL含0.1% Twain80的PBS（pH7.4）溶液中透析，在0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h分別取樣200 μL，使用戴安UltiMate 3000PumP HPLC測(cè)定紫杉醇含量，并繪制緩釋曲線(xiàn)。

6、納米紫杉醇荷載膠囊-TRAIL蛋白藥物對(duì)癌細(xì)胞殺傷效果檢測(cè)

復(fù)蘇肝癌細(xì)胞株HepG2于DMEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素），在37℃、5% CO₂條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。胰酶消化，離心收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞重懸于DMEM培養(yǎng)基，以8×10³細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板，每孔含細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL，在37℃、5% CO₂條件下培養(yǎng)8 h使細(xì)胞貼壁，加入10 μL不同濃度的偶聯(lián)TRAIL載藥納米膠囊，共培養(yǎng)24 h后加入10 μL cck-8溶液，顯色反應(yīng)1-4 h后使用Bio-RAD酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值并計(jì)算細(xì)胞存活率。

7、納米紫杉醇荷載膠囊-TRAIL蛋白藥物對(duì)癌細(xì)胞靶向效果觀測(cè)

使用熒光染料芘代替紫杉醇包載進(jìn)納米膠囊后偶聯(lián)TRAIL蛋白。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以1x10⁶ 個(gè)/孔的密度接種于6孔板，每孔含細(xì)胞培養(yǎng)液2 mL，待細(xì)胞貼壁后加入200 μL不同濃度偶聯(lián)TRAIL的芘膠囊，對(duì)照組加入相同濃度的PBS。共培養(yǎng)24 h后使用Olympus Fluoview 1000熒光顯微鏡觀測(cè)并拍照。

8、納米紫杉醇荷載膠囊-TRAIL蛋白藥物對(duì)荷瘤裸鼠治療效果檢測(cè)

取4-5周齡Balb/c裸鼠在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心恒溫恒濕條件下飼養(yǎng)，墊料、飼料和飲水均經(jīng)滅菌處理，高效過(guò)濾器每小時(shí)換氣10～15次，相對(duì)濕度保持在46％～60％，每日保持10 h的光照、14 h無(wú)光的陰暗周期。待裸鼠體重達(dá)到15 g后，于右下肢接種HepG-2或MCF-7細(xì)胞，5 x10⁶個(gè)細(xì)胞/只，待腫瘤直徑長(zhǎng)至0.4-0.6 cm，建成荷瘤裸鼠模型。采用隨機(jī)數(shù)字法將荷瘤裸鼠分為5組，每組5-8只。將偶聯(lián)TRAIL載藥納米膠囊于腹腔注射給藥，200 μL/只（含TRAIL蛋白7 μg，紫杉醇70 μg），給藥后每天測(cè)定腫瘤大小（V），給藥當(dāng)天腫瘤體積記為V₀，兩周后殺死裸鼠取出腫瘤觀察，計(jì)算相對(duì)腫瘤體積V/V₀并繪制腫瘤體積變化趨勢(shì)圖。

本發(fā)明具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明首次將TRAIL作為靶向載體, TRAIL蛋白的氨基（-NH₂）與載藥納米膠囊的羧基（-COOH）偶聯(lián),制備成一種新型多功能靶向納米膠囊抗癌藥物，應(yīng)用于腫瘤治療。這種多功能靶向納米膠囊抗癌藥物借助TRAIL蛋白的靶向作用將藥物運(yùn)送至癌腫瘤處，有效地避免常規(guī)化療藥物對(duì)正常細(xì)胞的毒害作用。此外，TRAIL蛋白為人源性蛋白，無(wú)免疫源性。

2、本發(fā)明首次使用P123-F127-COOH-硅化納米膠囊包載紫杉醇，納米膠囊可使紫杉醇在活體內(nèi)緩慢釋放，減少紫杉醇對(duì)人體內(nèi)的非特異毒害作用。P123-F127-COOH-硅化納米膠囊本身對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒害作用。除紫杉醇外，P123-F127-COOH-硅化納米膠囊還可用于包埋其它疏水性較強(qiáng)的化療藥物。

3、本發(fā)明將使用TRAIL蛋白與納米載藥膠囊偶聯(lián)，除制備的多功能靶向納米膠囊抗癌藥物具有靶向性外，納米載藥膠囊中包載的化療藥物和偶聯(lián)的TRAIL蛋白都具有殺癌作用。此外，包載的化療藥物還能增強(qiáng)癌細(xì)胞表面的TRAIL蛋白受體，增強(qiáng)TRAIL蛋白對(duì)癌細(xì)胞的識(shí)別和促凋亡作用，使納米紫杉醇荷載膠囊-TRAIL蛋白藥物既可用于TRAIL蛋白敏感性腫瘤又可用于TRAIL蛋白非敏感性腫瘤。所以，本發(fā)明所制備的多功能靶向納米膠囊抗腫瘤藥物可以同時(shí)發(fā)揮TRAIL的靶向作用、促凋亡作用、納米載藥膠囊的緩釋作用以及常規(guī)化療藥物的抗癌作用，大大增強(qiáng)了對(duì)腫瘤的治療效果和殺癌譜。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明發(fā)明內(nèi)容中新型多功能靶向納米載藥膠囊抗癌藥物分子結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1為T(mén)EM觀測(cè)到的載藥納米膠囊形態(tài)，膠囊呈殼層結(jié)構(gòu)，大小均一。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1制備載藥納米膠囊的粒徑分布，膠囊平均粒徑為24 nm，具有良好的分散性。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1制備載藥納米膠囊在稀釋不同倍數(shù)后的粒徑分布，結(jié)果顯示制備的納米膠囊具有良好的穩(wěn)定性。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例2制備的載藥納米膠囊緩釋曲線(xiàn)，納米膠囊載藥濃度為256.4μg/mL，比紫杉醇固有的溶解度0.3μg/mL增溶了855倍，載藥量為0.39%，包封率為26.5%。當(dāng)載藥膠囊置于PBS溶液中透析時(shí)，膠囊在12 h內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定均勻地釋放紫杉醇，在24 h釋放量達(dá)到85.8%，結(jié)果表明膠囊結(jié)構(gòu)對(duì)紫杉醇有很好的控制釋放功能。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例3制備的偶聯(lián)TRAIL載藥納米膠囊對(duì)癌細(xì)胞HepG2殺傷性檢測(cè)結(jié)果。如圖所示，空膠囊對(duì)細(xì)胞無(wú)殺傷作用，即本發(fā)明所使用納米材料對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害作用；而包載紫杉醇表面偶聯(lián)TRAIL蛋白的納米膠囊，相較于紫杉醇注射劑、載紫杉醇膠囊以及純的TRAIL蛋白，對(duì)癌細(xì)胞HepG2具有更好的殺傷效果。圖注說(shuō)明：NCs：空膠囊；PTX：紫杉醇；PTX-NCs：紫杉醇納米膠囊；TRAIL：TRAIL蛋白；TRAIL-PTX-NCs：TRAIL偶聯(lián)的紫杉醇納米膠囊。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例4制備的偶聯(lián)TRAIL載藥納米膠囊對(duì)HepG2荷瘤裸鼠治療后的肝癌腫瘤體積變化趨勢(shì)圖。如圖所示，與對(duì)照組相比，包載紫杉醇表面偶聯(lián)TRAIL蛋白的納米膠囊對(duì)HepG2細(xì)胞種植的裸鼠皮下移植瘤有良好的療效，在腹腔注射藥物后，腫瘤停止生長(zhǎng)或消失。圖注說(shuō)明：PBS：磷酸緩沖液；PTX：紫杉醇；PTX-NCs：紫杉醇納米膠囊；TRAIL：TRAIL蛋白；TRAIL-PTX-NCs：TRAIL偶聯(lián)的紫杉醇納米膠囊。

圖8為本發(fā)明實(shí)施例5制備的偶聯(lián)TRAIL載藥納米膠囊對(duì)MCF-7荷瘤裸鼠治療后的乳腺癌腫瘤體積變化趨勢(shì)圖。MCF-7細(xì)胞株是對(duì)TRAIL蛋白不敏感的細(xì)胞株，如圖所示，當(dāng)TRAIL蛋白偶聯(lián)納米紫杉醇荷載膠囊后，對(duì)MCF-7細(xì)胞種植的裸鼠皮下移植瘤有良好的療效，腫瘤基本停止生長(zhǎng)。圖注說(shuō)明：PBS：磷酸緩沖液；PTX：紫杉醇；PTX-NCs：紫杉醇納米膠囊；TRAIL-PTX-NCs：TRAIL偶聯(lián)的紫杉醇納米膠囊。

具體實(shí)施方式

為能清楚說(shuō)明本發(fā)明方案的技術(shù)特點(diǎn)，下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行闡述。但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于這些實(shí)施例。凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1

1、將200 mg F127加入到200 mL無(wú)水甲苯中，攪拌至F127完全溶解，形成溶液A。向溶液A中加入0.2g丁二酸酐，攪拌后形成溶液B。將溶液B在150℃下沸浴加熱5h，減壓下蒸餾除去甲苯，用二氯甲烷洗滌蒸餾殘液，然后加入乙醚沉淀，再用乙醚重結(jié)晶，最后得到產(chǎn)物F127-COOH。

2、準(zhǔn)確稱(chēng)取180 mg P123和90 mg F127-COOH，超聲溶解于1 mL氯仿溶液，并加入4 mg紫杉醇，100 W超聲分散15 min。得到的混合溶液在75℃下真空干燥至氯仿完全蒸發(fā)完后得到納米薄膜。向薄膜內(nèi)加入4 mL去離子水，200 W超聲分散12 min即得到包載紫杉醇的納米膠束。取35 μL四甲氧基硅烷超聲分散于0.5 mL四氫呋喃溶液中，并逐滴加入上述制備好的載藥納米膠束中，并置于磁力攪拌儀上以750 rpm轉(zhuǎn)速攪拌三天，四甲氧基硅烷在膠束中水解形成一層二氧化硅殼，穩(wěn)定膠束的結(jié)構(gòu)從而形成載藥納米膠囊。

3、在3 ml磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）中加入5 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、6 mg N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）以及1 mL載藥納米膠囊，室溫避光旋轉(zhuǎn)反應(yīng)1 h活化膠囊表面的羧基。將反應(yīng)后的上述溶液裝入截留分子量為8000 g/mol透析袋，置于PBS溶液中透析24 h以除去未反應(yīng)的EDC和NHS。再向透析后的溶液中加入1 mL TRAIL（25 μg/mL）蛋白，4℃避光旋轉(zhuǎn)反應(yīng)12 h，即得到偶聯(lián)TRAIL蛋白的載藥納米膠囊。使用Tecanai G² 20 S-TWIN透射電子顯微鏡觀察膠囊形態(tài)并拍照。使用Malvern Zetasizer Nano-S粒度分析儀測(cè)定載藥納米膠囊的粒徑，并將膠囊稀釋100倍、200倍、500倍、1000倍后測(cè)定膠囊粒徑變化，結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3和圖4。

實(shí)施例2

首先按實(shí)例1制備TRAIL蛋白偶聯(lián)的載藥納米膠囊，然后取1 mL制備的載藥納米膠囊，加入2 mL乙腈超聲溶脹后使用島津分光光度計(jì)測(cè)定229nm處吸光值，并結(jié)合紫杉醇濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算紫杉醇含量以及膠囊載藥量、包封率以及載藥濃度。載藥量=載藥膠囊中實(shí)際負(fù)載的PTX含量/膠囊質(zhì)量，包封率=載藥膠囊中實(shí)際負(fù)載的PTX含量/反應(yīng)加入的紫杉醇含量，載藥濃度=載藥膠囊中實(shí)際負(fù)載的PTX含量/膠囊溶液體積。取3 mL制備的載藥納米膠囊裝入截留分子量為8000 g/mol的透析袋，置于含0.1% Twain80的PBS（pH7.4）溶液中透析，在0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h分別取樣200 μL使用戴安UltiMate 3000PumP HPLC測(cè)定紫杉醇含量，并繪制緩釋曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖5。

實(shí)施例3

首先按實(shí)例1制備TRAIL蛋白偶聯(lián)的載藥納米膠囊，再使用DMEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素）培養(yǎng)肝癌細(xì)胞HepG2，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO₂。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后，胰酶消化，離心收集細(xì)胞并重懸于DMEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素），以8000個(gè)/孔的密度接種于96孔板(LAB‐TEK, Chambered Coverglass System)，每孔含細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL，在37℃、5% CO₂條件下培養(yǎng)8 h使細(xì)胞貼壁。加入10 μL不同濃度的偶聯(lián)TRAIL載藥納米膠囊，共培養(yǎng)24 h后加入10 μL cck-8溶液，顯色反應(yīng)1 h后使用Bio-RAD酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值并計(jì)算細(xì)胞存活率，并使用熒光顯微鏡觀察膠囊對(duì)細(xì)胞的殺傷效果，結(jié)果見(jiàn)圖6。

實(shí)施例4

首先按實(shí)例1制備TRAIL蛋白偶聯(lián)的載藥納米膠囊。同時(shí)使用DMEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素）擴(kuò)大培養(yǎng)HepG2細(xì)胞。培養(yǎng)條件為37℃、5% CO₂。取4-5周齡Balb/c裸鼠在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心恒溫恒濕條件下飼養(yǎng)，墊料、飼料和飲水均經(jīng)滅菌處理，高效過(guò)濾器每小時(shí)換氣10～15次，相對(duì)濕度保持在46％～60％，每日保持10 h的光照、14 h無(wú)光的陰暗周期。待裸鼠體重達(dá)到15 g后，于右下肢接種HepG-2細(xì)胞，5×10⁶個(gè)細(xì)胞/只，待腫瘤直徑長(zhǎng)至0.4-0.6 cm，建立荷瘤裸鼠模型。采用隨機(jī)數(shù)字法將荷瘤裸鼠分為5組，每組5-8只。將偶聯(lián)TRAIL載藥納米膠囊于腹腔注射給藥，200 μL只（含TRAIL蛋白7 μg，紫杉醇70 μg），給藥后每天測(cè)定腫瘤大小V，給藥當(dāng)天腫瘤體積記為V₀，兩周后殺死裸鼠取出腫瘤觀察，計(jì)算相對(duì)腫瘤體積V/V₀并繪制腫瘤體積變化趨勢(shì)圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7。

實(shí)施例5

首先按實(shí)例1制備TRAIL蛋白偶聯(lián)的載藥納米膠囊。使用DMEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素）擴(kuò)大培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO₂。取4-5周齡Balb/c裸鼠按實(shí)施例4條件飼養(yǎng)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞于右下肢接種，5 x10⁶個(gè)細(xì)胞/只，待腫瘤直徑長(zhǎng)至0.4-0.6 cm，建立荷瘤裸鼠模型。采用隨機(jī)數(shù)字法將荷瘤裸鼠分為5組，每組5-8只。將偶聯(lián)TRAIL載藥納米膠囊于腹腔注射給藥，200 μl/只（含TRAIL蛋白7 μg，紫杉醇70 μg），給藥后每天測(cè)定腫瘤大小V，給藥當(dāng)天腫瘤體積記為V₀，兩周后殺死裸鼠取出腫瘤觀察，計(jì)算相對(duì)腫瘤體積V/V₀并繪制腫瘤體積變化趨勢(shì)圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8。