本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的，涉及一種microRNA在制備治療膀胱癌的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

microRNA(miR)，是一種大小約21-23個(gè)堿基的單鏈小分子RNA，通過和靶基因mRNA堿基配對(duì)引導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻譯，通常在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白表達(dá)(最近發(fā)現(xiàn)microRNA也能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá))。隨著對(duì)microRNA研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)表明microRNA分子在腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個(gè)環(huán)節(jié)中發(fā)揮著原癌基因或抑癌基因的作用。

膀胱癌是指發(fā)生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤。是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，也是全身十大常見腫瘤之一。占我國泌尿生殖系腫瘤發(fā)病率的第一位，而在西方其發(fā)病率僅次于前列腺癌，居第2位。2012年全國腫瘤登記地區(qū)膀胱癌的發(fā)病率為6.61/10萬，列惡性腫瘤發(fā)病率的第9位。膀胱癌可發(fā)生于任何年齡，甚至于兒童。其發(fā)病率隨年齡增長而增加，高發(fā)年齡50～70歲。男性膀胱癌發(fā)病率為女性的3～4倍。膀胱癌包括膀胱尿路上皮癌、膀胱鱗狀細(xì)胞癌、膀胱腺癌，其他罕見的還有膀胱透明細(xì)胞癌、膀胱小細(xì)胞癌、膀胱類癌。其中最常見的是膀胱尿路上皮癌，約占膀胱癌患者總數(shù)的90％以上。臨床上，手術(shù)或放療針對(duì)局限膀胱癌是有效的，并且針對(duì)轉(zhuǎn)移性膀胱癌治療仍然缺乏有效的藥物。

因此有必要尋找與膀胱癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的miRNA，從而為臨床上治療轉(zhuǎn)移性膀胱癌提供一種有效手段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種如下1)-4)中任一所述物質(zhì)在制備具有促進(jìn)腫瘤功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用：

1)miR-1255；

2)含有miR-1255的編碼基因的重組載體；

3)含有miR-1255的編碼基因的重組病毒；

4)含有miR-1255的編碼基因的重組病毒載體。所述促進(jìn)腫瘤功能為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移、擴(kuò)散和/或侵襲。所述腫瘤為膀胱癌。

所述產(chǎn)品為藥物；

所述microRNA-145的核苷酸序列為序列表中的序列1。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種重組細(xì)胞。

本發(fā)明提供的重組細(xì)胞，為將所述miR-1255、所述含有miR-1255的編碼基因的重組載體、所述含有miR-1255的編碼基因的重組病毒或含有miR-1255的編碼基因的重組病毒載體導(dǎo)入出發(fā)細(xì)胞中得到的重組細(xì)胞。

所述出發(fā)細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞；所述腫瘤細(xì)胞具體為膀胱癌細(xì)胞。

所述的重組細(xì)胞在篩選和/或制備抑制腫瘤細(xì)胞的遷移、擴(kuò)散和/或侵襲藥物中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種具有促進(jìn)腫瘤功能的產(chǎn)品。

本發(fā)明提供的產(chǎn)品，其活性成分為所述miR-1255、所述含有miR-1255的編碼基因的重組載體、所述含有miR-1255的編碼基因的重組病毒或含有microRNA-145的編碼基因的重組病毒載體。

所述促進(jìn)腫瘤為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移、擴(kuò)散和/或侵襲。

所述腫瘤為膀胱癌；

所述產(chǎn)品為藥物。

抑制miR-1255活性或者表達(dá)的物質(zhì)在制備具有抑制腫瘤功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

所述抑制腫瘤為抑制腫瘤細(xì)胞的遷移、擴(kuò)散和/或侵襲，所述腫瘤具體為膀胱癌。

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，miR-1255過表達(dá)后并未能影響SW780細(xì)胞的生長，但可顯著增強(qiáng)高轉(zhuǎn)移性膀胱癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，在膀胱癌轉(zhuǎn)移過程中可能起重要作用，因此說明，

miR-1255與膀胱癌轉(zhuǎn)移相關(guān)。

附圖說明

圖1為熒光顯微鏡下觀察慢病毒載體介導(dǎo)GFP-miR-1255在SW780細(xì)胞中的表達(dá)情況和RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-1255的相對(duì)含量；

圖2為利用CCK-8繪制SW780-miR-1255，SW780-nc的生長曲線；

圖3為miR-1255對(duì)SW780細(xì)胞遷移能力的影響；

圖4為miR-1255對(duì)SW780細(xì)胞侵襲能力的影響。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1、穩(wěn)定高表達(dá)miR-1255的轉(zhuǎn)移性膀胱癌細(xì)胞系的獲得

一、膀胱癌細(xì)胞系的獲得

大腸癌細(xì)胞系SW780(ATCC)，其培養(yǎng)基為含有10％的胎牛血清(Hyclone)和濃度為0.2％的青鏈霉素(Invitrogen)的DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen，31053036)。

A、細(xì)胞復(fù)蘇

(1)取出SW780(ATCC)的凍存管，立即放入37℃-40℃水浴中，快速搖晃直至完全融化。

(2)將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入10ml冷PBS中，放入15ml離心管中，用水平離心機(jī)離心細(xì)胞(1000轉(zhuǎn)/分鐘，8分鐘)后棄上清。

(3)用適量新鮮培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

B、細(xì)胞培養(yǎng)

將膀胱癌細(xì)胞系放入培養(yǎng)基中，于37℃，5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長情況，每天或者隔天更換新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞濃度約為培養(yǎng)瓶培養(yǎng)面積80％-90％時(shí)進(jìn)行傳代。

C、細(xì)胞凍存

(1)選取處于指數(shù)生長期的細(xì)胞，凍存前1天給細(xì)胞換液1次。

(2)貼壁細(xì)胞以常規(guī)方法消化，制備成單細(xì)胞懸液。收集懸液，離心(1000轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘)。

(3)棄上清，用凍存管重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×10⁶/mL。

(4)將細(xì)胞懸液移入凍存管，扭緊管蓋，注明細(xì)胞名稱和凍存日期，放入凍存盒，置于-80℃冰箱24小時(shí)后，移至液氮中保存。

D、細(xì)胞傳代

(1)倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，加入37℃PBS輕輕洗滌細(xì)胞，吸出PBS，加入胰蛋白酶(25cm²培養(yǎng)瓶加500微升胰酶，75cm²和10cm直徑培養(yǎng)皿加入1毫升胰酶)，在顯微鏡下觀察消化過程，待細(xì)胞變圓、細(xì)胞間連接斷開。

(2)加入十倍于胰酶體積的PBS，用一次性吸管將細(xì)胞輕輕吹打，成細(xì)胞懸液。

(3)收集懸液于15或者50mL離心管中，離心(1000轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘)。

(4)用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按1∶2移入新的培養(yǎng)平或培養(yǎng)皿，得到傳代后SW780細(xì)胞。

二、細(xì)胞轉(zhuǎn)染

1、轉(zhuǎn)染

GFP-miR-1255慢病毒表達(dá)系統(tǒng)(其中外源基因?yàn)閙iR-1255，Genebank號(hào)為NR_031656.1，即為序列1，購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，為能表達(dá)microRNA1255的慢病毒顆粒)，根據(jù)該公司的操作指南進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染：

1)、分別將生長良好的步驟一得到的傳代后SW780細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前一天接種到96孔板中(正常培養(yǎng)，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱)，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到30％。

2)、每孔中棄去原培養(yǎng)液，加入100μL培養(yǎng)基及1μL慢病毒試劑(GFP-miR-1255慢病毒表達(dá)系統(tǒng))，溫和混勻。

3)、37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，換正常培養(yǎng)基終止轉(zhuǎn)染。

4)、然后37℃培養(yǎng)72小時(shí)后，得到SW780-high細(xì)胞系。

采用同樣的方法將NC慢病毒表達(dá)系統(tǒng)(購自上海上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，其與GFP-miR-1255慢病毒表達(dá)系統(tǒng)相比沒有外源基因miR-1255)轉(zhuǎn)染SW780細(xì)胞，得到SW780-NC。

2、檢測(cè)細(xì)胞中miR-1255的表達(dá)

1)、熒光顯微鏡觀察

將上述獲得的SW780-high細(xì)胞系和SW780-NC分別置于熒光倒置顯微鏡下，檢測(cè)其表達(dá)miR-1255情況，結(jié)果如圖1中A和B所示，miR-1255為SW780-high細(xì)胞系，NC為SW780-NC，從圖中可以看出，SW780-high細(xì)胞系穩(wěn)定高表達(dá)miR-1255(有熒光反應(yīng))。

熒光顯微鏡下觀察到其轉(zhuǎn)染效率高達(dá)86％(通過流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)得到)。

2)、RT-PCR檢測(cè)

利用Trizol(Invitrogen，15596-018)提取上述獲得的SW780-high細(xì)胞系和SW780-NC細(xì)胞總RNA，以提出的總RNA為模板，miR-1255引物進(jìn)行RT-PCR，以U6為內(nèi)參(引物購買自Qiagen，貨號(hào)為MS00033740)；以未轉(zhuǎn)染病毒的SW780細(xì)胞和SW780(NC)細(xì)胞為對(duì)照。

結(jié)果如圖1C所示：SW780-high細(xì)胞系的miR-1255的相對(duì)表達(dá)率為2245；SW780-NC的miR-1255的相對(duì)表達(dá)率為1；未轉(zhuǎn)染病毒的SW780細(xì)胞中的miR-1255的相對(duì)表達(dá)率為1；可以看出，miR-1255在SW780high細(xì)胞系中穩(wěn)定過表達(dá)。

實(shí)施例2、SW780-high細(xì)胞系穩(wěn)定高表達(dá)miR-1255的功能研究

1、細(xì)胞生長曲線

(1)取轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，生長狀態(tài)良好的由實(shí)施例1得到的SW780-high，采用一般傳代 方法進(jìn)行消化，制成細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)，精準(zhǔn)地將細(xì)胞種在96孔板中，每孔細(xì)胞總數(shù)要求一致(2000個(gè)/孔)，加入培養(yǎng)劑的量也要一致，并設(shè)置空白對(duì)照(即同樣體積的培養(yǎng)基)，每孔終體積為100μL。置37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。

(2)每孔加入10ul的CCK-8溶液(購自日本同仁化學(xué)研究所貨號(hào)：CK04)?？筛鶕?jù)具體情況增加或減少CCK-8溶液的用量。

(3)正常培養(yǎng)條件(37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱)下培養(yǎng)4小時(shí)(培養(yǎng)時(shí)間取決于所使用的細(xì)胞類型和細(xì)胞濃度)。

(4)水平晃動(dòng)約10秒后用酶標(biāo)儀測(cè)量450nm波長的OD值，保存好數(shù)據(jù)。

(5)每天依次法測(cè)定，共7天。每培養(yǎng)2天要給未計(jì)數(shù)的細(xì)胞換液。

(6)以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，OD值為縱軸，描繪在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上，連接曲線后即成該細(xì)胞的生長曲線。

實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。

結(jié)果為圖2所示，可以看出SW780-high在加入CCK-8溶液后24、48、72、96小時(shí)的96孔板中每孔細(xì)胞的OD值分別為0.58、0.97、1.47、2.08。空白對(duì)照在加入CCK-8溶液24、48、72、96小時(shí)的96孔板中每孔細(xì)胞的總數(shù)分別為0.61、1.02、1.53、2.14；可以看出，miR-1255過表達(dá)后并未能影響SW780細(xì)胞的生長。

2、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

(1)將Transwell小室(購自Corning公司)用無血清DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen，31053036)平衡至少一個(gè)小時(shí)或過夜，有助于更好貼附和生長。

(2)實(shí)驗(yàn)前一天，將由實(shí)施例1得到的SW780-high細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)。

(3)將Transwell放入24孔板，在Transwell下室中加入600μL含有10％血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。

(4)先取轉(zhuǎn)染后24小時(shí)并無血清饑餓過的細(xì)胞，消化后進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×10⁵/mL，再在每個(gè)Transwell小室中加入100μL由實(shí)施例1得到的SW780-high細(xì)胞懸液(饑餓培養(yǎng)后，4×10⁴細(xì)胞)。每組設(shè)三個(gè)平行樣本。置于孵箱中培養(yǎng)。

(5)24小時(shí)后吸去上室液體，用PBS濕潤棉簽擦去膜上面未穿過聚碳酸酯膜上小孔的細(xì)胞，生理鹽水漂洗，稍干。

(6)0.5mL甲醇結(jié)晶紫溶液染色30分鐘，流水沖洗3-5次。

(7)用小刀片將聚碳酸酯膜小心切下，置膜于載玻片上，膜底面朝上，滴樹脂后用蓋玻片封片，顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，求和，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。

以轉(zhuǎn)染NC的SW780-NC為陰性對(duì)照(NC)。

實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。

結(jié)果如圖3所示，miR-1255組為SW780-high，NC組為SW780-NC，miR-1255組的細(xì)胞數(shù)為132，NC組的細(xì)胞數(shù)為45，miR-1255組大約為NC組的3倍(P<0.01)，這說明miR-1255能夠促進(jìn)細(xì)胞的垂直遷移能力。

3、細(xì)胞侵襲試驗(yàn)

(1)將槍頭、Eppendorf管、Matrigel膠(購自BD公司)、Transwell室、24孔板置于4℃過夜，由實(shí)施例1得到的SW780-high細(xì)胞換無血清培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)過夜。消化細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基吸打，調(diào)整細(xì)胞濃度在1×10⁶/mL。

(2)4℃溶解Matrigel基質(zhì)過夜，用預(yù)冷的槍頭將Matrigel膠混勻。

(3)將培養(yǎng)基置于冰上，預(yù)冷槍頭取20μL Matrigel膠(1∶3)于Transwell小室的上室，37℃放置30分鐘。

(4)預(yù)溫?zé)o血清培養(yǎng)基輕柔洗滌已凝固的Matrigel，加100μL細(xì)胞懸液(1×10⁵細(xì)胞)，每組設(shè)三個(gè)平行孔。

(5)下室加入600μL含10％胎牛血清的培養(yǎng)基。

(6)置于37℃、5％CO₂的培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)，棉簽拭去濾膜上表面未穿透的細(xì)胞。

(7)對(duì)已穿透的細(xì)胞進(jìn)行固定、結(jié)晶紫染色、封片，每個(gè)樣本均計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡視野，取其平均值。各組細(xì)胞穿透濾膜的數(shù)量的多少作為評(píng)價(jià)其侵襲能力的指標(biāo)。

以轉(zhuǎn)染NC的SW780為陰性對(duì)照為對(duì)照(NC)。

結(jié)果如圖4所示，miR-1255組為SW780-high，NC組為SW780-NC，miR-1255組的細(xì)胞數(shù)為98，NC組的細(xì)胞數(shù)為31，miR-1255組較對(duì)照組(NC組)細(xì)胞明顯增多。

這些體外功能預(yù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-1255過表達(dá)可顯著增強(qiáng)高轉(zhuǎn)移性膀胱癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，高度提示其在膀胱癌轉(zhuǎn)移過程中可能起重要作用。