本發(fā)明涉及納米材料領(lǐng)域和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有雙重響應(yīng)性、乳腺癌聯(lián)合化療的納米復(fù)合石墨烯水凝膠體系及其制備方法。

背景技術(shù)：

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在我國(guó)乳腺癌占全身各種惡性腫瘤的7％～10％，發(fā)病率約為18.7人/10萬(wàn)人，近年來(lái)增長(zhǎng)趨勢(shì)明顯。

紫杉醇(paclitaxel，PTX)是從短葉紅豆杉樹(shù)皮中分離得到的一種二萜類化合物，水溶性較差，屬疏水性藥物。它是一種新型的微管穩(wěn)定劑，它通過(guò)誘導(dǎo)和促進(jìn)微管蛋白聚合，穩(wěn)定微管而阻止腫瘤細(xì)胞的繁殖，臨床研究顯示紫杉醇治療乳腺癌具有較好的療效。表阿霉素(epirubicin，EPI)是阿霉素的半合成衍生物，能溶解在水中，屬親水性藥物。在劑量相同和采取相同的給藥方式時(shí)，表阿霉素和阿霉素抗瘤譜相近，但是表阿霉素對(duì)轉(zhuǎn)移性腫瘤的療效稍高于阿霉素，具有對(duì)心臟毒性減低，同時(shí)治療指數(shù)增高。相關(guān)臨床資料顯示，紫杉醇在對(duì)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌初治時(shí)有效率可以達(dá)到32％～60％，而對(duì)阿霉素具有耐藥的復(fù)發(fā)性轉(zhuǎn)移乳腺癌的有效率也能夠達(dá)到21％～32％，同時(shí)紫杉醇與表阿霉素不存在交叉耐藥，并且具有協(xié)同抗腫瘤作用，兩藥聯(lián)合治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌有效率為50％～70％，完全緩解率12％～15％。臨床研究已將表阿霉素和紫杉醇的聯(lián)合應(yīng)用作為乳腺癌化療的首選方案，但存在確定藥物用量等不確定因素的影響。

水凝膠是一種能夠在水中溶脹并保持大量水而又并不溶解的親水性聚合物，通過(guò)共價(jià)鍵、氫鍵或范德華力等作用相互交聯(lián)構(gòu)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。pH/溫度敏感水凝膠是一種既能響應(yīng)環(huán)境溫度刺激，又能響應(yīng)環(huán)境pH變化發(fā)生體積相變的親水性聚合物網(wǎng)絡(luò)。合成該凝膠的原料(單體或聚合物)通常為兩種或兩種以上，其中一種單體或聚合物在水凝膠中對(duì)溫度發(fā)生響應(yīng)，而另一種單體或聚合物在水凝膠中對(duì)pH值產(chǎn)生應(yīng)答。

石墨烯是2004年被發(fā)現(xiàn)的一種新型二維平面納米材料，其特殊的單原子層結(jié)構(gòu)決定了它具有豐富而新奇的物理性質(zhì)。由于石墨烯具有單原子層結(jié)構(gòu)，其比表面積很大，非常適合用作藥物載體。但結(jié)構(gòu)完整的石墨烯化學(xué)穩(wěn)定性高，其表面呈惰性狀態(tài)，必修對(duì)其進(jìn)行有效的功能化才能進(jìn)一步應(yīng)用。為了改善水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度，已有研究報(bào)道將石墨烯作為添加劑參與水凝膠的合成過(guò)程。

CN201110458092.4公布了一種氧化石墨烯/聚(N-異丙基丙烯酰胺)復(fù)合水凝膠的制備方法，首先制成氧化石墨烯膠體溶液，然后向氧化石墨烯膠體溶液中加入N-異丙基丙烯酰胺、 交聯(lián)劑、引發(fā)劑發(fā)生聚合反應(yīng)，得到復(fù)合水凝膠。該復(fù)合水凝膠具有良好的溫度響應(yīng)性與力學(xué)性能，在藥物控釋方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

CN201410378230.1公布了一種氧化石墨烯/殼聚糖接枝型雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的制備方法，首先合成氧化石墨烯/殼聚糖接枝水凝膠第一層網(wǎng)絡(luò)，第二網(wǎng)絡(luò)穿插在第一網(wǎng)絡(luò)的內(nèi)部，在紫外光照射下合成雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠。該水凝膠不僅保持了傳統(tǒng)水凝膠優(yōu)異的物理性能，而且獲得了較高的壓縮強(qiáng)度和拉伸強(qiáng)度，提高了該雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。

目前為止，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)納米復(fù)合石墨烯水凝膠同時(shí)運(yùn)載表阿霉素(親水性)和紫杉醇(疏水)兩種抗癌藥物并用于乳腺癌聯(lián)合化療的報(bào)道。本發(fā)明開(kāi)發(fā)了一種具有pH/溫度雙重響應(yīng)性，可以同時(shí)運(yùn)載表阿霉素和紫杉醇的納米復(fù)合石墨烯水凝膠載藥體系，并進(jìn)行其對(duì)乳腺癌MCF-7的抗癌活性研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種具有pH/溫度雙重響應(yīng)性，可以同時(shí)運(yùn)載乳腺癌聯(lián)合化療藥物紫杉醇和表阿霉素的納米復(fù)合石墨烯水凝膠載藥體系的制備方法。該方法合成的納米復(fù)合石墨烯藥物載體呈三維多孔立體結(jié)構(gòu)，生物相容性好、藥物負(fù)載量高等優(yōu)點(diǎn)，在納米藥物載體領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。

為達(dá)到本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下步驟：

步驟1：采用兩親性聚合物PF127修飾，并用水合肼將氧化石墨烯還原為石墨烯，進(jìn)而負(fù)載疏水性藥物PTX，得到負(fù)載疏水性藥物紫杉醇的石墨烯PTX@GN；

步驟2：將PTX@GN作為添加劑，再選用溫敏性的N-異丙基丙烯酰胺NIPAM單體為第一網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)自由基聚合反應(yīng)制備得到單網(wǎng)絡(luò)水凝膠GSL；再選用pH響應(yīng)性的丙烯酸AA單體作為第二網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)紫外輻照的方法合成pH/溫度雙重響應(yīng)性的納米復(fù)合石墨烯雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠GDL；

步驟3：將納米復(fù)合石墨烯水凝膠再負(fù)載親水性藥物表阿霉素EPI，得到負(fù)載雙重藥物PTX和EPI的納米復(fù)合石墨烯水凝膠雙載藥體系EPI@PTX@GDL；

步驟4：對(duì)單載表阿霉素雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠體系EPI@GDL、單載紫杉醇的石墨烯體系PTX@GN、納米復(fù)合石墨烯水凝膠雙載藥體系EPI@PTX@GDL都進(jìn)行了細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，將其與乳腺癌MCF-7細(xì)胞共培育，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性，并用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察活細(xì)胞形態(tài)。

具體步驟為：

步驟1：采用兩親性聚合物PF127修飾氧化石墨烯，并用水合肼將氧化石墨烯還原為石墨烯，進(jìn)而負(fù)載疏水性藥物PTX，得到負(fù)載疏水性藥物紫杉醇的石墨烯(PTX@GN)。

將300～400mg PF127加入到10～20mL，0.5～1.5mg/mL石墨烯(GO)水溶液中，室溫?cái)嚢柘录尤?00～500μL水合肼，于30～50℃下超聲攪拌反應(yīng)12～36h，將氧化石墨烯(GO)還原為石墨烯(GN)。反應(yīng)結(jié)束后將混合液進(jìn)行壓濾即得PF127修飾的石墨烯。將0.008～0.012g PF127修飾的GN加入到20～40mL，0.8～1.2mg/mL PTX的PBS緩沖液中，25℃下避光攪拌14～18h，離心并洗滌，冷凍干燥得到載紫杉醇的石墨烯(PTX@GN)。

步驟2：將PTX@GN作為添加劑，再選用溫敏性的NIPAM為第一網(wǎng)絡(luò)單體，通過(guò)自由基聚合反應(yīng)制備得到單網(wǎng)絡(luò)石墨烯水凝膠(graphene single-network hydrogel,GSL)；然后選用pH響應(yīng)性AA作為第二網(wǎng)絡(luò)單體，通過(guò)紫外輻照的方法合成pH/溫度雙重響應(yīng)性的納米復(fù)合石墨烯雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠(graphene double-network hydrogel,GDL)。

將0.8～1.2g NIPAM、0.01～0.03g PTX@GN、0.01～0.03g N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺(BIS)溶于8～12mL水中，在冰水浴中持續(xù)攪拌1～3h至單體完全溶解。然后加入10～30μL促進(jìn)劑N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)，繼續(xù)攪拌5～15min。最后，稱取0.01～0.03g過(guò)硫酸胺(APS)加入溶液中，攪拌至溶解，將溶液移放至18～22℃的水浴中靜置22～26h，得到第一網(wǎng)絡(luò)水凝膠GSL。將制備得到的第一網(wǎng)絡(luò)水凝膠用去離子水洗滌，置于0.04～0.06g2-氧代戊二酸(2-OG)、0.01～0.03g BIS、1～3mol/L的AA溶液中，靜置44～52h后紫外輻照8～12h(燈與凝膠間距18～22cm)，得雙重響應(yīng)性雙網(wǎng)絡(luò)納米復(fù)合石墨烯水凝膠GDL。

步驟3：納米復(fù)合石墨烯水凝膠對(duì)表阿霉素的負(fù)載

將7～8mg EPI和150～170mg納米復(fù)合石墨烯水凝膠添加到20～40mL的PBS(pH＝7.4)緩沖溶液中，室溫避光振蕩22～26h后，離心并洗滌，得到負(fù)載雙重藥物PTX和EPI的納米復(fù)合石墨烯水凝膠載藥體系(EPI@PTX@GDL)。

為了更好地進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，步驟2中可直接將PF127修飾的GN作為添加劑，合成出不載紫杉醇的納米復(fù)合石墨烯水凝膠GDL，再進(jìn)行負(fù)載表阿霉素的實(shí)驗(yàn)，就可以得到負(fù)載表阿霉素單藥的納米復(fù)合石墨烯水凝膠載藥體系(EPI@GDL)。

步驟4：對(duì)a.空白石墨烯雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠GDL、b.空白石墨烯GN、c.雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠單載表阿霉素體系EPI@GDL、d.石墨烯單載紫杉醇體系PTX@GN、e.雙網(wǎng)絡(luò)石墨烯水凝膠雙載藥體系(EPI@PTX@GDL)都進(jìn)行了細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，將其與乳腺癌MCF-7細(xì)胞共培育，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性。

(1)在裝有上述各載體的EP管中，加入100μL75％乙醇消毒，12000rpm/min，離心5min，隨后用PBS清洗，離心，重復(fù)2次，備用。

(2)將MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基中，37℃、5％CO₂恒溫培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，每2～3天換液體一次，每3～5天傳代一次。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)密度達(dá)到80％～90％后，棄 去細(xì)胞培養(yǎng)基，加入2mL PBS洗滌2次，棄去PBS，加入2mL含有0.25％的胰蛋白酶與0.02％EDTA的消化液消化，消化30～60s后棄去大部分消化液，剩下的消化液再繼續(xù)消化大約l～2min；鏡下觀察，細(xì)胞完全從細(xì)胞壁上分離并盡可能吹打成單個(gè)細(xì)胞，將細(xì)胞的密度調(diào)到1×10⁴個(gè)/mL，然后加入細(xì)胞瓶或者培養(yǎng)板中傳代培養(yǎng)。

(3)稱取25mg MTT(3-(4,5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，噻唑藍(lán)，Sigma公司)溶于5mL PBS，配成濃度為5mg/mL的MTT溶液。用0.22μm多孔濾膜過(guò)濾滅菌，用前現(xiàn)配。將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的MCF-7細(xì)胞接種于96孔板，利用DMEM高糖完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度的上述載體，同時(shí)設(shè)置只加入DMEM高糖完全培養(yǎng)基作為對(duì)照組，未接種細(xì)胞作為空白組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，分別繼續(xù)培養(yǎng)24h，每孔加入20μL、5mg/mL的MTT溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄去孔內(nèi)的培養(yǎng)基，然后每孔加入200μL二甲基亞砜(DMSO)，置搖床避光低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。利用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值(OD)。將對(duì)照組的細(xì)胞存活率定義為100％，存活率按公式計(jì)算：

細(xì)胞存活率＝(試驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×l00％

取25mg熒光素二乙酸酯(Fluorescein Diacetate，F(xiàn)DA)溶于5mL丙酮中配制成母液，使用時(shí)將母液按1：1000的體積比稀釋于PBS中。MCF-7細(xì)胞用5μg/mL的FDA/PBS溶液孵育10min，在這個(gè)過(guò)程中，F(xiàn)DA進(jìn)入活細(xì)胞膜，在488nm的激發(fā)下發(fā)出熒光。培養(yǎng)3天后的活細(xì)胞通過(guò)熒光顯微鏡(Zeiss Axovert 200)觀察。

所述步驟1中，所述的PF127質(zhì)量?jī)?yōu)選400mg，石墨烯質(zhì)量濃度優(yōu)選1.0mg/mL，水合肼體積優(yōu)選400μL。PF127修飾GN的質(zhì)量?jī)?yōu)選0.01g，PTX藥物的濃度優(yōu)選1mg/mL。

所述步驟2中，NIPAM質(zhì)量?jī)?yōu)選1g，PTX@GN質(zhì)量?jī)?yōu)選0.02g，N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺(BIS)質(zhì)量?jī)?yōu)選0.02g。丙烯酸AA的濃度優(yōu)選2mol/L。紫外輻照時(shí)間優(yōu)選10h。燈與凝膠間距優(yōu)選20cm。

所述步驟3中，EPI的質(zhì)量?jī)?yōu)選7.5mg，納米復(fù)合石墨烯水凝膠GDL的質(zhì)量?jī)?yōu)選160.9mg，PBS體積優(yōu)選30mL，室溫振蕩時(shí)間優(yōu)選24h。

本發(fā)明所取得的有益效果：

(1)本發(fā)明通過(guò)紫外輻照法，合成了一種具有pH/溫度雙重響應(yīng)性，可以同時(shí)運(yùn)載乳腺癌聯(lián)合化療藥物紫杉醇和表阿霉素的納米復(fù)合石墨烯水凝膠載藥體系GDL，制備方法操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)條件溫和。

(2)本發(fā)明該方法合成的納米復(fù)合石墨烯水凝膠呈三維多孔立體結(jié)構(gòu)，具有生物相容性好、雙重響應(yīng)性、藥物負(fù)載量高等優(yōu)點(diǎn)，在納米藥物載體領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。

(3)本發(fā)明首次采用納米復(fù)合石墨烯水凝膠同時(shí)負(fù)載乳腺癌聯(lián)合化療藥物PTX和EPI， 尚未見(jiàn)到有探討石墨烯水凝膠對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞毒性的研究報(bào)道。本發(fā)明合成的納米復(fù)合石墨烯水凝膠在用量較少的情況下10μg/mL就表現(xiàn)出對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞較好的抑制作用。

附圖說(shuō)明

圖1為具體實(shí)施例所制備的樣品的FTIR圖譜：a.石墨烯單網(wǎng)絡(luò)水凝膠GSL；b.石墨烯雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠GDL。

圖2為具體實(shí)施例所制備樣品的SEM圖：a.氧化石墨烯(GO)；b.石墨烯單網(wǎng)絡(luò)水凝膠GSL；c.d.石墨烯雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠GDL，為雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠GDL不同放大倍數(shù)5000倍和2000倍的SEM圖片。

圖3為石墨烯雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠GDL在不同溫度下的溶脹曲線：a.25℃；b.37℃；c.50℃。

圖4為石墨烯雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠GDL在水中的溶脹度與溫度的關(guān)系圖。

圖5為石墨烯雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠GDL在不同pH值緩沖溶液中溶脹度與pH值的關(guān)系圖。

圖6為具體實(shí)施例所制備的石墨烯雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠GDL在保持T＝25℃不變，分別在pH＝5.4和pH＝7.4條件下所測(cè)的藥物緩釋曲線：(A)EPI；(B)PTX。

圖7為具體實(shí)施例所制備的石墨烯雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠GDL在保持pH＝5.4不變，分別在T＝25℃、T＝37℃條件下所測(cè)的藥物緩釋曲線：(A)EPI；(B)PTX。

圖8為MCF-7細(xì)胞加入樣品后的細(xì)胞毒性圖：a.空白雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠GDL、b.空白石墨烯GN、c.雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠單載表阿霉素體系EPI@GDL、d.石墨烯單載紫杉醇體系PTX@GN、e.雙網(wǎng)絡(luò)石墨烯水凝膠雙載藥體系(EPI@PTX@GDL)。

圖9為MCF-7細(xì)胞加入不同濃度載藥體系后的熒光顯微鏡圖片：a.0μg/mL；b.10μg/mL(b-1.EPI@GDL；b-2.PTX@GN；b-3.EPI@PTX@GDL)；c.100μg/mL(c-1.EPI@GDL；c-2.PTX@GN；c-3.EPI@PTX@GDL)；d.500μg/mL(d-1.EPI@GDL；d-2.PTX@GN；d-3.EPI@PTX@GDL)。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但下述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍并無(wú)明確限制。

實(shí)施例1

步驟1：?jiǎn)屋d紫杉醇的石墨烯體系的制備(PTX@GN)

將0.12g的GO加入到100mL1％的CTAB蒸餾水溶液中，在冰浴中超聲分散30min后，攪拌6h，于10000r min^-1下離心分離，并用蒸餾水多次離心洗滌。將產(chǎn)物與0.24g的PSS溶液200mL混合，超聲分散30min，攪拌6h，繼續(xù)用蒸餾水離心清洗2～3次，于40℃真空干燥，所得樣品即為表面帶負(fù)電荷的改性氧化石墨烯f-GO。

將400mg的PF127加入到15mL，1.0mg/mL的f-GO水溶液中，室溫?cái)嚢柘录尤?00μL的水合肼，于40℃下超聲攪拌反應(yīng)24h，將氧化石墨烯(GO)還原為石墨烯(GN)。反應(yīng)結(jié)束后將混合液進(jìn)行壓濾即得PF127修飾的GN。將PF127修飾的GN加入到30mL，1mg/mLPTX的PBS緩沖液中，25℃下避光攪拌16h，離心并洗滌，冷凍干燥得到載紫杉醇的石墨烯(PTX@GN)。

步驟2：負(fù)載PTX的納米復(fù)合石墨烯水凝膠的制備

將1.0g NIPAM、0.02g PTX@GN、0.02g N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺(BIS)溶于10mL水中，在冰水浴中持續(xù)攪拌2h至單體完全溶解。然后加入20μL促進(jìn)劑N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)，繼續(xù)攪拌10min。最后，稱取0.02g過(guò)硫酸胺(APS)加入溶液中，攪拌至溶解，將溶液移放至20℃的水浴中靜置24h，得到第一網(wǎng)絡(luò)水凝膠。將制備得到的第一網(wǎng)絡(luò)水凝膠用去離子水洗滌，置于0.05g 2-氧代戊二酸(2-OG)、0.02g BIS、2.0mol/L的AA溶液中，靜置48h后紫外輻照10h(燈與凝膠間距20cm)，得雙重響應(yīng)性雙網(wǎng)絡(luò)納米復(fù)合石墨烯水凝膠GDL。

步驟3：納米復(fù)合石墨烯雙載藥體系的制備(EPI@PTX@GDL)

將7.5mg EPI和160.9mg納米復(fù)合石墨烯水凝膠添加到30mL的PBS(pH＝7.4)緩沖溶液中，室溫避光振蕩24h后，離心并洗滌，得到負(fù)載雙重藥物PTX和EPI的納米復(fù)合石墨烯水凝膠載藥體系(EPI@PTX@GDL)。

步驟4：藥物載體的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的MCF-7細(xì)胞接種于96孔板，利用DMEM高糖完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每孔200μL(細(xì)胞的密度1×104個(gè)/mL)，培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度的載體：?jiǎn)屋d紫杉醇的石墨烯體系(PTX@GN)、雙網(wǎng)絡(luò)石墨烯水凝膠雙載藥體系(EPI@PTX@GDL)。載體濃度分別為(1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL)，同時(shí)設(shè)置只加入DMEM高糖完全培養(yǎng)基的MCF-7作為對(duì)照組，未接種細(xì)胞作為空白組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，分別繼續(xù)培養(yǎng)24h，每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL)，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄去孔內(nèi)的培養(yǎng)基，然后每孔加入200μL的二甲基亞砜(DMSO)，置搖床避光低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。利用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值(OD)。將對(duì)照組的細(xì)胞存活率定義為100％，存活率按公式計(jì)算:細(xì)胞存活率＝(試驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×l00％。

取25mg熒光素二乙酸酯(Fluorescein Diacetate，F(xiàn)DA)溶于5mL丙酮中配制成母液，使用時(shí)將母液按1：1000的體積比稀釋于PBS中。MCF-7細(xì)胞用5μg/mL的FDA/PBS溶液孵育10min，在這個(gè)過(guò)程中，F(xiàn)DA進(jìn)入活細(xì)胞膜，在488nm的激發(fā)下發(fā)出熒光。培養(yǎng)3天后的活細(xì)胞通過(guò)熒光顯微鏡(Zeiss Axovert 200)觀察。

實(shí)施例2

為了更好地進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，步驟2中可直接將PF127修飾的GN作為添加劑合成出不載紫杉醇的納米復(fù)合石墨烯水凝膠GDL，再進(jìn)行負(fù)載表阿霉素的實(shí)驗(yàn)，就可以得到負(fù)載表阿霉素單藥的納米復(fù)合石墨烯水凝膠載藥體系(EPI@GDL)。

步驟1：PF127修飾石墨烯體系的制備(空白GN載體)

將0.12g的GO加入到100mL1％的CTAB蒸餾水溶液中，在冰浴中超聲分散30min后，攪拌6h，于10000r min^-1下離心分離，并用蒸餾水多次離心洗滌。將產(chǎn)物與0.24g的PSS溶液200mL混合，超聲分散30min，攪拌6h，繼續(xù)用蒸餾水離心清洗2～3次，于40℃真空干燥，所得樣品即為表面帶負(fù)電荷的改性氧化石墨烯f-GO。

將400mg的PF127加入到15mL，1.0mg/mL的f-GO水溶液中，室溫?cái)嚢柘录尤?00μL的水合肼，于40℃下超聲攪拌反應(yīng)24h，將氧化石墨烯(GO)還原為石墨烯(GN)。反應(yīng)結(jié)束后將混合液進(jìn)行壓濾即得PF127修飾的GN。

步驟2：納米復(fù)合石墨烯水凝膠的制備(空白GDL載體)

將1.0g NIPAM、0.02g GN、0.02g N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺(BIS)溶于10mL水中，在冰水浴中持續(xù)攪拌2h至單體完全溶解。然后加入20μL促進(jìn)劑N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)，繼續(xù)攪拌10min。最后，稱取0.02g過(guò)硫酸胺(APS)加入溶液中，攪拌至溶解，將溶液移放至20℃的水浴中靜置24h，得到第一網(wǎng)絡(luò)水凝膠。將制備得到的第一網(wǎng)絡(luò)水凝膠用去離子水洗滌，置于0.05g 2-氧代戊二酸(2-OG)、0.02g BIS、2.0mol/L的AA溶液中，靜置48h后紫外輻照10h(燈與凝膠間距20cm)，得不負(fù)載紫杉醇的雙重響應(yīng)性雙網(wǎng)絡(luò)納米復(fù)合石墨烯水凝膠GDL。

步驟3：?jiǎn)屋dEPI的納米復(fù)合石墨烯水凝膠載藥體系的制備(EPI@GDL)

將7.5mg EPI和160.9mg納米復(fù)合石墨烯水凝膠添加到30mL的PBS(pH＝7.4)緩沖溶液中，室溫避光振蕩24h后，離心并洗滌，得到單載EPI的納米復(fù)合石墨烯水凝膠載藥體系(EPI@GDL)。

步驟4：

將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的MCF-7細(xì)胞接種于96孔板，利用DMEM高糖完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每孔200μL(細(xì)胞的密度1×104個(gè)/mL)，培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度的載體空白石墨烯雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠GDL、空白石墨烯GN、單載表阿霉素雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠體系EPI@GDL。載體濃度分別為(1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL)，同時(shí)設(shè)置只加入DMEM高糖完全培養(yǎng)基的MCF-7作為對(duì)照組，未接種細(xì)胞作為空白組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，分別繼續(xù)培養(yǎng)24h，每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL)，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄去孔內(nèi)的培養(yǎng)基， 然后每孔加入200μL的二甲基亞砜(DMSO)，置搖床避光低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。利用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值(OD)。將對(duì)照組的細(xì)胞存活率定義為100％，存活率按公式計(jì)算:細(xì)胞存活率＝(試驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×l00％。

取25mg熒光素二乙酸酯(Fluorescein Diacetate，F(xiàn)DA)溶于5mL丙酮中配制成母液，使用時(shí)將母液按1：1000的體積比稀釋于PBS中。MCF-7細(xì)胞用5μg/mL的FDA/PBS溶液孵育10min，在這個(gè)過(guò)程中，F(xiàn)DA進(jìn)入活細(xì)胞膜，在488nm的激發(fā)下發(fā)出熒光。培養(yǎng)3天后的活細(xì)胞通過(guò)熒光顯微鏡(Zeiss Axovert 200)觀察。

對(duì)制備過(guò)程中的中間產(chǎn)物及本發(fā)明最終產(chǎn)物進(jìn)行性能分析。

納米復(fù)合石墨烯水凝膠的性能測(cè)試

(1)溶脹性能測(cè)試：

將干燥后的凝膠切成小片，準(zhǔn)確稱重。將切好的干凝膠小片分別放在不同溫度下的蒸餾水中，每隔一段時(shí)間取出稱重，直至凝膠恒重。凝膠各時(shí)刻的溶脹度(swelling rate，SR)可由式①計(jì)算：

SR＝(Ws-Wq)/Wq ①

式中：Ws為凝膠吸水一段時(shí)間后的質(zhì)量；Wq為干凝膠的干重。

(2)溫敏性測(cè)試：

將干燥后的凝膠切成2mm×1cm×1cm的小片，準(zhǔn)確稱重，放入容器中。將容器置于水浴鍋中，逐漸升高溫度，每隔一段溫度區(qū)間取出水凝膠并擦干表面水分后稱重，直至凝膠恒重。凝膠各時(shí)刻的溶脹度可由式②計(jì)算：

SR＝W_m/W₀×100％ ②

式中：W_m為凝膠在不同溫度區(qū)間達(dá)到溶脹平衡時(shí)的質(zhì)量；W₀為干凝膠的初始質(zhì)量。

(3)pH敏感性測(cè)試

將干燥后的凝膠切成2mm×1cm×1cm的小片，準(zhǔn)確稱重。放入不同pH值的溶液中，浸泡48h后取出擦干表面水分，稱重。凝膠的溶脹度可由式③計(jì)算：

SR＝W_n/W₀×100％ ③

式中：W_n為凝膠在不同pH溶液中達(dá)到溶脹平衡時(shí)的質(zhì)量；W₀為干凝膠的初始濕重。

納米復(fù)合石墨烯水凝膠載藥體系的緩釋研究：

(1)表阿霉素和紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

精確稱量紫杉醇5.00mg置于l00mL容量瓶中，用含0.1％(w/v)Tween 80的PBS溶解，并稀釋成一系列已知濃度的溶液，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定這些溶液在230nm處的吸光度，以吸光度對(duì)藥物濃度作圖，得到紫杉醇的吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，該標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為: Y＝16.032X+0.0766，(相關(guān)系數(shù)R²＝0.981)。借助包封率衡量體系的載藥能力，載藥率＝(藥物的質(zhì)量/投藥量)×100％，計(jì)算出紫杉醇的包封率為72.6％。

表阿霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

精確稱量表阿霉素5.00mg置于l00mL容量瓶中，用PBS溶解，并稀釋成一系列已知濃度的溶液，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定這些溶液在480nm處的吸光度，以吸光度對(duì)藥物濃度作圖，得到表阿霉素的吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，該標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為:Y＝18.483X+0.0615，(相關(guān)系數(shù)R²＝0.999)。借助包封率衡量體系的載藥能力，載藥率＝(藥物的質(zhì)量/投藥量)×100％，計(jì)算出表阿霉素的包封率為67.0％。

(2)納米復(fù)合石墨烯水凝膠載藥體系在不同溫度下的緩釋研究

將載藥后的水凝膠分別放在不同溫度的PBS緩沖溶液中，然后放入搖床中緩釋，每隔一段時(shí)間從搖床取3mL緩沖液，并加入3mL新的緩沖液，持續(xù)緩釋48h。記錄每次取樣時(shí)間，并利用紫外分光光度計(jì)和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算納米復(fù)合石墨烯水凝膠的藥物累計(jì)釋放率。

通過(guò)線性回歸方程得到各個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品的濃度，根據(jù)以下公式計(jì)算藥物累積釋放率并得到其關(guān)于時(shí)間的曲線。W_n＝(50C_n+3×∑C_n-1)/m₀×100％，其中W_n表示第n次藥物的累積釋放率，C_n是第n次取樣的質(zhì)量濃度，m₀是載藥體系中藥物的質(zhì)量。

(3)納米復(fù)合石墨烯水凝膠載藥體系在不同pH下的緩釋研究

將載藥后的納米石墨烯水凝膠載藥體系分別放在不同pH值的PBS緩沖溶液中，然后放入搖床中緩釋，每隔一段時(shí)間從搖床取3mL緩沖液，并加入3mL新的緩沖液，持續(xù)緩釋48h。記錄每次取樣時(shí)間，并利用紫外分光光度計(jì)和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算納米復(fù)合石墨烯水凝膠載藥體系的藥物累計(jì)釋放率。

圖1為具體實(shí)施例所制備的樣品的FTIR圖譜：a.石墨烯單網(wǎng)絡(luò)水凝膠GSL；b.石墨烯雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠GDL。圖1a中，1637cm^-1為NIPAM中C＝O的伸縮振動(dòng)峰(酰胺I)，1540cm^-1為N-H彎曲振動(dòng)峰(酰胺II)，1050cm^-1是NIPAM中C-OH的伸縮振動(dòng)峰，這表明成功合成了以PNIPAM作為第一網(wǎng)絡(luò)的水凝膠。對(duì)比圖1a，圖1b中在1720cm^-1處出現(xiàn)了新峰，它對(duì)應(yīng)著AA上羧基的特征吸收峰。這意味著在交聯(lián)過(guò)程中，AA上的很多-COOH未參與反應(yīng)，這些基團(tuán)為水凝膠的pH響應(yīng)性提供了有力的保證。

圖2為具體實(shí)施例所制備樣品的SEM圖：a.氧化石墨烯(GO)；b.石墨烯單網(wǎng)絡(luò)水凝膠GSL；c.d.石墨烯雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠GDL，為雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠GDL不同放大倍數(shù)5000倍和2000倍的SEM圖片。從圖2a中可明顯看出改性后氧化石墨烯具有類似的層狀結(jié)構(gòu)，分布較均勻，無(wú)明顯團(tuán)聚現(xiàn)象。從圖2b可以看出單網(wǎng)絡(luò)水凝膠GSL具有呈三維多孔結(jié)構(gòu)。從圖2c和2d為雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠GDL不同放大倍數(shù)5000倍和2000倍的SEM圖片，可以看出成功合成了相 互貫穿的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠GDL。對(duì)比圖2b，隨著凝膠組成中丙烯酸AA的加入增加了水凝膠結(jié)構(gòu)的相對(duì)交聯(lián)密度，雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠具有更加致密的孔洞結(jié)構(gòu)。而且所制備的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠具有相互貫穿的孔洞結(jié)構(gòu)，由于孔洞結(jié)構(gòu)的存在，為水分子的進(jìn)出提供了通道，有利于水凝膠的快速溶脹與退溶脹。

圖3為石墨烯雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠GDL在不同溫度下的溶脹曲線：a.25℃；b.37℃；c.50℃。從圖3a中可看出雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠GDL在低溫25℃時(shí)，300min左右達(dá)到溶脹平衡，且平衡溶脹度高達(dá)600％。由圖3b和3c可看出，雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠在高溫37℃和50℃時(shí)基本不溶脹。對(duì)比可知，雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠在低溫時(shí)的溶脹度比高溫時(shí)的溶脹度大。這是因?yàn)镹IPAAm是一個(gè)溫敏性的單體，在低溫時(shí)凝膠處于溶脹狀態(tài)可以吸收更多的水分，在高溫時(shí)凝膠會(huì)收縮，吸收的水分較少。

圖4為石墨烯雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠GDL在去離子水中的溶脹度與溫度的關(guān)系圖。如圖4所示，所制備的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠在去離子水中的溶脹度都隨溫度的升高而降低，表現(xiàn)出較為明顯的溫度敏性，其臨界相轉(zhuǎn)變溫度(LCST)在33℃左右。AA中的-COOH為親水性基團(tuán)，加入AA可以提高水凝膠的LCST，但測(cè)試結(jié)果表明水凝膠的LCST并沒(méi)有明顯提高，可能是由于石墨烯的引入使得水凝膠的LCST有所降低。

圖5為石墨烯雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠GDL在不同pH值緩沖溶液中溶脹度與pH值的關(guān)系圖。如圖5所示，在較低和較高的pH值的溶液中其溶脹度低，在偏中性的溶液中的溶脹度較高。這是因?yàn)锳A單體有-COOH基團(tuán)，屬于陰性敏感型單體。在強(qiáng)酸性溶液中時(shí)，由于凝膠中可離子化基團(tuán)的離解度較低，靜電排斥作用小，水凝膠網(wǎng)絡(luò)處于收縮狀態(tài)，導(dǎo)致溶脹度降低；當(dāng)溶液的pH值偏弱酸性時(shí)，離解度增大，靜電排斥作用增強(qiáng)，水凝膠的溶脹度急劇增大；隨著pH的增大，離解度趨于完全，凝膠內(nèi)、外的離子濃度基本相等，凝膠開(kāi)始收縮。

圖6為具體實(shí)施例所制備的石墨烯雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠GDL在25℃、pH＝5.4和pH＝7.4條件下所測(cè)的藥物緩釋曲線：(A)EPI；(B)PTX。如圖6A所示，在80h之后，雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠在pH＝5.4和pH＝7.4分別釋放了75％和38％的表阿霉素EPI。如圖6B所示，在60h之后，雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠在pH＝5.4和pH＝7.4分別釋放了51％和41％的紫杉醇PTX。水凝膠復(fù)合載藥體系在偏酸性條件下的藥物累積釋放率更大，主要是因?yàn)樗z具有pH響應(yīng)性，在偏酸性的溶液中溶脹性能大，藥物分子更容易從水凝膠中釋放出來(lái)。

圖7為具體實(shí)施例所制備的石墨烯雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠GDL在pH＝5.4和T＝25℃，T＝37℃條件下所測(cè)的藥物緩釋曲線：(A)EPI；(B)PTX。如圖7A所示，在80h之后，雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠在T＝25℃和T＝37℃分別釋放了75％和85％的表阿霉素EPI。如圖7B所示，在60h之后，雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠在T＝25℃和T＝37℃分別釋放了51％和72％的紫杉醇PTX。水凝膠復(fù)合載藥體系在 37℃條件下的藥物累積釋放率更大，主要是因?yàn)樗z具有溫度響應(yīng)性，其臨界相轉(zhuǎn)變溫度(LCST)在33℃左右，當(dāng)溫度為37℃時(shí)水凝膠處于溶脹狀態(tài)，允許所負(fù)載藥物的快速釋放。

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：

將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的MCF-7細(xì)胞接種于96孔板，利用DMEM高糖完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每孔200μL(細(xì)胞的密度1×10⁴個(gè)/mL)，培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度的載體a.空白石墨烯雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠GDL、b.空白石墨烯GN、c.單載表阿霉素雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠體系EPI@GDL、d.單載紫杉醇的石墨烯體系PTX@GN、e.雙網(wǎng)絡(luò)石墨烯水凝膠雙載藥體系(EPI@PTX@GDL)。載體濃度分別為(1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL)，同時(shí)設(shè)置只加入DMEM高糖完全培養(yǎng)基的MCF-7作為對(duì)照組，未接種細(xì)胞作為空白組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，分別繼續(xù)培養(yǎng)24h，每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL)，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄去孔內(nèi)的培養(yǎng)基，然后每孔加入200μL的二甲基亞砜(DMSO)，置搖床避光低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。利用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值(OD)。將對(duì)照組的細(xì)胞存活率定義為100％，存活率按公式計(jì)算:細(xì)胞存活率＝(試驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×l00％。

圖8為MCF-7細(xì)胞加入樣品后的細(xì)胞毒性圖：a.空白雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠GDL、b.空白石墨烯GN、c.雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠單載表阿霉素體系EPI@GDL、d.石墨烯單載紫杉醇體系PTX@GN、e.雙網(wǎng)絡(luò)石墨烯水凝膠雙載藥體系(EPI@PTX@GDL)。如圖8a和圖8b所示，與對(duì)照組相比，各濃度的空白雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠GDL和空白石墨烯GN載體對(duì)MCF-7的細(xì)胞活性沒(méi)有顯著影響。如圖8c、8d和8e所示，在相同的載體添加濃度為200μg/mL時(shí)，單載藥體系EPI@GDL將MCF-7細(xì)胞活性降低為55％(圖8c)；單載藥體系PTX@GN將MCF-7細(xì)胞活性降低為48％(圖8d)；雙載藥體系EPI@PTX@GDL將MCF-7細(xì)胞活性降低為36％(圖8e)。結(jié)合圖8所示，與單載藥體系EPI@GDL和PTX@GN相比，在1μg/mL-500μg/mL范圍內(nèi)，雙載藥體系EPI@PTX@GDL對(duì)MCF-7細(xì)胞毒性最大。由此證明，同時(shí)負(fù)載EPI和PTX乳腺癌聯(lián)合化療藥物的雙網(wǎng)絡(luò)石墨烯水凝膠是一種有效的抗癌雙載藥體系。而且，在保證與更高劑量EPI和PTX聯(lián)用取得相同療效的前提下，雙網(wǎng)絡(luò)石墨烯水凝膠載藥體系的使用劑量可以減少，從而也降低了藥物的副作用。

細(xì)胞形態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)：

將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的MCF-7細(xì)胞接種于96孔板，每孔200μL(細(xì)胞的密度1×10⁴個(gè)/mL)，培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度的磁性石墨烯載藥體系，同時(shí)設(shè)置只加入DMEM高糖完全培養(yǎng)基的MCF-7細(xì)胞作為對(duì)照組，每組三個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24h后，用移液器每孔棄去100μL的培養(yǎng)基，各孔加入10μg/mL的FDA/PBS溶液100μL，使FDA的終濃度為5μg/mL，孵育10min，在這個(gè)過(guò)程中，F(xiàn)DA進(jìn)入活細(xì)胞膜，10分鐘后棄去孔中的所有液體，各孔再加入PBS緩沖液200μL，在 488nm的激發(fā)下發(fā)出熒光，熒光顯微鏡拍照。

圖9為MCF-7細(xì)胞加入不同濃度載藥體系后的熒光顯微鏡圖片：a.0μg/mL；b.10μg/mL(b-1.EPI@GDL；b-2.PTX@GN；b-3.EPI@PTX@GDL)；c.100μg/mL(c-1.EPI@GDL；c-2.PTX@GN；c-3.EPI@PTX@GDL)；d.500μg/mL(d-1.EPI@GDL；d-2.PTX@GN；d-3.EPI@PTX@GDL)。如圖9a所示，未加入載藥體系，控制組具有最多的活細(xì)胞數(shù)目。如圖9b-1、9b-2、9b-3所示，當(dāng)加入載藥體系濃度為10μg/mL，活細(xì)胞的數(shù)目減少。明顯可以看出在相同添加濃度下，雙網(wǎng)絡(luò)石墨烯水凝膠雙載藥體系EPI@PTX@GDL對(duì)癌細(xì)胞的毒性最強(qiáng)。如圖9c-1、9c-2、9c-3所示，當(dāng)加入載藥體系濃度為100μg/mL，活細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)一步降低。如圖9d-1、9d-2、9d-3所示，當(dāng)加入載藥體系濃度為500μg/mL，活細(xì)胞的數(shù)目?jī)H剩下很少。由此可見(jiàn)，與圖8b的MTT結(jié)果一致，在1μg/mL-500μg/ml范圍內(nèi)，隨著濃度的升高，細(xì)胞活性降低。載藥體系對(duì)于MCF-7腫瘤細(xì)胞的毒性作用大小為：EPI@PTX@GDL>PTX@GN>EPI@GDL。即在1μg/mL-500μg/ml范圍內(nèi)，雙網(wǎng)絡(luò)石墨烯水凝膠雙載藥體系對(duì)MCF-7細(xì)胞存活率影響最大。

綜上所述，所合成的雙網(wǎng)絡(luò)石墨烯水凝膠雙載藥體系表現(xiàn)出對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞較好的抑制作用，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。