本發(fā)明涉及生物制品技術(shù)領(lǐng)域，進(jìn)一步涉復(fù)合型生物制品在抗病毒方面的治療，具體涉及一種用于治療小鵝瘟的生物制品及其制備方法。

背景技術(shù)：

小鵝瘟(Gosling Plague，GP)又稱為鵝細(xì)小病毒感染(Goose Parvovirus Infection)，是由鵝細(xì)小病毒(Goose Parvovirus，GPV)引起的雛鵝急性或亞急性敗血性傳染病。本病主要侵害4～20天的雛鵝和雛番鴨，以急性腸炎及肝、腎、心臟實(shí)質(zhì)臟器病變?yōu)橹饕卣?，具有傳播快、發(fā)病率和致死率高的特點(diǎn)。該病是危害養(yǎng)鵝業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一，每年都有不同程度的流行，造成相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重危害著集約化養(yǎng)鵝業(yè)的持續(xù)、穩(wěn)定、健康發(fā)展。

目前應(yīng)用于小鵝瘟的抗感染藥品主要包括抗生素、化學(xué)合成藥品、中藥制劑、弱毒活疫苗及卵黃抗體等抗病毒感染生物制劑。對(duì)于小鵝瘟病都有一定的療效，但也有一定的弊端。例如，抗生素容易發(fā)生藥物殘留及沉積，可以通過動(dòng)物性食物進(jìn)入人體，導(dǎo)致耐藥性增強(qiáng)，抗生素類藥物不能更好的發(fā)揮作用，引起人類疾病；化學(xué)合成藥品毒副作用大，不利于動(dòng)物的身體健康；中藥制劑藥效慢、用量大、質(zhì)量不易穩(wěn)定，使用起來不方便；卵黃抗體對(duì)于混合感染和繼發(fā)感染的治療作用較弱；活疫苗存在著毒力返強(qiáng)的可能，有潛在的傳染性和致病性，且疫苗存在與母源抗體相互作用的問題，接種時(shí)間及方式等都可能影響最終的免疫效果。抗原抗體復(fù)合物是指由特異性高免血清或抗體按恰當(dāng)?shù)谋壤c相應(yīng)抗原混合而成。這類復(fù)合物兼有預(yù)防及治療的雙重作用。這種復(fù)合物不但能抵抗病原微生物引起的持續(xù)性感染，避免抗生素及中藥制劑的弊端，而且還可以突破母源抗體干擾，并可減少活疫苗引起的強(qiáng)烈應(yīng)激反應(yīng)，還可以與其他疫苗聯(lián)合使用，做到多病共治。有文獻(xiàn)報(bào)道，抗原抗體復(fù)合物制成的疫苗還可以接種于較大日齡的禽類胚中進(jìn)行疾病預(yù)防，可誘導(dǎo)胚體產(chǎn)生較高水平抗體，同時(shí)對(duì)出雛率及胚體的生長(zhǎng)發(fā)育沒有影響，對(duì)不同高低抗體水平母源抗體的雞胚免疫經(jīng)攻毒試驗(yàn)也證明復(fù)合物疫苗非常有效。這給今后的禽類疫病防治提供了新的方法，這種方法相較于傳統(tǒng)常規(guī)疫苗，對(duì)雞的副反應(yīng)更小，可提高免疫的安全性。

針對(duì)抗原抗體復(fù)合物的作用機(jī)理尚不明確，有研究推測(cè)抗原抗體復(fù)合物可同時(shí)激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫，而細(xì)胞免疫在攻毒保護(hù)時(shí)起著重要作用。一般認(rèn)為：①抗原抗體復(fù)合物的作用機(jī)制與復(fù)合物可直接與濾泡樹突狀細(xì)胞結(jié)合的能力有關(guān)。Jeurissen調(diào)查了IBD復(fù)合物疫苗中IBDV在不同靶器官中的感染情況，結(jié)果表明：免疫復(fù)合物進(jìn)入機(jī)體后能與樹突狀細(xì)胞結(jié)合并長(zhǎng)時(shí)間滯留在細(xì)胞表面，樹突狀細(xì)胞不能內(nèi)質(zhì)化復(fù)合物，因而復(fù)合物中的病毒也得到保護(hù)，可以免受淋巴細(xì)胞的攻擊。②由于復(fù)合物中抗體分子的Fc片段與抗原遞呈細(xì)胞的Fc受體有很高的親和性，因而使復(fù)合物中病毒更有效的與抗原遞呈細(xì)胞相結(jié)合，復(fù)合物被吞噬和內(nèi)質(zhì)化后病毒不會(huì)被殺滅，最后激活B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，刺激B淋巴細(xì)胞成為抗體分泌細(xì)胞，從而引起強(qiáng)烈的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫應(yīng)答。雖然抗原抗體復(fù)合物的作用機(jī)理未有確切答案，但多項(xiàng)研究結(jié)果都顯示，抗原抗體以適當(dāng)?shù)谋壤Y(jié)合為抗原抗體復(fù)合物后，能突破母源抗體的干擾，對(duì)免疫雞能提供很好的保護(hù)，免疫效果比常規(guī)疫苗更好。目前此項(xiàng)技術(shù)已成功用于雞傳染性法氏囊病、新城疫及呼腸病毒病疫苗的研制，并取得了很好的效果。

VP3蛋白是小鵝瘟病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，約占總蛋白的80％。VP3蛋白是小鵝瘟病毒主要的免疫保護(hù)性抗原，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生具有中和作用的抗體，利用GPV的VP3基因構(gòu)建基因疫苗免疫雛鵝，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好的細(xì)胞免疫應(yīng)答，VP3基因具有較高的遺傳穩(wěn)定性，國(guó)內(nèi)外的鵝細(xì)小病毒VP3基因也具有較高相似性，這可能是目前小鵝瘟只有一種血清型的分子基礎(chǔ)，為基因工程苗的研制提供了可行性。目前，常規(guī)疫苗主要使用的都是全病毒進(jìn)行試驗(yàn)，存在散毒的危險(xiǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種用于治療小鵝瘟的生物制品及其制備方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)的小鵝瘟治療藥物療效較低的技術(shù)問題。

本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)的小鵝瘟治療藥物安全性較低。

為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種用于治療小鵝瘟的生物制品，所述生物制品中含有小鵝瘟病毒V3蛋白和小鵝瘟病毒卵黃抗體。

作為優(yōu)選，所述生物制品中瓊擴(kuò)效價(jià)為1:32的小鵝瘟病毒VP3蛋白與瓊擴(kuò)效價(jià)為1:32的小鵝瘟病毒卵黃抗體體積比為1:1。

作為優(yōu)選，所述生物制品的劑型為液體制劑、油水混合制劑或凍干固體制劑。

作為優(yōu)選，所述液體制劑是通過以下方法制備的：取配方量的小鵝瘟病毒VP3蛋白及小鵝瘟病毒卵黃抗體加入至PBS緩沖液中，而后無菌過濾。

作為優(yōu)選，所述油水混合制劑是通過以下方法制備的：將含配方量小鵝瘟病毒VP3蛋白和小鵝瘟病毒卵黃抗體的水相與油相佐劑緩慢混合乳化。

作為優(yōu)選，所述凍干固體制劑是通過以下方法制備的：取配方量的小鵝瘟病毒VP3蛋白、小鵝瘟病毒卵黃抗體混合液體加入凍干保護(hù)劑，而后冷凍干燥。

一種上述生物制品的制備方法：包括以下步驟：

1)制備小鵝瘟病毒VP3蛋白抗原溶液。

2)利用小鵝瘟病毒滅活疫苗免疫蛋雞，制備高免卵黃抗體。

3)將步驟1)所得的小鵝瘟病毒VP3蛋白抗原溶液與步驟2)所得的小鵝瘟病毒卵黃抗體混合。

作為優(yōu)選，還包括步驟4)：向步驟3)所得的混合物中加入佐劑。

作為優(yōu)選，步驟1)具體包括以下操作：利用GenBank中的小鵝瘟病毒毒株VP3蛋白表達(dá)基因共保守區(qū)域，設(shè)計(jì)上下游引物，利用小鵝瘟病毒總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，進(jìn)行PCR，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至表達(dá)載體后進(jìn)行VP3蛋白的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化檢測(cè)后即得VP3蛋白抗原溶液。

作為優(yōu)選，步驟2)具體包括以下操作：用小鵝瘟病毒滅活疫苗對(duì)產(chǎn)蛋雞進(jìn)行免疫，每?jī)纱蚊庖咧g間隔14-21天，三免后14天收集高免雞蛋，并進(jìn)行瓊擴(kuò)雙向擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)，瓊擴(kuò)效價(jià)≥1：64的高免蛋加辛酸等進(jìn)行卵黃抗體提取，提取后除菌濃縮即得到所述高免卵黃抗體。

本發(fā)明提供了一種用于治療小鵝瘟的生物制品及其制備方法，該技術(shù)方案基于抗原抗體復(fù)合物對(duì)病毒的良好防治效果而設(shè)計(jì)，并針對(duì)小鵝瘟病毒的自身特性確定以VP3蛋白為抗原、以卵黃抗體為抗體的組合方案，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步設(shè)計(jì)了二者的具體制備方法。該技術(shù)方案在原有小鵝瘟卵黃抗體的基礎(chǔ)上，加入小鵝瘟VP3蛋白抗原，制成復(fù)合物。這種小鵝瘟抗原抗體復(fù)合物可以抵抗病原微生物引起的持續(xù)性感染，避免抗生素的過量使用，突破母源抗體的干擾，減少活疫苗引起的強(qiáng)烈應(yīng)激反應(yīng)，由于使用的抗原不是完整的病毒抗原，而是小鵝瘟的VP3蛋白制成的抗原，可以減少全毒向外散毒的危險(xiǎn)，更加安全可靠有效。本發(fā)明所獲得的抗原抗體復(fù)合物具有安全性好，免疫效果佳，免疫作用產(chǎn)生快，保護(hù)率高的特點(diǎn)。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例6中不同實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血清抗體水平比較。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例7中不同實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)病率、死亡率、保護(hù)率比較。

具體實(shí)施方式

以下將對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述。為了避免過多不必要的細(xì)節(jié)，在以下實(shí)施例中對(duì)屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進(jìn)行詳細(xì)描述。除有定義外，以下實(shí)施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。

實(shí)施例1(小鵝瘟卵黃抗體IgY制備)

(1)高免蛋的制備：利用小鵝瘟滅活疫苗對(duì)產(chǎn)蛋雞進(jìn)行免疫，免疫劑量為1ml/只，免疫間隔為14天，三次免疫后收集雞蛋進(jìn)行卵黃抗體效價(jià)檢測(cè)，瓊擴(kuò)效價(jià)高于1:64可進(jìn)行雞蛋收集。

(2)卵黃抗體IgY的提取制備：將高免蛋浸入1％的新潔爾滅溶液中浸泡消毒15min，晾干備用；采取機(jī)械打蛋，分離并收集卵黃；用膠體磨乳化后，1:4加入醋酸鹽緩沖液(pH5.2)，攪拌60min，用板框過濾器過濾；過濾清液加入2％的辛酸，劇烈攪拌60min，板框過濾；過濾清液用0.22μm微孔過濾除菌即得。

實(shí)施例2(小鵝瘟VP3蛋白抗原制備)

利用基因克隆技術(shù)，將小鵝瘟VP3基因克隆到原核表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)染到原核表達(dá)宿主體內(nèi)，誘導(dǎo)表達(dá)。后用親和層析技術(shù)純化從而獲得VP3蛋白。具體的操作方法為：利用GenBank中小鵝瘟病毒經(jīng)典毒株的VP3共保守片段，使用軟件Premier 5.0設(shè)計(jì)VP3基因上下游引物并合成；取感染小鵝瘟病強(qiáng)毒的雛鵝肝臟組織，研磨勻漿后利用常規(guī)RNA提取技術(shù)提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA；以cDNA為模板，利用VP3基因上下游引物對(duì)VP3基因進(jìn)行擴(kuò)增及回收；回收產(chǎn)物及所使用的表達(dá)載體使用同種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切后連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至表達(dá)載體；篩選陽性克隆進(jìn)行培養(yǎng)、誘導(dǎo)后回收表達(dá)菌體；將菌體進(jìn)行超聲破碎，進(jìn)行親和層析后可獲得。

實(shí)施例3(小鵝瘟VP3蛋白抗原及小鵝瘟卵黃抗體的效價(jià)測(cè)定)

利用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)隊(duì)小鵝瘟VP3蛋白抗原及小鵝瘟卵黃抗體進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。具體操作如下：制備還有8％NaCl及1％瓊脂糖的瓊脂平板；使用梅花孔在瓊脂平板上打孔；

(1)檢測(cè)VP3蛋白抗原效價(jià)：將VP3蛋白抗原倍比稀釋后分別注入梅花孔外周孔，中心孔加入小鵝瘟標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，加樣量以加滿不溢出為度。將瓊脂板放入濕盒，37℃作用24h～48h，中心孔與外周孔出現(xiàn)沉淀線的最大稀釋倍數(shù)為VP3蛋白的抗原效價(jià)。

(2)檢測(cè)卵黃抗體效價(jià)：將卵黃抗體倍比稀釋后分別注入梅花孔外周孔，中心孔加入小鵝瘟標(biāo)準(zhǔn)瓊擴(kuò)抗原，加樣量以加滿不溢出為度。將瓊脂板放入濕盒，37℃作用24h～48h，中心孔與外周孔出現(xiàn)沉淀線的最大稀釋倍數(shù)為小鵝瘟卵黃抗體的效價(jià)。

實(shí)施例4(制備小鵝瘟卵黃抗體與小鵝瘟VP3蛋白抗原結(jié)合比例不同的三種抗原抗體復(fù)合物)

(1)配制小鵝瘟病毒VP3蛋白抗原效價(jià)為1:16；1:128；1:32三種濃度

(2)配制小鵝瘟卵黃抗體效價(jià)為1:128；1:16；1:32三種濃度

(3)將上述(1)(2)兩種物質(zhì)按所給出順序等體積混合

(4)混合產(chǎn)物做無菌處理后可得復(fù)合物一、復(fù)合物二、復(fù)合物三

實(shí)施例5(制備油水混合制劑型抗原抗體復(fù)合物)

將處方量的抗原抗體復(fù)合物加入油佐劑中進(jìn)行乳化，即可得到抗原抗體復(fù)合物的油水混合制劑型。

實(shí)施例6(對(duì)鵝進(jìn)行免疫試驗(yàn))

取1日齡易感雛鵝60羽，隨機(jī)分為6組，適應(yīng)飼養(yǎng)一天后進(jìn)行如下操作：

第一組：設(shè)為空白對(duì)照組，每羽肌注0.2ml生理鹽水；

第二組：設(shè)為復(fù)合物一組，每羽肌注0.2ml復(fù)合物一；

第三組：設(shè)為復(fù)合物二組，每羽肌注0.2ml復(fù)合物二；

第四組：設(shè)為復(fù)合物三組，每羽肌注0.2ml復(fù)合物三；

第五組：設(shè)為常規(guī)小鵝瘟疫苗組，每羽肌注處方劑量的常規(guī)小鵝瘟滅活疫苗；

第六組：設(shè)為VP3疫苗組，每羽肌注0.2ml瓊擴(kuò)效價(jià)為AGP＝1：32的VP3蛋白疫苗。

上述免疫之后14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，每隔一周進(jìn)行雞只采血，檢測(cè)血清中抗體水平(見圖1)，注射抗原抗體復(fù)合物的雞只，產(chǎn)生免疫應(yīng)答的時(shí)間都要短于常規(guī)疫苗和VP3疫苗組，抗原抗體復(fù)合物三的是各組中血清抗體效價(jià)上升最快的，能夠產(chǎn)生抗體的水平也是各組中最高的；抗原抗體復(fù)合物一和復(fù)合物二與常規(guī)疫苗組在抗體效價(jià)達(dá)到穩(wěn)定時(shí)，效價(jià)水平?jīng)]有明顯差異。

實(shí)施例7(攻毒試驗(yàn))

取4日齡SPF雞60羽，隨機(jī)分3組，適應(yīng)飼養(yǎng)一日后，分別進(jìn)行如下操作：

第一組：設(shè)為空白對(duì)照組，每羽肌注1ml生理鹽水；

第二組：設(shè)為常規(guī)疫苗組，每羽肌注處方量的常規(guī)小鵝瘟滅活疫苗；

第三組：設(shè)為抗原抗體復(fù)合物組，每羽肌注1ml抗原抗體復(fù)合物三。

各組免疫7天后，利用小鵝瘟強(qiáng)毒SD-36株(200ELD50)進(jìn)行點(diǎn)眼，14天后各組按原有劑量加強(qiáng)免疫1次。統(tǒng)計(jì)各組中小鵝瘟發(fā)病率、死亡率及保護(hù)率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明：空白對(duì)照組雞只死亡率為100％，抗原抗體復(fù)合物組死亡率最低，保護(hù)率可達(dá)到95％。

以上對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請(qǐng)范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。