本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體的說是涉及一種A群C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗的制備方法。

背景技術(shù)：

流行性腦脊髓膜炎(簡稱流腦，下同)是一種由奈瑟氏腦膜炎球菌(Neisseriameningitidis)引起的急性呼吸道傳染病。一百多年來，一直在世界各地流行或散在發(fā)生，感染病原菌后可引起敗血癥、腦膜炎。易感人群主要為兒童，以暴發(fā)型病死率最高，可達(dá)40%～60%。當(dāng)今世界各大洲發(fā)病率在1/10萬～10/10萬，總病死率在5%～15%，高達(dá)20%的腦膜炎患者會(huì)有神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，包括智力受損和耳聾等。根據(jù)莢膜多糖型別進(jìn)行血清學(xué)分類可分13個(gè)血清型，其中A群、B群、C群約占流行菌群的90%。A群腦膜炎球菌是較大流行的主要致病血清群，特別是在所謂的非洲“流腦流行帶”，每隔7-14年就會(huì)出現(xiàn)一次較大流行。

我國于1938年、1949年、1959年、1967年和1977年曾發(fā)生過5次全國性流腦流行；其中以1967年春季流行最為嚴(yán)重，發(fā)病率高達(dá)403/10萬，病死率為5.49%。我國過去90%以上的病例是A群病菌致病，現(xiàn)在B群或C群病菌有時(shí)亦引起流腦暴發(fā)。2003年開始，C群流腦的發(fā)病率明顯上升。目前A群和C群共占所有血清群的50%以上，且C群仍有進(jìn)一步增高的趨勢。因此，目前我國預(yù)防流腦工作的重點(diǎn)是以預(yù)防A 群和C 群為主。

莢膜多糖是大分子物質(zhì)，分離純化比單糖或小分子寡糖復(fù)雜。在莢膜多糖的分離純化中，需去除核酸、蛋白質(zhì)、內(nèi)毒素等雜質(zhì)。目前國內(nèi)上市的A群C群腦膜炎球菌莢膜多糖都是按照傳統(tǒng)方法制備而成。即首先采用液體發(fā)酵的方法制備細(xì)菌培養(yǎng)物，然后將殺菌后的培養(yǎng)液利用離心法去除菌體。再用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）與多糖形成復(fù)合物，再進(jìn)行純化處理，由于成本較高，純化處理主要采用苯酚抽提，因此苯酚抽提成為了生產(chǎn)規(guī)模純化莢膜多糖的主要方法。但是苯酚抽提法，需要使用大量的苯酚，對人體和環(huán)境的危害很大，而且最終的多糖制品中含有少量的苯酚殘留物。

另外，A群多糖疫苗對2歲以下兒童的免疫原性差，保護(hù)期短，C群多糖疫苗對2歲以下兒童不產(chǎn)生免疫性。因此，世界衛(wèi)生組織不推薦A群C群流腦多糖疫苗用于嬰幼兒的常規(guī)免疫接種。流腦多糖在較大兒童和成年人中能誘發(fā)很高的殺菌抗體，但對18月齡以下嬰幼兒不能誘生有效殺菌抗體，也不能誘發(fā)免疫記憶；其原因是多糖屬T細(xì)胞非依賴性抗原，在免疫系統(tǒng)機(jī)能發(fā)育尚不完善的2歲以下嬰幼兒中，多糖類抗原不能刺激機(jī)體產(chǎn)生有效抗體，所以多糖疫苗對這一高危人群不能起到有效保護(hù)作用。 為了改變多糖的非T細(xì)胞依賴性，人們將多糖共價(jià)偶聯(lián)到一種蛋白載體上，使之轉(zhuǎn)變?yōu)門細(xì)胞依賴性抗原，從而解決了在2歲以下嬰幼兒免疫原性差的問題。這種新一代結(jié)合疫苗不僅在任何年齡段人群中均可誘生出高濃度的以IgG為主的保護(hù)性抗體，并可產(chǎn)生明顯的免疫回憶反應(yīng)。目前市售的流腦多糖結(jié)合疫苗包括，C群流腦多糖結(jié)合疫苗，A群C群流腦多糖結(jié)合疫苗。

目前，國產(chǎn)的所有已經(jīng)上市的結(jié)合疫苗（如b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗、A群C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗）全部采用同一種化學(xué)結(jié)合方法制備而成，即用溴化氰（CNBr）活化多糖的鄰位羥基，活化后的多糖與己二酰肼（ADH）反應(yīng)生成多糖-ADH衍生物。然后在碳二亞胺（EDAC）的催化作用下，多糖-ADH衍生物與載體蛋白共價(jià)結(jié)合。該工藝有個(gè)很大的缺點(diǎn)是在多糖的活化過程中會(huì)使用到溴化氰。溴化氰為極毒而且性質(zhì)活潑的物質(zhì)，受熱、遇水放出劇毒氣體如氰化氫和氰化氫，遇酸易引起爆炸。隨著對環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，以及對工人工作環(huán)境狀況的重視，人們一直在尋找合適的方法來避免在疫苗制造過程中使用象溴化氰這樣劇毒的化學(xué)試劑。使用現(xiàn)代的技術(shù)對傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝進(jìn)行改進(jìn)以減少或棄用有毒化學(xué)試劑對于保護(hù)人類健康以及減少環(huán)境污染都具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種更安全有效的A群C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗的制備方法，該方法有效的避免了避免純化過程對苯酚的使用，以及制備衍生物過程對溴化氰的使用，以使得整個(gè)制備過程無毒傷害，能夠減少環(huán)境污染，對環(huán)境起到一定的保護(hù)作用。

為解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種A群C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗的制備方法，包括以下步驟：

（1）將腦膜炎球菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)并進(jìn)行殺菌處理，得到已殺菌的培養(yǎng)液；

（2）腦膜炎球菌莢膜多糖制備

將已殺菌的培養(yǎng)液離心收集上清，再加入十六烷基三甲基溴化銨至終濃度1.0g/L，充分?jǐn)嚢韬箪o置過夜，離心收集多糖沉淀物，再用氯化鈣溶液將多糖沉淀物充分?jǐn)嚢?-5小時(shí)至多糖和CTAB解離后離心收集上清液Ⅰ，在上清液Ⅰ中加入乙醇至終濃度25%v/v，在2-8℃下靜置過夜；再次離心收集上清液Ⅱ，在上清液Ⅱ加入乙醇至終濃度75%v/v，振搖使多糖沉淀下來靜置18小時(shí)以上，離心收集沉淀，再將沉淀洗凈干燥后即得粗制多糖；

（3）將粗制多糖溶解于緩沖液A中，粗制多糖的溶解濃度為5～10mg/ml，溶解后的粗制多糖經(jīng)澄清過濾后，上樣于用緩沖液預(yù)先平衡好的DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱，收集未吸附的流穿峰，然后上樣于以緩沖液B預(yù)先平衡好的Capto Adhere層析柱，以緩沖液B作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，收集含有多糖的目標(biāo)峰，再將收集的多糖溶液以注射用水為超濾液，用超濾膜包進(jìn)行脫鹽，脫鹽后的溶液即為A群C群腦膜炎球菌多糖溶液，其中緩沖液A為20mM Tris-HCl，0.5%脫氧膽酸鈉，pH 8.0；緩沖液B為20mM Tris-HCl，pH 8.0；

（4）將5mg/mL的A群C群腦膜炎球菌多糖溶液，在攪拌下加入CDAP，其中A群C群腦膜炎球菌多糖和CDAP的質(zhì)量比為1:0.5-1.5，并調(diào)混合溶液的pH值范圍為9.0-11.0，靜置10-40min后加入ADH反應(yīng)15min得到反應(yīng)物溶液，其中A群C群腦膜炎球菌多糖和ADH的質(zhì)量比為1:3.5，將反應(yīng)物溶液透析后得A群C群腦膜炎球菌多糖-ADH衍生物；

（5）將A群C群腦膜炎球菌多糖-ADH衍生物和破傷風(fēng)類毒素按質(zhì)量比為1:1混合，調(diào)pH值范圍為5.5-5.7，加入EDAC，并于2-8℃攪拌反應(yīng)5-6h后，再進(jìn)行透析得反應(yīng)物，再將反應(yīng)物用層析法進(jìn)行純化，收集外水體積洗脫組份，除菌過濾后得原液；

（6）在原液中加入0.2mol/L氯化鈉溶液并補(bǔ)加蒸餾水調(diào)整混合液的濃度符合注射劑量，再加入凍干保護(hù)劑即得A群C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗。

步驟（1）具體為在流腦半綜合培養(yǎng)基上進(jìn)行腦膜炎球菌種接種，溫度35～37℃，培養(yǎng)16～24小時(shí)，經(jīng)過三代擴(kuò)增培養(yǎng)后接種至種子罐培養(yǎng)，溫度35～37℃，培養(yǎng)4～6小時(shí)制備數(shù)量適宜的生產(chǎn)用種子，然后將種子罐培養(yǎng)物接種至500L發(fā)酵罐培養(yǎng)，溫度35～37℃，培養(yǎng)時(shí)間6～12小時(shí)后加入甲醛殺菌。

步驟（3）中粗制多糖的溶解濃度為6～8mg/ml 。

步驟（3）中溶解后的粗制多糖需經(jīng)0.45μm濾膜進(jìn)行澄清過濾。

步驟（3）中超濾膜包的截留分子量為300KD。

步驟（4）中A群C群腦膜炎球菌多糖和CDAP的質(zhì)量比為1:0.5。

步驟（4）加入CDAP后調(diào)整混合溶液的pH值范圍為11.0±0.2。

步驟（4）加入CDAP后靜置時(shí)間為25-30min

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明A群C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗的制備方法，該方法有效的避免了避免純化過程對苯酚的使用，以及制備衍生物過程對溴化氰的使用，以使得整個(gè)制備過程無毒傷害，能夠減少環(huán)境污染，對環(huán)境起到一定的保護(hù)作用。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。本發(fā)明的實(shí)施方式包括但不限于下列實(shí)施例。

以下實(shí)施例中的所有產(chǎn)品均為市售產(chǎn)品。

實(shí)施例1

A群腦膜炎球菌多糖制備

開啟A群腦膜炎球菌工作種子批菌種1只，接種至2支流腦半綜合培養(yǎng)基試管，溫度35～37℃，培養(yǎng)16～24小時(shí)，為第一代菌種。將每1支第一代菌種傳種于2瓶流腦半綜合培養(yǎng)基，溫度35～37℃培養(yǎng)16～24小時(shí)，為第二代菌種。將每1瓶第二代菌種傳種于6瓶流腦半綜合培養(yǎng)基，溫度35～37℃培養(yǎng)16～24小時(shí)，為第三代菌種。將三代菌種采集到500ml生理鹽水溶液中混勻，接種于50L種子罐，溫度35～37℃，培養(yǎng)時(shí)間4小時(shí)。然后將50L種子罐培養(yǎng)物接種至500L發(fā)酵罐培養(yǎng)，溫度35～37℃，培養(yǎng)時(shí)間8小時(shí)后加入終濃度為1%（v/v）的甲醛溶液殺菌。

將已殺菌的培養(yǎng)液離心收集上清。然后加入十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）至終濃度1.0g/L，充分?jǐn)嚢韬箪o置過夜，離心收集多糖沉淀物。多糖沉淀物用氯化鈣溶液攪拌3小時(shí)使多糖和CTAB解離。離心收集上清液Ⅰ，上清液Ⅰ加入乙醇至終濃度為25%（v/v），2～8℃靜置過夜，離心收集上清液Ⅱ，上清液Ⅱ加入乙醇至終濃度為75%（v/v），充分振搖使多糖沉淀，靜置18小時(shí)以上，離心收集沉淀，然后用無水乙醇和丙酮各洗三次，干燥后即為粗制多糖。

將粗糖溶解于緩沖液（20mM Tris-HCl，0.5%脫氧膽酸鈉，pH 8.0）中，溶解濃度為5mg/ml。溶解后的樣品經(jīng)0.45μm濾膜澄清過濾后，上樣于用緩沖液（20mM Tris-HCl，0.5%脫氧膽酸鈉，pH 8.0）預(yù)先平衡好的DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱，收集未吸附的流穿峰，然后上樣于以緩沖液（20mM Tris-HCl，pH 8.0）預(yù)先平衡好的Capto Adhere層析柱，以20mM Tris-HCl，pH 8.0緩沖液作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，收集含有多糖的目標(biāo)峰。然后將收集的多糖溶液以注射用水為超濾液，用截留分子量為300KD的超濾膜包進(jìn)行脫鹽。脫鹽后的溶液即為A群C群腦膜炎球菌多糖溶液，取樣檢測質(zhì)量指標(biāo)。由下表可見，制得的三批C群多糖的各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)均符合藥典要求。

將A群流腦多糖配制溶液，然后在攪拌下加入CDAP，其中A群流腦多糖和CDAP的質(zhì)量比為1:0.5，并調(diào)混合溶液的pH值范圍為11.0±0.2，靜置25-30min后加入ADH反應(yīng)15min得到反應(yīng)物溶液，其中A群流腦多糖和ADH的質(zhì)量比為1:3.5，將反應(yīng)物溶液透析后得A群流腦多糖-ADH衍生物；

將A群流腦多糖-ADH衍生物和破傷風(fēng)類毒素按質(zhì)量比為1:1混合，調(diào)pH值范圍為5.5-5.7，加入EDAC，并于2-8℃攪拌反應(yīng)5-6h后，再進(jìn)行透析得反應(yīng)物，再將反應(yīng)物用層析法進(jìn)行純化，收集外水體積洗脫組份，除菌過濾后得原液；

在原液中加入0.2mol/L氯化鈉溶液并補(bǔ)加蒸餾水調(diào)整混合液的濃度符合注射劑量，再加入凍干保護(hù)劑即得A群腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗。

實(shí)施例2

開啟C群腦膜炎球菌工作種子批菌種1只，接種至2支流腦半綜合培養(yǎng)基試管，溫度35～37℃，培養(yǎng)16～24小時(shí)，為第一代菌種。將每1支第一代菌種傳種于2瓶流腦半綜合培養(yǎng)基，溫度35～37℃培養(yǎng)16～24小時(shí)，為第二代菌種。將每1瓶第二代菌種傳種于6瓶流腦半綜合培養(yǎng)基，溫度35～37℃培養(yǎng)16～24小時(shí)，為第三代菌種。將三代菌種采集到500ml生理鹽水溶液中混勻，接種于50L種子罐，溫度35～37℃，培養(yǎng)時(shí)間4小時(shí)。然后將50L種子罐培養(yǎng)物接種至500L發(fā)酵罐培養(yǎng)，溫度35～37℃，培養(yǎng)時(shí)間8小時(shí)后加入終濃度為1%（v/v）的甲醛溶液殺菌。

將已殺菌的培養(yǎng)液離心收集上清。然后加入十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）至終濃度1.0g/L，充分?jǐn)嚢韬箪o置過夜，離心收集多糖沉淀物。多糖沉淀物用氯化鈣溶液攪拌3小時(shí)使多糖和CTAB解離。離心收集上清液Ⅰ，上清液Ⅰ加入乙醇至終濃度為25%（v/v），2～8℃靜置過夜，離心收集上清液Ⅱ，上清液Ⅱ加入乙醇至終濃度為75%（v/v），充分振搖使多糖沉淀，靜置18小時(shí)以上，離心收集沉淀，然后用無水乙醇和丙酮各洗三次，干燥后即為粗制多糖。

將粗糖溶解于緩沖液（20mM Tris-HCl，0.5%脫氧膽酸鈉，pH 8.0）中，溶解濃度為5mg/ml。溶解后的樣品經(jīng)0.45μm濾膜澄清過濾后，上樣于用緩沖液（20mM Tris-HCl，0.5%脫氧膽酸鈉，pH 8.0）預(yù)先平衡好的DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱，收集未吸附的流穿峰，然后上樣于以緩沖液（20mM Tris-HCl，pH 8.0）預(yù)先平衡好的Capto Adhere層析柱，以20mM Tris-HCl，pH 8.0緩沖液作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，收集含有多糖的目標(biāo)峰。然后將收集的多糖溶液以注射用水為超濾液，用截留分子量為300KD的超濾膜包進(jìn)行脫鹽。脫鹽后的溶液即為A群C群腦膜炎球菌多糖溶液，取樣檢測質(zhì)量指標(biāo)。由下表可見，制得的三批C群多糖的各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)均符合藥典要求。

將C群流腦多糖配制成5mg/mL的溶液，然后在攪拌下加入CDAP，其中C群流腦多糖和CDAP的質(zhì)量比為1:1.0-1.5，并調(diào)混合溶液的pH值范圍為9.0-10.0，靜置10-40min后加入ADH反應(yīng)15min得到反應(yīng)物溶液，其中C群流腦多糖和ADH的質(zhì)量比為1:3.5，將反應(yīng)物溶液透析后得C群流腦多糖-ADH衍生物；

將C群流腦多糖-ADH衍生物和破傷風(fēng)類毒素按質(zhì)量比為1:1混合，調(diào)pH值范圍為5.5-5.7，加入EDAC，并于2-8℃攪拌反應(yīng)5-6h后，再進(jìn)行透析得反應(yīng)物，再將反應(yīng)物用層析法進(jìn)行純化，收集外水體積洗脫組份，除菌過濾后得原液；

在原液中加入0.2mol/L氯化鈉溶液并補(bǔ)加蒸餾水調(diào)整混合液的濃度符合注射劑量，再加入凍干保護(hù)劑即得C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗。

按照上述的實(shí)施例，即可很好的完成本發(fā)明。

如上所述即為本發(fā)明的實(shí)施例。本發(fā)明不局限于上述實(shí)施方式，任何人應(yīng)該得知在本發(fā)明的啟示下做出的結(jié)構(gòu)變化，凡是與本發(fā)明具有相同或相近的技術(shù)方案，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。