本發(fā)明屬于疫苗制備領(lǐng)域，具體涉及一種雞包涵體肝炎滅活疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
：雞包涵體肝炎特征為病雞死亡突然增多，嚴(yán)重貧血、黃疸，肝腫大，有出血和壞死灶，心包積液。本病多發(fā)于4-10周齡的雞，5周齡雞最易感，產(chǎn)蛋雞則很少發(fā)病，肉雞多發(fā)。該病的致病原屬于禽腺病毒I群，有12個(gè)血清型，1951年美國(guó)首次報(bào)道該病，隨著我國(guó)雞養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，近年來(lái)該病在我國(guó)肉雞養(yǎng)殖區(qū)呈局部流行趨勢(shì)，通過(guò)對(duì)萬(wàn)方和維普數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，近2年該病以血清4型流行為主。該病目前無(wú)疫苗預(yù)防，肉雞臨床發(fā)生包涵體肝炎時(shí)常見(jiàn)的抗病毒和抗菌治療效果不佳，治愈率低于40％，耐過(guò)雞發(fā)育受阻，與正常肉雞比較，料肉比高7-13％，出欄時(shí)間延長(zhǎng)7-12天，發(fā)育不整齊，嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決現(xiàn)有雞包涵體肝炎無(wú)法用疫苗預(yù)防的問(wèn)題，本發(fā)明提出一種雞包涵體肝炎病毒，該病毒與轉(zhuǎn)移因子制備成疫苗能夠有效防控該病毒引起的疾病。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種雞包涵體肝炎病毒，所述病毒為禽腺病毒I群血清4型病毒，命名為SDJ15-8，其保藏號(hào)為CCTCCNO:V201636，保藏于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，由本公司于2014年3月從山東濟(jì)南市章丘市辛寨鎮(zhèn)大高村肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)雞包涵體肝炎的27日齡AA肉雞肝臟中分離鑒定，命名為SDJ15-8，基因序列在Genbank注冊(cè)號(hào)為KU589231。雞包涵體肝炎病毒株第7代含毒SPF雞胚尿囊液(E7)，能被雞包涵體肝炎病毒血清4型抗體中和。雞包涵體肝炎病毒在制備雞包涵體肝炎滅活疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種雞包涵體肝炎滅活疫苗，包括抗原和轉(zhuǎn)移因子佐劑，所述抗原為滅活的權(quán)利要求1所述的雞包涵體肝炎病毒。進(jìn)一步，所述雞包涵體肝炎病毒是被甲醛滅活的。本發(fā)明的在一個(gè)目的是提供一種雞包涵體肝炎滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟：1)接種：將權(quán)利要求1所述的雞包涵體肝炎病毒用滅菌生理鹽水稀釋后經(jīng)卵黃囊接種于SPF雞胚，37℃進(jìn)行靜置孵化，收集48～120小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚，收獲尿囊液和胚體，其中胚體搗碎用生理鹽水稀釋得到胚體液；2)滅活：將檢驗(yàn)合格的尿囊液與胚體液均按體積2:1混勻得到混合雞胚液，用滅活劑進(jìn)行滅活處理，并對(duì)滅活后的進(jìn)行檢驗(yàn)；3)疫苗制備：將步驟2)檢驗(yàn)合格的滅活混合雞胚液與轉(zhuǎn)移因子進(jìn)行混合，再加入滅菌生理鹽水即可。進(jìn)一步，步驟2)中所述滅活劑為甲醛，向混合雞胚液加入甲醛至其甲醛總濃度為0.2wt％,密閉后置37℃滅活24小時(shí),離心，棄去沉淀物，收集上清液。進(jìn)一步，還包括分裝：定量分裝，加蓋密封，2～8℃保存。種毒免疫原性檢驗(yàn)1、雞包涵體肝炎滅活疫苗制備E7含毒尿囊液96.0ml，加入終濃度為0.2％的甲醛，37℃滅活24小時(shí)，期間振搖4～6次。2、雞包涵體肝炎滅活疫苗無(wú)菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)獸藥典》檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。3、雞包涵體肝炎滅活疫苗安全檢驗(yàn)疫苗皮下或肌肉注射4～5周齡SPF雞10只，2.0ml/每只。飼養(yǎng)觀察14日，應(yīng)不出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部和全身不良反應(yīng)。4、免疫接種5日齡白羽肉雞雛20只，分為2組，每組10只。第一組頸背部皮下注射雞包涵體肝炎滅活疫苗0.3ml；第二組為對(duì)照組，不做任何處理，兩組雞雛隔離飼養(yǎng)。在第一組免疫后15日，上述2組雞雛用100LD50的雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株攻毒，觀察10日，統(tǒng)計(jì)各組雞雛發(fā)病死亡情況(雞發(fā)病標(biāo)準(zhǔn)參照《獸醫(yī)傳染病學(xué)》，第五版中369頁(yè)的【臨診癥狀及病理變化】)。6、結(jié)果第一組雞雛在攻毒后6天有2只表現(xiàn)出臨床發(fā)病癥狀，其余8只健活，整組雞雛無(wú)死亡；第二組雞雛在攻毒后2-3天表現(xiàn)出臨床發(fā)病癥狀，死亡7只。結(jié)果說(shuō)明雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株免疫原性良好。本發(fā)明制備的雞包涵體肝炎病毒滅活疫苗在使用時(shí)對(duì)肉雞雛和肉種雞基本無(wú)應(yīng)激導(dǎo)致的采食下降和精神萎靡等副反應(yīng)，與蜂膠、油佐劑疫苗比較具有更好的安全性。用于預(yù)防血清4型的雞包涵體肝炎病毒有效率90％以上，預(yù)防保護(hù)期長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月。無(wú)母源抗體的商品肉雞在5-8日齡時(shí)頸部皮下注射免疫0.3-0.5ml，可從16-18日齡開(kāi)始保護(hù)至出欄上市；肉種雞在5-8日齡進(jìn)行基礎(chǔ)免疫，在開(kāi)產(chǎn)前15日進(jìn)行加強(qiáng)免疫0.8-1.0ml，所產(chǎn)種蛋孵化的雞雛具有雞包涵體肝炎病毒血清4型母源抗體，保護(hù)期至少15日，結(jié)合肉雞在5-8日齡時(shí)免疫，可使商品肉雞在整個(gè)生長(zhǎng)周期內(nèi)(45天左右)獲得對(duì)雞包涵體肝炎病毒血清4型的堅(jiān)強(qiáng)保護(hù)。疫苗中作為免疫佐劑的轉(zhuǎn)移因子有非特異性增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，使肉雞發(fā)育整齊、抗病力強(qiáng)，大腸桿菌等細(xì)菌性疾病感染率明顯下降，提高養(yǎng)殖收益和減少抗生素用量，是生產(chǎn)綠色食品的好幫手。具體實(shí)施方式實(shí)施例11、抗原制備1.1接種將種毒用滅菌生理鹽水作15000倍稀釋?zhuān)?jīng)卵黃囊接種7日齡SPF雞胚，每胚0.1ml，用蠟封孔，于37℃靜置孵化。1.2孵育和觀察棄去48小時(shí)前死亡的雞胚，以后每隔6小時(shí)照蛋1次，收集48～120小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚，于2～8℃冷藏12～24小時(shí)。1.3收獲雞胚用碘酊消毒蛋殼表面氣室部，無(wú)菌操作除去氣室部蛋殼，收獲尿囊液和胚體。其中，尿囊液置于滅菌的500ml玻璃瓶?jī)?nèi)，裝量為450ml/瓶，標(biāo)記為雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株E8，置-20℃及以下溫度保存；胚體用組織搗碎機(jī)搗碎，按質(zhì)量體積比用生理鹽水1:1稀釋?zhuān)?℃和-20℃反復(fù)凍融2次，于4℃條件下12000rpm離心30分鐘，收集上清，過(guò)濾除菌，分裝，標(biāo)記為雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株胚毒。將雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株E8和雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株胚毒以瓶為單位，按現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)獸藥典》附錄檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。將無(wú)菌檢驗(yàn)合格的雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株E8和胚毒按體積2:1混合、搖勻，即為抗原?？乖訖z測(cè)雞包涵體肝炎病毒含量為10-6.75ELD50/0.1ml。2抗原滅活將抗原加入終濃度為0.2wt％甲醛溶液(含36～40wt％甲醛)，密閉后置37℃滅活24小時(shí)(其間4～6小時(shí)振搖1次，每次3分鐘)后，經(jīng)4000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，棄去沉淀物，收集上清液，4℃保存。3抗原滅活檢驗(yàn)3.1無(wú)菌檢驗(yàn)無(wú)菌操作取3.2中上清液，按現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)獸藥典》檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。3.2滅活檢驗(yàn)無(wú)菌操作取3.2中無(wú)菌檢驗(yàn)合格上清液，經(jīng)卵黃囊接種7日齡SPF雞胚5枚，每胚0.1ml，用蠟封孔，37℃靜置孵化，觀察至168小時(shí)，SPF雞胚應(yīng)全部健活，胚體無(wú)雞包涵體肝炎感染導(dǎo)致的典型病變。4疫苗的制備4.1疫苗1取滅活檢驗(yàn)合格的抗原200ml，加入轉(zhuǎn)移因子(多肽含量16.4mg/ml)并補(bǔ)充注射用水，使多肽終濃度為1mg/ml、抗原含量為10-5.0ELD50/0.1ml，分裝，-4℃保存。4.2疫苗2取滅活檢驗(yàn)合格的抗原200ml，加入轉(zhuǎn)移因子(多肽含量16.4mg/ml)并補(bǔ)充注射用水，使多肽終濃度為2mg/ml、抗原含量為10-5.0ELD50/0.1ml，分裝，-4℃保存。4.3疫苗3取滅活檢驗(yàn)合格的抗原200ml，加入轉(zhuǎn)移因子(多肽含量16.4mg/ml)并補(bǔ)充注射用水，使多肽終濃度為1mg/ml、抗原含量為10-6.0ELD50/0.1ml，分裝，-4℃保存。4.4疫苗4取滅活檢驗(yàn)合格的抗原200ml，加入轉(zhuǎn)移因子(多肽含量16.4mg/ml)并補(bǔ)充注射用水，使多肽終濃度為2mg/ml、抗原含量為10-6.0ELD50/0.1ml，分裝，-4℃保存。4.5疫苗5取滅活檢驗(yàn)合格的抗原200ml，加入轉(zhuǎn)移因子(多肽含量16.4mg/ml)，使多肽終濃度為1mg/ml，分裝，-4℃保存。4.6疫苗6取滅活檢驗(yàn)合格的抗原200ml，加入轉(zhuǎn)移因子(多肽含量16.4mg/ml)，使多肽終濃度為2mg/ml，分裝，-4℃保存。5疫苗檢驗(yàn)5.1無(wú)菌檢驗(yàn)取4中的疫苗1-6，按按現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)獸藥典》檢驗(yàn)，均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。5.2安全性檢驗(yàn)取4中的疫苗1-6，分別皮下或肌肉注射4～5周齡SPF雞10只，2.0ml/只。隔離飼養(yǎng)，觀察14日，未出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部和全身不良反應(yīng)。實(shí)施例21、5日齡雛雞試驗(yàn)1.1方法5日齡AA肉雞雛140只，分為7組，每組20只，1-6組分別經(jīng)肌肉注射雞包涵體肝炎轉(zhuǎn)移因子佐劑滅活疫苗1-6，0.3ml/只，7組為對(duì)照組，不做任何處理。在免疫后15天，對(duì)1-7組所有雞雛肌肉注射接種雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株100LD50/只，接種病毒后觀察10天，統(tǒng)計(jì)各組雞雛發(fā)病及死亡情況。1.2結(jié)果當(dāng)疫苗滅活前抗原的病毒含量≥10-6.0ELD50/0.1ml、多肽含量2mg/ml時(shí)，可100％保護(hù)雞雛，具體結(jié)果見(jiàn)表1。表1各組雞雛發(fā)病率與保護(hù)率分組1234567發(fā)病率％1555000100死亡率％00000080保護(hù)率％859595100100100028日齡雛雞試驗(yàn)2.1方法8日齡AA肉雞雛140只，分為7組，每組20只，1-6組分別經(jīng)肌肉注射雞包涵體肝炎轉(zhuǎn)移因子佐劑滅活疫苗1-6，0.5ml/只，7組為對(duì)照組，不做任何處理。在免疫后15天，對(duì)1-7組所有雞雛肌肉注射接種雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株100LD50/只，接種病毒后觀察10天，統(tǒng)計(jì)各組雞雛發(fā)病及死亡情況。2.2結(jié)果當(dāng)疫苗滅活前抗原的病毒含量≥10-5.0ELD50/0.1ml、多肽含量2mg/ml時(shí)，可100％保護(hù)雞雛，結(jié)果見(jiàn)表2。表2各組雞雛發(fā)病率與保護(hù)率分組1234567發(fā)病率％1000000100死亡率％00000070保護(hù)率％9010010010010010003討論對(duì)5日齡和8日齡雞雛的預(yù)防保護(hù)試驗(yàn)表明：雞包涵體肝炎病毒轉(zhuǎn)移因子佐劑滅活疫苗的預(yù)防保護(hù)率與免疫接種劑量、抗原滅活前的病毒含量和轉(zhuǎn)移因子含量有關(guān)。在抗原滅活前的病毒含量相同條件下，轉(zhuǎn)移因子含量增加對(duì)提高疫苗保護(hù)率有明顯作用。疫苗以抗原含量≥10-6.0ELD50/0.1ml、多肽含量2mg/ml(疫苗4)為佳，可100％保護(hù)強(qiáng)毒攻擊。雞包涵體肝炎病毒滅活疫苗分裝按4.4制備疫苗，即為雞包涵體肝炎病毒滅活疫苗，分裝，裝量250ml/瓶，于2-8℃保存。無(wú)菌檢驗(yàn)和安全性檢驗(yàn)合格。實(shí)施例3雞包涵體肝炎病毒滅活疫苗免疫不同日齡雞雛后產(chǎn)生保護(hù)性抗體最早時(shí)間試驗(yàn)15日齡雛雞試驗(yàn)1.1方法5日齡AA肉雞雛120只，分為12組，每組10只，1-6組分別經(jīng)肌肉注射免疫雞包涵體肝炎病毒血清4型轉(zhuǎn)移因子佐劑滅活疫苗0.3ml/只，7-12組為對(duì)照組，不做任何處理。在免疫后8、9、10、11、12、13天時(shí)，分別對(duì)1和7組、2和8組、3和9組、4和10組、5和11組、6和12組的所有雞雛肌肉注射接種雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株100LD50/只。上述各組接種病毒后觀察10天，統(tǒng)計(jì)各組雞雛發(fā)病及死亡情況。1.2結(jié)果各攻毒對(duì)照組發(fā)病率100％、死亡率＞70％，免疫疫苗組100％保護(hù)是在免疫后11天，說(shuō)明5日齡雞雛免疫疫苗0.3ml/只，完全產(chǎn)生保護(hù)性抗體的最早時(shí)間是在免疫后11天，具體結(jié)果見(jiàn)表3。表3各組雞雛發(fā)病率與保護(hù)率28日齡雛雞試驗(yàn)2.1方法8日齡AA肉雞雛120只，分為12組，每組10只，1-6組分別經(jīng)肌肉注射免疫雞包涵體肝炎病毒血清4型轉(zhuǎn)移因子佐劑滅活疫苗0.5ml/只，7-12組為對(duì)照組，不做任何處理。在免疫后8、9、10、11、12、13天時(shí)，分別對(duì)1和7組、2和8組、3和9組、4和10組、5和11組、6和12組的所有雞雛肌肉注射接種雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株100LD50/只。上述各組接種病毒后觀察10天，統(tǒng)計(jì)各組雞雛發(fā)病及死亡情況。2.2結(jié)果各攻毒對(duì)照組發(fā)病率100％、死亡率＞60％，免疫疫苗組100％保護(hù)是在免疫后10天，說(shuō)明8日齡雞雛免疫疫苗0.5ml/只，完全產(chǎn)生保護(hù)性抗體的最早時(shí)間是在免疫后10天，結(jié)果見(jiàn)表4。表4各組雞雛發(fā)病率與保護(hù)率3討論5日齡和8日齡雞雛分別免疫疫苗0.3ml/只和0.5ml/只，完全產(chǎn)生保護(hù)性抗體的最早時(shí)間分別是在免疫后11天和10天，最早保護(hù)時(shí)間的差異可能與疫苗接種劑量有關(guān)。實(shí)施例4雞包涵體肝炎病毒滅活疫苗免疫持續(xù)期試驗(yàn)1方法5日齡AA肉雞雛80只，分為8組，每組10只，1-4組分別經(jīng)肌肉注射免疫雞包涵體肝炎血清4型轉(zhuǎn)移因子佐劑滅活疫苗0.3ml/只，5-8組為對(duì)照組，不做任何處理。在免疫后1、2、3、4個(gè)月時(shí)，分別對(duì)1和5組、2和6組、3和7組、4和8組的所有雞雛肌肉注射接種雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株100LD50/只。上述各組接種病毒后觀察10天，統(tǒng)計(jì)各組雞雛發(fā)病及死亡情況。2結(jié)果攻毒對(duì)照組雞雛發(fā)病率100％、死亡率＞60％，疫苗免疫組100％保護(hù)的持續(xù)期為3個(gè)月，具體結(jié)果見(jiàn)表5。表5各組雞雛發(fā)病率與保護(hù)率實(shí)施例5雞包涵體肝炎病毒滅活疫苗保存期試驗(yàn)1方法取于2-8℃保存的雞包涵體肝炎病毒血清4型轉(zhuǎn)移因子佐劑滅活疫苗，于保存6、8、10、12和15個(gè)月時(shí)分別接種10只5日齡AA肉雞雛0.3ml/只，同時(shí)設(shè)10只對(duì)照，在接種疫苗后15日分別對(duì)免疫組和對(duì)照組雞雛肌肉注射接種雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株100LD50/只，接種病毒后觀察10天，統(tǒng)計(jì)各組雞雛發(fā)病及死亡情況。2結(jié)果對(duì)照組雞雛發(fā)病率均為100％，死亡率＞60％，保存6、8、10、12個(gè)月疫苗接種組雛雞100％保護(hù)，保存15個(gè)月的疫苗接種組有3只雞雛發(fā)病，但未死亡。所以確定疫苗保存期為：2-8℃保存，有效期12個(gè)月。實(shí)施例6雞包涵體肝炎病毒滅活疫苗接種肉種雞后母源抗體對(duì)子代的保護(hù)期肉種雞在5-8日齡時(shí)首次免疫雞包涵體肝炎病毒血清4型轉(zhuǎn)移因子佐劑滅活疫苗0.3-0.5ml/只，在開(kāi)產(chǎn)前15日再次免疫0.8-1.0ml/只，用該種雞所產(chǎn)種蛋孵化雞雛80只，分為4組，每組20只，對(duì)1-4組雞雛在10、15、20和30日齡時(shí)分別肌肉注射接種雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株100LD50/只，接種病毒后觀察10天，統(tǒng)計(jì)各組雞雛發(fā)病及死亡情況。結(jié)果顯示：1和2組雞雛全部健活，未出現(xiàn)雞包涵體肝炎臨床發(fā)病癥狀；第3組有1只發(fā)病，其余健活，發(fā)病雞雛未死亡；第4組有8只發(fā)病，其余健活，發(fā)病雞雛死亡5只。說(shuō)明母源抗體可100％保護(hù)至少15日。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3