本發(fā)明涉及殺菌劑，具體涉及一種磁性納米殺菌劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

四環(huán)素類抗生素，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上屬氫化并四苯環(huán)衍生物，具有殺菌范圍較廣、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，作為殺菌藥物而被廣泛應(yīng)用于人和動(dòng)物的疾病治療，同時(shí)長(zhǎng)期添加于飼料中以預(yù)防疾病和促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育。我國(guó)是抗生素生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，但對(duì)抗生素的生產(chǎn)和使用缺乏科學(xué)的管理，抗生素的濫用情況非常嚴(yán)重。因此我國(guó)環(huán)境中抗生素的殘留濃度較高，存在嚴(yán)重的抗生素污染問題。為減少抗生素用量，防止抗生素濫用，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種安全高效的磁納米殺菌劑。

磁性納米材料是近年來新興的功能型材料，F(xiàn)e₃O₄磁性納米粒子因其高比表面積、生物相容性好、粒徑可控、易制備和在外部磁場(chǎng)下快速響應(yīng)等特性得到人們的特別關(guān)注，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、材料化學(xué)、分離科學(xué)等領(lǐng)域，尤其是在磁靶向給藥方面的應(yīng)用引起了研究者們持續(xù)而廣泛的關(guān)注。

膽酸由一個(gè)剛性的甾環(huán)和一個(gè)脂肪側(cè)鏈組成，是膽汁中一大類膽烷酸的總稱。研究表面膽酸與藥物結(jié)合可以提高藥物的細(xì)胞膜滲透性和藥效。鵝去氧膽酸(Chenodeoxycholicacid，簡(jiǎn)稱CDCA)是膽酸的一種，1848年首次從鵝膽汁中提取得到，具有平喘、化痰、鎮(zhèn)咳和抗炎的作用。鵝去氧膽酸分子的甾環(huán)上連有兩個(gè)羥基和一個(gè)羧基易于進(jìn)行化學(xué)修飾，并具有較好的細(xì)胞膜滲透性和較高的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，以其衍生物與磁納米通過共價(jià)縮合做載體，賦予藥物包合物細(xì)胞膜滲透性和磁靶向性，能夠?qū)崿F(xiàn)藥物的高效的滅菌活性，減少抗生素用量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種高效的磁性納米殺菌劑及其制備方法。該磁性納米殺菌劑，具有較好的殺菌活性，可減少用量，防止抗生素濫用。

本發(fā)明所提供的磁性納米殺菌劑，通過包括如下步驟的方法制備得到：

(1)酯化鵝去氧膽酸的制備：將鵝去氧膽酸溶解在甲酸溶液中，在50-60℃下，機(jī)械攪拌反應(yīng)5-6小時(shí)后，產(chǎn)物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，所得固體過柱提純；40-70℃真空干燥12小時(shí)，得到甲酸修飾的酯化鵝去氧膽酸(CDCA)，密封保存；

(2)酯化鵝去氧膽酸/Fe₃O₄磁性納米復(fù)合體(CDCA-APTES-Fe₃O₄–MNPs)的制備：將酯化鵝去氧膽酸溶解于無水二氯甲烷中，加入縮水劑二環(huán)己基碳二亞胺、催化劑4-二甲氨基吡啶，機(jī)械攪拌10min，所述酯化鵝去氧膽酸、縮水劑和催化劑的摩爾比為1∶0.9-1.2∶0.8-1.2；同時(shí)稱取酯化鵝去氧膽酸質(zhì)量18-22％的修飾了氨基的Fe₃O₄-MNPs溶于無水二氯甲烷溶液中，超聲使其均勻分散后加入到上述酯化鵝去氧膽酸混合溶液中，室溫反應(yīng)過夜；所得產(chǎn)物過濾，用二氯甲烷漂洗，再依次用二次水、飽和碳酸氫鈉、二次水洗滌；40-70℃真空干燥12小時(shí)，得到復(fù)合體CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs；

(3)磁性納米殺菌劑的制備：將復(fù)合體CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs加入濃度為10^-2mol/L的pH 5-9的磷酸緩沖溶液中，超聲混勻，再加入濃度為10^-3mol/L的四環(huán)素類抗生素藥物，緩沖溶液和藥物的體積比1∶0.5-3，復(fù)合體與藥物的質(zhì)量比為2-5∶1；在室溫下超聲10min，振蕩3-6小時(shí)；磁滯分離，沉淀在40-70℃下真空干燥12小時(shí)，得到CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs與四環(huán)素類抗生素的包合物，即磁性納米殺菌劑。

步驟(1)中，所述機(jī)械攪拌轉(zhuǎn)速800r/min；反應(yīng)溫度為55℃下，攪拌反應(yīng)時(shí)間為5-6小時(shí)；過柱提純的展開劑為乙醇∶二氯甲烷＝2∶98。

步驟(2)中，所述氨基化的Fe₃O₄-MNPs的量為酯化膽酸質(zhì)量的20％。

步驟(1)、(2)、(3)中真空干燥溫度優(yōu)選為60℃。

步驟(3)中，所述的四環(huán)素類抗生素優(yōu)選鹽酸土霉素(OTC)或鹽酸金霉素(CTC)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明在Fe₃O₄磁性納米粒子上接枝了鵝去氧膽酸，并與四環(huán)素類抗生素包合，合成了一種新型磁性納米殺菌劑。該磁性納米殺菌劑細(xì)胞膜滲透性好、殺菌活性高，在減少抗生素用量、防止抗生素污染方面有重要應(yīng)用價(jià)值。由于鵝去氧膽酸是一種天然膽酸，原料易得，生物相容性好，化學(xué)結(jié)構(gòu)易于修飾，并具有較好的細(xì)胞膜滲透性和較高的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，以其衍生物作為載體，賦予殺菌劑良好的細(xì)胞膜滲透性，提高了殺菌劑的殺菌效果。本發(fā)明還通過改變緩沖液的pH值研究了磁性納米殺菌劑在細(xì)胞外的釋放能力，并通過與單純的抗生素殺菌活性對(duì)比，對(duì)其進(jìn)行了殺菌活性評(píng)價(jià)。得出的結(jié)論是：該磁性納米殺菌劑具有較高的殺菌活性，可減少用量，防止抗生素濫用。

附圖說明

圖1 CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs的分離過程。圖中：(a)制備的CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs分散在水溶液中；(b)CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs完全被磁鐵分離。

圖2 APTES-Fe₃O₄-MNPs(a)和CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs(b)的紅外光譜圖。

圖3 APTES-Fe₃O₄-MNPs(a)和CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs(b)的透射電鏡照片。

圖4 CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs的X-射線衍射圖。

圖5 CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs的磁滯回線圖。

圖6 APTES-Fe₃O₄-MNPs(a)和CDCA–APTES-Fe₃O₄-MNPs(b)的熱重分析圖。

圖7 pH對(duì)CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs與CTC和OTC負(fù)載作用的影響，F(xiàn)：CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs吸附后上清液中CTC和OTC的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)₀：CTC和OTC的熒光強(qiáng)度。

圖8不同pH條件下CTC磁性納米殺菌劑的體外釋放曲線。

圖9不同pH條件下OTC磁性納米殺菌劑的體外釋放曲線。

圖10 OTC磁性納米殺菌劑殺菌活性效果圖。

圖11 CTC磁性納米殺菌劑殺菌活性效果圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：磁性納米殺菌劑的制備

(1)鵝去氧膽酸衍生物的制備：稱取1.0012g鵝去氧膽酸，將其溶解在10mL甲酸溶液中；55℃下，磁力攪拌5小時(shí)后，產(chǎn)物通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除溶劑，所得固體過柱提純(展開劑：乙醇∶二氯甲烷＝2∶98)。60℃真空干燥12小時(shí)，得到甲酸修飾的酯化鵝去氧膽酸(CDCA)，密封保存。

(2)酯化鵝去氧膽酸/Fe₃O₄磁性納米復(fù)合體(CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs)的制備：稱取酯化鵝去氧膽酸1g溶解于20mL無水二氯甲烷中，加入縮水劑二環(huán)己基碳二亞胺0.58g、催化劑4-二甲氨基吡啶0.24g，攪拌10min。同時(shí)稱取0.2g的修飾的氨基化的Fe₃O₄-MNPs溶于20mL無水二氯甲烷溶液中，超聲待其均勻分散后加入酯化鵝去氧膽酸混合溶液中，室溫反應(yīng)過夜。所得產(chǎn)物用二氯甲烷漂洗，再分別用二次水、飽和碳酸氫鈉、二次水洗滌。60℃真空干燥12小時(shí)，得到CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs。

(3)磁性納米殺菌劑的制備：稱取5mg CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs加入2mL濃度為10^-2mol/L的pH＝6的磷酸緩沖溶液中，超聲混勻，再加入4mL濃度為10^-3mol/L的抗生素OTC，在室溫下超聲10min，振蕩6小時(shí)；磁滯分離，沉淀在60℃下真空干燥12小時(shí)，得到CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs與抗生素OTC的包合物。

稱取5mg CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs加入2mL濃度為10^-2mol/L的pH＝9的磷酸緩沖溶液中，超聲混勻，再加入4mL濃度為10^-3mol/L的抗生素CTC，在室溫下超聲10min，振蕩3小時(shí)；磁滯分離，沉淀在60℃下真空干燥12小時(shí)，得到CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs與抗生素CTC的包合物。

從圖2紅外光譜圖顯示：a譜線588cm^-1處的吸收峰為Fe₃O₄-MNPs中Fe-O四面體的特征吸收，3420cm^-1處為Fe₃O₄-MNPs表面-OH的伸縮振動(dòng)峰，1630cm^-1為-NH和-NH₂的伸縮振動(dòng)峰。表明：APTES成功修飾到Fe₃O₄-MNPs表面。b譜線為CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs的紅外譜線，1077cm^-1為酯化膽酸中C-C(＝O)-O的強(qiáng)吸收峰，此峰強(qiáng)且寬，在酯的紅外光譜中常為第一強(qiáng)峰。1716cm^-1為酯中C＝O伸縮振動(dòng)，1635cm^-1為酰胺中C＝O的伸縮振動(dòng)峰，1556cm^-1為N-H的彎曲振動(dòng)，1412cm^-1為酰胺中C-N的伸縮振動(dòng)，以上特征峰的出現(xiàn)證實(shí)了鵝去氧膽酸衍生物成功修飾到APTES-Fe₃O₄-MNPs上。

圖3的透射電鏡照片顯示：圖中a和b分別為APTES-Fe₃O₄-MNPs和CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs的TEM照片。從圖中可看到APTES-Fe₃O₄-MNPs和CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs形狀近似球形或橢球形,分散性良好,沒有明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象。APTES-Fe₃O₄-MNPs和CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs的平均粒徑分布在14±2nm,在Fe₃O₄-MNPs超順磁性粒徑要求范圍內(nèi)(粒徑小于20nm)，酯化鵝去氧膽酸的修飾對(duì)平均粒徑影響不大。

圖4為CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs的X-射線衍射圖譜(XRD)。圖中2θ位于30.12,35.58,43.35,53.62,57.13，62.,89相應(yīng)的衍射峰分別對(duì)應(yīng)于Fe₃O₄面心立方的(220),(311),(400),(422),(511)和(440)衍射面。上述結(jié)果與JCPDS(No.85-1436)標(biāo)準(zhǔn)卡片中赤鐵礦的圖譜一致,表明合成的CDCA-Fe₃O₄-MNPs具有立方尖晶石結(jié)構(gòu)。選取CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs的最強(qiáng)衍射峰(311)用于粒徑估算,由Scherrer公式(1)計(jì)算出CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs的平均粒徑為15nm，與TEM測(cè)得的粒徑數(shù)據(jù)接近。

D＝0.89λ/Bcosθ (1)

其中，D為粒子的平均直徑/nm，0.89為Scherrer常數(shù)，λ為0.154nm，是X-射線波長(zhǎng)，B為衍射峰的半高寬，θ為衍射角/rad。

圖5為CDCA–APTES-Fe₃O₄-MNPs的磁滯回線圖。橫坐標(biāo)為外加磁場(chǎng)強(qiáng)度,縱坐標(biāo)為單位質(zhì)量磁性物質(zhì)在外加磁場(chǎng)存在時(shí)的感應(yīng)磁性大小。從圖中可以看到，該曲線經(jīng)過原點(diǎn)，當(dāng)外加磁場(chǎng)為0時(shí)，磁感應(yīng)強(qiáng)度為0，符合超順磁的概念，說明該物質(zhì)是超順磁性的。根據(jù)磁力矩實(shí)驗(yàn)得到結(jié)果為：CDCA–APTES-Fe₃O₄-MNPs的飽和磁化值可達(dá)到59emu/g。鵝去氧膽酸修飾后，沒有明顯弱化Fe₃O₄-MNPs的磁性。

采用熱重分析(TGA)進(jìn)一步證實(shí)鵝去氧膽酸修飾到Fe₃O₄-MNPs表面，并測(cè)定了表面修飾劑的含量。Fe₃O₄-MNPs和CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs的熱重曲線如圖6所示。Fe₃O₄-MNPs在120℃左右出現(xiàn)了首次失重，這是Fe₃O₄-MNPs表面吸附的溶劑(水或乙醇)揮發(fā)造成的。CDCA-APTES-Fe3O4-MNPs的失重曲線在155℃-301.92℃之間的失重(2.75％)歸結(jié)為3-氨基丙基的熱分解失重；在301.92℃-600℃之間存在一個(gè)顯著的失重(3.4％)過程，這是由于修飾到磁納米材料上的鵝去氧膽酸等有機(jī)結(jié)構(gòu)的熱分解造成的。CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs的失重曲線沒有出現(xiàn)增重的過程,說明CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs包覆Fe₃O₄-MNPs后不容易被氧化，穩(wěn)定性有了很大提高。通過分析及計(jì)算表明，酯化鵝去氧膽酸成功修飾到Fe₃O₄-MNPs表面，修飾量為34.75mg/g。

由于抗生素對(duì)pH較敏感，故研究了不同pH下CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs的載藥性能。配置0.2mg/mL的CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs溶液，超聲混勻，分別加入不同pH(3-11)磷酸緩沖液和濃度為1×10^-5mol/L的抗生素CTC或OTC。超聲10min，溶液在室溫下振蕩3-6小時(shí)。反應(yīng)完畢后，磁滯分離，取上清液測(cè)定其熒光強(qiáng)度。處理數(shù)據(jù)，如圖7所示，CTC在pH≤9時(shí)，CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs對(duì)CTC的負(fù)載量隨著pH的增大而增大，且在pH＝9時(shí)，負(fù)載量明顯增加。pH為9-11時(shí)，負(fù)載量又逐漸下降。故堿性條件(pH＝9)更有利于CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs對(duì)CTC的負(fù)載；OTC在pH≤6時(shí)，CDCA-APTES-Fe₃O₄-MNPs對(duì)OTC的負(fù)載量隨著pH的增大而增大，pH在7-11時(shí)，負(fù)載量又逐漸下降，因此選用pH＝6來負(fù)載抗生素OTC。

實(shí)施例2：磁性納米殺菌劑的體外釋放實(shí)驗(yàn)

稱取2份2mg的CTC包合物和2份2mg的OTC包合物，分別加入濃度10^-2mol/LpH＝7和pH＝9的PB緩沖溶液各30mL。在37℃的水浴中計(jì)時(shí)釋放，每隔一定時(shí)間取上清液測(cè)其熒光，計(jì)算其累計(jì)釋放率。如圖8、9所示，pH＝7和pH＝9時(shí)，CTC的累計(jì)釋放率分別達(dá)到14％和23％；OTC的累計(jì)釋放率分別為9％和12％。對(duì)比釋放數(shù)據(jù)可以看出，藥物釋放具有一定的pH依賴性。CTC和OTC的釋放過程均分為兩個(gè)階段。CTC在60min內(nèi)釋放曲線的斜率很大；說明此時(shí)釋放速率較快，這可能是由于吸附在載體表面的CTC由于濃度差產(chǎn)生擴(kuò)散引起的，之后變化較緩慢，4小時(shí)左右達(dá)到平臺(tái)。說明載體外圍吸附的CTC達(dá)到了擴(kuò)散平衡；OTC在40min內(nèi)釋放曲線的斜率很大，說明此時(shí)釋放速率較快，之后變化較緩慢，2小時(shí)左右達(dá)到平臺(tái)，說明載體外圍吸附的OTC達(dá)到了擴(kuò)散平衡。可見，該殺菌劑釋放速率較快，實(shí)用性較強(qiáng)。

實(shí)施例3：磁性納米殺菌劑殺菌活性的實(shí)驗(yàn)

土霉素OTC磁性納米殺菌劑殺滅大腸桿菌實(shí)驗(yàn)，每支試管取7.5mL牛肉膏蛋白凍培養(yǎng)基，各加100μL濃度為10⁸CFU/mL的大腸桿菌液，分別配置濃度為1mg/mL、3μg/mL、5μg/mL、7μg/mL、11μg/mL、20μg/mL的OTC磁性納米殺菌劑(實(shí)驗(yàn)組)和磁性納米復(fù)合體、裸藥OTC(對(duì)照組)，于37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24h。如圖10所示，最上層為磁性納米復(fù)合體，六支試管全是渾濁的，說明大腸桿菌大量繁殖，磁納米沒有殺菌能力；中間層為裸藥OTC，前兩只試管是渾濁的，說明細(xì)菌大量繁殖，之后試管澄清透亮，說明可有效殺死細(xì)菌，其最小抑菌濃度在5μg/mL；最下層為OTC磁性納米殺菌劑，從第二支試管就開始澄清透亮，其最小抑菌濃度在3μg/mL?？芍判约{米殺菌劑殺菌活性明顯高于裸藥。

金霉素CTC磁性納米殺菌劑殺滅金葡萄球菌實(shí)驗(yàn)，每支試管取6mL牛肉膏蛋白凍培養(yǎng)基，各加100μL濃度為10⁸CFU/mL的金葡萄球菌液，分別配置濃度為0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL的CTC磁性納米殺菌劑(實(shí)驗(yàn)組)和磁性納米復(fù)合體、裸藥CTC(對(duì)照組)，于37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24h。如圖11所示，最上層為磁性納米復(fù)合體，六支試管全是渾濁的，說明金葡萄球菌大量繁殖，磁納米沒有殺菌能力；中間層為CTC磁性納米殺菌劑，前兩只試管是渾濁的，說明細(xì)菌大量繁殖，之后試管澄清透亮，說明可有效殺死細(xì)菌，其最小抑菌濃度在0.3μg/mL；最下層為裸藥CTC，從第四支試管才開始澄清透亮，其最小抑菌濃度在0.4μg/mL?？芍判约{米殺菌劑殺菌活性高于裸藥。

綜上所述，磁性納米粒子和四環(huán)素類抗生素結(jié)合有協(xié)同作用，可提高抗生素的殺菌能力，可見磁性納米殺菌劑是安全高效的抗生素替代品，可以作為實(shí)用型殺菌劑。