本發(fā)明涉及食品加工領(lǐng)域，尤其涉及一種荔枝果肉中抑制肝細(xì)胞脂質(zhì)聚集主效酚類(lèi)成分的純化方法。

背景技術(shù)：

荔枝是亞熱帶地區(qū)的主要特色水果，因其果皮鮮艷美觀(guān)、肉汁細(xì)膩香甜而深受?chē)?guó)內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛(ài)，被譽(yù)為“果中珍品”。我國(guó)是荔枝的主產(chǎn)國(guó)，種植面積和產(chǎn)量均居世界第一。廣東省作為荔枝的主產(chǎn)區(qū)其產(chǎn)量占全國(guó)荔枝總產(chǎn)量的60％以上。由于荔枝上市時(shí)間集中，且保鮮時(shí)間短，鮮銷(xiāo)市場(chǎng)壓力巨大。如何開(kāi)展荔枝的精深加工，緩解鮮銷(xiāo)市場(chǎng)壓力，提高荔枝的附加值成為一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。

自古以來(lái)，很多古醫(yī)書(shū)中都記載有荔枝的各種保健作用，《本草綱目》記載：“常食荔枝能補(bǔ)腦健身，治療瘰疬，開(kāi)胃益脾；干制能補(bǔ)元?dú)?，可作為產(chǎn)婦及老弱者的補(bǔ)品”；《滇南本草》稱(chēng)其“暖補(bǔ)脾精，滋補(bǔ)肝血”。然而，截至目前，對(duì)于荔枝中具有保健作用的物質(zhì)基礎(chǔ)以及其發(fā)揮生物活性的作用機(jī)制還缺乏清晰的認(rèn)識(shí)。已有研究表明，荔枝果肉中富含多酚類(lèi)物質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)其具有減輕拘束應(yīng)激引起的小鼠肝臟損傷、抑制高脂膳食誘導(dǎo)的小鼠肝臟脂肪變性，降低血脂水平等作用。然而，在上述研究中，所采用的都是荔枝果肉多酚的提取物，其多酚類(lèi)成分組成復(fù)雜。酚類(lèi)物質(zhì)是一大類(lèi)植物次生代謝產(chǎn)物，不同的化合物因其結(jié)構(gòu)的差異活性會(huì)有明顯的不同。上述研究雖然發(fā)現(xiàn)了荔枝果肉多酚具有護(hù)肝、降血脂等的生物活性，其中具體的作用成分卻并不明確。

為了探明某些原料中的有效活性成分，傳統(tǒng)的研究思路是利用植物化學(xué)的方法將其逐步分離純化制備出一個(gè)個(gè)的單體，再對(duì)其活性逐一進(jìn)行比較，找出其中活性最強(qiáng)的一個(gè)或幾個(gè)成分，認(rèn)定為該原料中主要的活性成分。然而，近來(lái)的研究觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為植物活性物質(zhì)發(fā)揮藥理活性的往往不是某種單一的化學(xué)成分而是一組成分群的共同作用。采用上述方法會(huì)割裂成分間的有機(jī)關(guān)聯(lián)與交互作用，難以體現(xiàn)其產(chǎn)生的協(xié)同或拮抗等共同作用特點(diǎn)。而且，這樣的研究工作操作繁雜，研究成本高，甚至可能因?qū)嶒?yàn)條件限制而無(wú)法實(shí)現(xiàn)。若將荔枝果肉分成不同的酚類(lèi)成分群，對(duì)其活性分別進(jìn)行比較不僅考慮了某些含量較低或單獨(dú)作用活性較弱的成分對(duì)主要活性成分可能具有的協(xié)同增效作用，確定出更接近提取物作用效果的有效酚類(lèi)成分群，而且較逐個(gè)分離化合物可以提高工作效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種簡(jiǎn)化的荔枝果肉中抑制肝細(xì)胞脂質(zhì)聚集主效酚類(lèi)成分的純化方法，解決化合物逐一分離制備荔枝果肉多酚活性成分煩瑣耗時(shí)，且容易忽略化合物間的協(xié)同作用的問(wèn)題。

本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

一種荔枝果肉中抑制肝細(xì)胞脂質(zhì)聚集主效酚類(lèi)成分的純化方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、制備荔枝果肉多酚提取物；

S2、將步驟S1的荔枝果肉多酚提取物溶于DMSO中形成濃度600mg/mL溶液，再用蒸餾水稀釋至終濃度為1mg/mL；

S3、上樣于C₁₈硅膠層析柱后，依次采用體積百分比濃度為1～2％的乙腈水(v/v)和組合液進(jìn)行梯度洗脫，收集流分，并用HPLC檢測(cè)分析，合并圖譜組成相近的流分，所述組合液包括含有0.2％冰乙酸的體積百分比濃度為10～35％的甲醇水溶液；

收集1％、2％乙腈洗脫液和10％、15％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脫液合并液洗脫液，單獨(dú)收集20％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脫液，收集25％和30％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脫液合并液，單獨(dú)收集35％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脫液；

S4、將步驟S3中收集的洗脫液依次分別用蒸餾水稀釋1.5～2倍后，上樣到HPD100型大孔吸附樹(shù)脂柱，先用蒸餾水沖洗，再用100％甲醇洗脫并收集甲醇洗脫液，分別減壓回收甲醇后冷凍干燥，得到四個(gè)組成不同的荔枝果肉酚類(lèi)成分群，F(xiàn)1、F2、F3和F4；

S5、合并F2和F3。

其中，步驟S3中10％、15％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脫液是指用含有體積百分比濃度10％的甲醇和0.2％冰乙酸的水溶液以及含有體積百分比濃度15％的甲醇和0.2％冰乙酸的水溶液分別洗脫后收集；20％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脫液是指用含有體積百分比濃度20％的甲醇和0.2％冰乙酸的水溶液洗脫后收集；25％和30％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脫液合并液是指用含有體積百分比濃度25％的甲醇和0.2％冰乙酸的水溶液以及含有體積百分比濃度30％的甲醇和0.2％冰乙酸的水溶液分別洗脫后收集；35％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脫液是指含有體積百分比濃度35％的甲醇和0.2％冰乙酸的水溶液分別洗脫后收集。

荔枝果肉多酚提取物經(jīng)過(guò)AB-8大孔樹(shù)脂初步純化后，成分還是比較復(fù)雜，里面的酚類(lèi)成分有些在抑制肝細(xì)胞脂質(zhì)聚集中有效果，有些沒(méi)有活性，但是如果一一進(jìn)行分離研究又非常的煩瑣，而且很有可能有些成分單獨(dú)不起作用卻能夠增強(qiáng)其它成分的作用，如果采用一一分離的方法，這些輔助性化合物的作用就會(huì)被忽視，因此，最終分離到的有效成分的作用并不能達(dá)到粗提物共同作用的效果?；谶@樣的一個(gè)思路，我們想要發(fā)明一種簡(jiǎn)化的可以分離出主要活性成分的植物活性物質(zhì)純化方法。

將荔枝果肉多酚提取物上硅膠柱，利用不同類(lèi)型的化合物因其極性等的差異與硅膠柱的吸附力不同，采用不同極性的洗脫劑進(jìn)行分步洗脫將其分離。結(jié)合液相色譜檢測(cè)和活性分析，發(fā)現(xiàn)用1％、2％乙腈洗脫液和10％甲醇水、15％甲醇水洗脫下來(lái)的成分活性均較低，這一部分進(jìn)行合并(F1)；20％甲醇水洗脫液部分(F2)，還有25％和30％甲醇水洗脫液部分(F3)的活性都比較好，35％甲醇水洗脫液部分(F4)活性也比較差。

后續(xù)采用HPD100大孔吸附樹(shù)脂處理的過(guò)程主要是為了脫去洗脫液中的水分。由于上述洗脫液水分含量較高，如果進(jìn)行旋蒸和濃縮處理的話(huà)，因?yàn)榉宇?lèi)物質(zhì)對(duì)溫度等較敏感，會(huì)造成較多的降解，同時(shí)能耗也非常大。因此，將洗脫液上到大孔吸附樹(shù)脂上，洗脫液中的多酚類(lèi)成分會(huì)與樹(shù)脂進(jìn)行結(jié)合，再利用甲醇將結(jié)合的酚類(lèi)物質(zhì)洗脫下來(lái)，甲醇洗脫液可以較快的旋蒸去除有機(jī)溶劑進(jìn)而得到目標(biāo)分離物質(zhì)。在大孔樹(shù)脂上樣前對(duì)洗脫液用蒸餾水做1.5～2倍稀釋?zhuān)康氖菫榱私档蜕蠘右褐杏袡C(jī)溶劑的濃度，因?yàn)橛袡C(jī)溶劑含量高時(shí)會(huì)影響酚類(lèi)物質(zhì)與大孔樹(shù)脂的吸附，造成酚類(lèi)物質(zhì)流失。

在確定有效活性組分的過(guò)程中，考慮到有些成分單獨(dú)無(wú)明顯活性但是可能會(huì)其它對(duì)其它成分的協(xié)同增效作用，因此在確定出F2和F3活性較好后，還進(jìn)一步參照各部分在粗提物中的構(gòu)成比例進(jìn)行配合，觀(guān)察在F2和F3的基礎(chǔ)上再添加F4后活性是否有變化，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有進(jìn)一步提高其活性，因此，確定出F2和F3為荔枝果肉多酚抑制肝細(xì)胞脂質(zhì)聚集的主要酚類(lèi)成分，所以最后對(duì)這兩部分進(jìn)行了合并。

進(jìn)一步地，步驟S1的具體步驟如下：

S11、制備荔枝果肉多酚粗提液：新鮮荔枝果肉浸泡在0～4℃預(yù)冷的95％食用酒精中，均質(zhì)，離心后收集上清液，于45～55℃條件下減壓回收乙醇，殘留的水溶液為荔枝果肉多酚粗提液；

此部分主要是旋蒸的溫度會(huì)影響多酚的穩(wěn)定性，溫度過(guò)高容易造成多酚氧化和降解

S12、將步驟S11中制得的荔枝果肉多酚粗提液經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂吸附后，蒸餾水洗脫以除去可溶性糖和其它小分子化合物，再用65～75％乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，于45～55℃減壓濃縮，得到深黃色濃縮液，真空冷凍干燥后即為荔枝果肉多酚提取物。

此步驟主要是大孔樹(shù)脂類(lèi)型會(huì)影響純化酚類(lèi)物質(zhì)的得率，優(yōu)選AB-8但不局限于AB-8這一種樹(shù)脂，HPD826等幾種樹(shù)脂都有較好的分離效果；旋蒸的濃度如上會(huì)影響多酚的穩(wěn)定性。

優(yōu)選地，步驟S11中浸泡時(shí)新鮮荔枝果肉與95％食用酒精的料液比為1∶(2～3)w/v。

此處控制食用酒精的用量主要是考慮到節(jié)約原料，增大料液比，如增到1：4～5后，多酚提取率會(huì)略有提高，但浪費(fèi)太多酒精，因此對(duì)料液比進(jìn)行適當(dāng)限制。

其中，步驟S3的上樣條件：上樣流速為5～6BV/h，上樣量與C₁₈硅膠填料質(zhì)量比為1∶80～100，優(yōu)選采用15cm×6.0cm，40μm的C₁₈硅膠層析柱。步驟S3的1～2％乙腈水、10％甲醇/0.2％冰乙酸水、15％甲醇/0.2％冰乙酸水、20％甲醇/0.2％冰乙酸水、25％甲醇/0.2％冰乙酸水的洗脫體積都是3.5～4BV，30％甲醇/0.2％冰乙酸水的洗脫體積為14～16BV，35％甲醇/0.2％冰乙酸水的洗脫體積為5～6BV，洗脫流速均為5～6BV/h。

上樣量與硅膠填料的質(zhì)量比會(huì)影響最終結(jié)果，上樣量太低耗時(shí)，不經(jīng)濟(jì)，上樣量太高而超過(guò)硅膠柱吸附量會(huì)造成樣品損失。洗脫液體積會(huì)影響最終結(jié)果，體積太小洗脫不完全，體積太大造成溶劑浪費(fèi)。

洗脫溶劑種類(lèi)會(huì)影響結(jié)果，溶劑種類(lèi)和濃度的改變會(huì)影響其極性，從而會(huì)影響洗脫液中酚類(lèi)成分的構(gòu)成。

步驟S4中用于沖洗的蒸餾水為2.5～3BV。步驟S4的洗脫流速為5～6BV/h。

樹(shù)脂類(lèi)型會(huì)影響最終結(jié)果，不同類(lèi)型的樹(shù)脂對(duì)不同種類(lèi)的化合物吸附效果不同，如樹(shù)脂類(lèi)型不合適，吸附率低，或解析率低的現(xiàn)象，從而使最終得率降低。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明通過(guò)對(duì)荔枝果肉中原花青素、黃酮類(lèi)物質(zhì)等4段不同的酚類(lèi)成分的分離，獲得這4段酚類(lèi)成分對(duì)油酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集的抑制作用，可用于制備調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，抑制肝臟脂肪變性的降血脂、護(hù)肝的藥物或功能食品。

附圖說(shuō)明

圖1為C18硅膠柱分離荔枝果肉不同酚類(lèi)成分群的HPLC譜；

圖2為荔枝果肉多酚提取物抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)的時(shí)效與量效關(guān)系圖；

圖3為荔枝果肉多酚提取物抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)總膽固醇(TC)的時(shí)效與量效關(guān)系圖；

圖4為純化得到的F1抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)的時(shí)效與量效關(guān)系圖；

圖5為純化得到的F1抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)總膽固醇(TC)的時(shí)效與量效關(guān)系圖；

圖6為純化得到的F2抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)的時(shí)效與量效關(guān)系圖；

圖7為純化得到的F2抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)總膽固醇(TC)的時(shí)效與量效關(guān)系圖；

圖8為純化得到的F3抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)的時(shí)效與量效關(guān)系圖；

圖9為純化得到的F3抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)總膽固醇(TC)的時(shí)效與量效關(guān)系圖；

圖10為純化得到的F4抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)的時(shí)效與量效關(guān)系圖；

圖11為純化得到的F4抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)總膽固醇(TC)的時(shí)效與量效關(guān)系圖；

圖12為復(fù)配物F2+F3抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)的時(shí)效與量效關(guān)系圖；

圖13為復(fù)配物F2+F3抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)總膽固醇(TC)的時(shí)效與量效關(guān)系圖；

圖14為復(fù)配物F2+F3+F4抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)的時(shí)效與量效關(guān)系圖；

圖15為復(fù)配物F2+F3+F4抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)總膽固醇(TC)的時(shí)效與量效關(guān)系圖；

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。

實(shí)施例1

一種荔枝果肉中抑制肝細(xì)胞脂質(zhì)聚集主效酚類(lèi)成分的純化方法，包括如下步驟：

S1、制備荔枝果肉多酚提取物，包括如下步驟：

S11、制備荔枝果肉多酚粗提液：新鮮荔枝果肉浸泡在4℃預(yù)冷的95％食用酒精中，均質(zhì)，離心后收集上清液，于45℃條件下減壓回收乙醇，殘留的水溶液為荔枝果肉多酚粗提液；

S12、將步驟S11中制得得的荔枝果肉多酚粗提液經(jīng)過(guò)AB-8大孔樹(shù)脂吸附后，蒸餾水洗脫以除去可溶性糖和其它小分子化合物，再用70％乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，于45℃減壓濃縮，得到深黃色濃縮液，真空冷凍干燥后即為荔枝果肉多酚提取物；

S2、將步驟S1的荔枝果肉多酚提取物溶于DMSO中形成濃度600mg/mL溶液，再用蒸餾水稀釋至終濃度為1mg/mL；

S3、上樣于15cm×6.0cm，40μm的C₁₈硅膠層析柱后，依次采用體積百分比濃度為1～2％的乙腈水(v/v)和體積百分比濃度為10～35％的甲醇/0.2％冰乙酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集流分，并用HPLC檢測(cè)分析，合并圖譜組成相近的流分，收集1％、2％乙腈洗脫液和10％、15％甲醇水洗脫液合并液，單獨(dú)收集20％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脫液，收集25％和30％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脫液合并液，單獨(dú)收集35％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脫液；

S4、將步驟S3中收集的洗脫液依次分別用蒸餾水稀釋1.5倍后，上樣到15cm×6.0cm，60μm的HPD100型大孔吸附樹(shù)脂柱，先用2.5BV蒸餾水沖洗，再用100％甲醇洗脫并收集甲醇洗脫液，洗脫流速為5BV/h，分別減壓回收甲醇后冷凍干燥，得到四個(gè)組成不同的荔枝果肉酚類(lèi)成分群，F(xiàn)1、F2、F3和F4；

S5、合并F2和F3。

步驟S11中浸泡時(shí)新鮮荔枝果肉與乙醇溶液的料液比為1∶2w/v。

其中，步驟S3的上樣條件：上樣流速為5BV/h，上樣量與C₁₈硅膠填料質(zhì)量比為1∶100。步驟S3的1～2％乙腈水、10％甲醇/0.2％冰乙酸水、15％甲醇/0.2％冰乙酸水、20％甲醇/0.2％冰乙酸水、25％甲醇/0.2％冰乙酸水的洗脫體積都是3.5BV，30％甲醇/0.2％冰乙酸水的洗脫體積為14BV，35％甲醇/0.2％冰乙酸水的洗脫體積為5BV，洗脫流速均為5BV/h。

下面通過(guò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其收集組分的活性，具體如下：

1、荔枝果肉各酚類(lèi)成分群的得率及酚類(lèi)含量：所得四個(gè)成分群的得率占比為1.11∶2.15∶1∶1.26。其總酚和總黃酮含量如下表。

表1 荔枝果肉不同酚類(lèi)成分群的得率占比及酚類(lèi)含量

*:成分群對(duì)荔枝果肉多酚的百分比貢獻(xiàn)率；同一列不同字母表示差異顯著(p<0.05)

2、荔枝果肉各酚類(lèi)成分群?jiǎn)误w酚組成及含量分析：稱(chēng)取適量的各待測(cè)樣品溶解在甲醇中配制成濃度為2mg·mL^-1的溶液，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)行組分分析。HPLC-DAD檢測(cè)條件：流動(dòng)相A為0.4％(v/v)的乙酸，流動(dòng)相B為乙腈，洗脫梯度為0-40min B 5％-25％，40-45min B 25％-35％，45-50min B 35％-50％，后運(yùn)行平衡時(shí)間5min；色譜柱為Zorbax SB-C18反相色譜柱(4.6mm×100mm，5μm，Agilent公司)；柱溫為30℃；流速為1.0mL/min；進(jìn)樣體積為20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為全波長(zhǎng)掃描，以280nm為主要觀(guān)察波長(zhǎng)。

由圖1可以看出，F(xiàn)1組分主要分離到LPP中1號(hào)峰之前出峰的成分，1-4號(hào)峰這段內(nèi)的成分純化到F2組分中，而含量最高的5號(hào)峰集中在F3段，5號(hào)峰之后的成分則集中分部在F4段。

3、荔枝果肉多酚提取物對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集的影響：將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞以5×10⁵/mL濃度接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1mL，置于37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。待細(xì)胞融合至70％-80％時(shí)，吸棄舊的培養(yǎng)液，向各孔中加入1mL 1％BSA無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓處理16h，更換含不同濃度LPP或F1-F4不同荔枝果肉酚類(lèi)成分群及400μM油酸的1％BSA無(wú)血清培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。測(cè)定細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)含量。

甘油三酯含量測(cè)定：HepG2細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理完成后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，采用北京普利萊基因技術(shù)有限公司的甘油三酯(組織細(xì)胞)酶法測(cè)定試劑盒，向每孔中加入130μL裂解液，振蕩提取10min，取適量上清液轉(zhuǎn)移至0.5mL離心管中，2000rpm/min離心5min，分離上清液用BCA法測(cè)定蛋白含量；同時(shí)，取10μL上清液加入190μL酶工作液，室溫下反應(yīng)10min，酶標(biāo)儀550nm處測(cè)定吸光度值，以甘油標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得回歸方程，根據(jù)樣品反應(yīng)后的吸光值計(jì)算TG濃度，以每mg蛋白濃度校正各組細(xì)胞內(nèi)TG含量。以油酸模型組作參比，計(jì)算各濃度樣品組TG相對(duì)含量。

總膽固醇酶法測(cè)定：HepG2細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理完成后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，用北京普利萊基因技術(shù)有限公司的總膽固醇(組織細(xì)胞)酶法測(cè)定試劑盒，向每孔中加入130μL裂解液，振蕩提取10min，取適量上清液轉(zhuǎn)移至0.5mL離心管中，2000rpm/min離心5min，分離上清液用BCA法測(cè)定蛋白含量；取10μL上清液加入190μL總膽固醇含量測(cè)定酶工作液，室溫下反應(yīng)20min，酶標(biāo)儀550nm處測(cè)定吸光度值，以膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)吸光值計(jì)算樣本中TC濃度，以每mg蛋白濃度校正各組細(xì)胞內(nèi)TC含量。以油酸模型組作參比，計(jì)算各濃度樣品組TC相對(duì)含量。

圖2、3為不同濃度荔枝果肉多酚提取物(LPP)對(duì)油酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)聚集的抑制作用。不同濃度的LPP對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積均具有一定的抑制作用，但各濃度的抑制效果之間無(wú)明顯差異。

圖4～11為純化得到的F1～F4四個(gè)酚類(lèi)成分群對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集的抑制作用。整體來(lái)看，4個(gè)酚類(lèi)成分群中，F(xiàn)2成分群抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)TG沉積的效果最好，5μg/mL時(shí)細(xì)胞內(nèi)TG含量下降了26.9％，10μg/mL時(shí)達(dá)到最大抑制率為28％，兩者無(wú)明顯差異，但隨著濃度的進(jìn)一步增加，抑制效果反而逐漸減弱。F3對(duì)細(xì)胞內(nèi)TG沉積的抑制作用僅次于F2，濃度為10μg/mL時(shí)細(xì)胞內(nèi)TG含量即下降26.2％，接近于F2的最大抑制率；20μg/mL時(shí)達(dá)到最大抑制率為28.5％。F4的抑制效果相對(duì)較弱，在20μg/mL濃度時(shí)才達(dá)到最大抑制率為19.3％。而F1的抑制效果最差，40μg/mL時(shí)才具有一定抑制作用，細(xì)胞內(nèi)TG含量?jī)H下降11％。4個(gè)酚類(lèi)成分群對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)TC含量的抑制率趨勢(shì)與TG的結(jié)果一致，抑制作用從強(qiáng)到弱順序亦為F2>F3>F4>F1。表明F2和F3成分群對(duì)油酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂質(zhì)聚集有明顯的抑制作用。

對(duì)比圖2、3和圖4～11結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，同樣在5μg/mL作用濃度下，F(xiàn)1～F4四個(gè)成分群對(duì)油酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集的抑制作用要低于LPP，提示上述四個(gè)成分群?jiǎn)为?dú)作用無(wú)法解釋LPP對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)聚集的抑制作用，各成分群之間可能存在協(xié)同或相加作用。進(jìn)而，根據(jù)各酚類(lèi)成分群的得率，以活性最好的成分群F2為基礎(chǔ)，與F3按2.15:1的質(zhì)量比復(fù)配，為復(fù)配物F2+F3；進(jìn)一步將F2、F3與F4按2.15:1:1.26的質(zhì)量比復(fù)配，為復(fù)配物F2+F3+F4。將上述制得的復(fù)配物，按上述同樣的方法分別評(píng)價(jià)其對(duì)油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)TG和TC含量的抑制作用。

圖12～15為兩種復(fù)配物對(duì)油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集的抑制作用。由圖可知，F(xiàn)2+F3復(fù)配物在低濃度1μg/mL時(shí)即對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集有一定抑制作用，與油酸處理的模型組相比，細(xì)胞內(nèi)TG和TC含量均下降約15％，但隨著濃度的進(jìn)一步增加，其對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集的抑制作用并沒(méi)有進(jìn)一步增強(qiáng)，反而逐漸減弱，當(dāng)濃度達(dá)到4μg/mL時(shí)已無(wú)抑制作用，表明在低濃度時(shí)F2和F3存在一定協(xié)同作用。F2+F3+F4復(fù)配物對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集的抑制作用與F2和F3復(fù)配物的結(jié)果類(lèi)似，表明F4與F2和F3共同作用時(shí)未表現(xiàn)出更明顯的協(xié)同效應(yīng)。因此，F(xiàn)2和F3為荔枝果肉抑制肝細(xì)胞脂質(zhì)聚集的主效酚類(lèi)成分。

實(shí)施例2

一種荔枝果肉中抑制肝細(xì)胞脂質(zhì)聚集主效酚類(lèi)成分的純化方法，包括如下步驟：

S1、制備荔枝果肉多酚提取物，包括如下步驟：

S11、制備荔枝果肉多酚粗提液：新鮮荔枝果肉浸泡在0℃預(yù)冷的95％食用酒精中，新鮮荔枝果肉與95％食用酒精的料液比為1∶3w/v，均質(zhì)，離心后收集上清液，于55℃條件下減壓回收乙醇，殘留的水溶液為荔枝果肉多酚粗提液；

S12、將步驟S11中制得的荔枝果肉多酚粗提液經(jīng)過(guò)AB-8大孔樹(shù)脂吸附后，蒸餾水洗脫以除去可溶性糖和其它小分子化合物，再用65％乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，于55℃減壓濃縮，得到深黃色濃縮液，真空冷凍干燥后即為荔枝果肉多酚提取物。

S2、將步驟S1的荔枝果肉多酚提取物溶于DMSO中形成濃度600mg/mL溶液，再用蒸餾水稀釋至終濃度為1mg/mL；

S3、上樣于15cm×6.0cm，40μm的C₁₈硅膠層析柱后，依次采用體積百分比濃度為1～2％的乙腈水(v/v)和體積百分比濃度為10～35％的甲醇/0.2％冰乙酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集流分，并用HPLC檢測(cè)分析，合并圖譜組成相近的流分，收集1％、2％乙腈洗脫液和10％、15％甲醇水洗脫液合并液，單獨(dú)收集20％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脫液，收集25％和30％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脫液合并液，單獨(dú)收集35％甲醇/0.2％冰乙酸水洗脫液；

S4、將步驟S3中收集的洗脫液依次分別用蒸餾水稀釋1.5倍后，上樣到15cm×6.0cm，60μm的HPD100型大孔吸附樹(shù)脂柱，先用3BV蒸餾水沖洗，再用100％甲醇洗脫并收集甲醇洗脫液，洗脫流速為6BV/h，分別減壓回收甲醇后冷凍干燥，得到四個(gè)組成不同的荔枝果肉酚類(lèi)成分群，F(xiàn)1、F2、F3和F4；

S5、合并F2和F3。

其中，步驟S3的上樣條件：上樣流速為6BV/h，上樣量與C₁₈硅膠填料質(zhì)量比為1∶80，優(yōu)選采用15cm×6.0cm，40μm的C₁₈硅膠層析柱。步驟S3的1～2％乙腈水、10％甲醇/0.2％冰乙酸水、15％甲醇/0.2％冰乙酸水、20％甲醇/0.2％冰乙酸水、25％甲醇/0.2％冰乙酸水的洗脫體積都是4BV，30％甲醇/0.2％冰乙酸水的洗脫體積為16BV，35％甲醇/0.2％冰乙酸水的洗脫體積為6BV，洗脫流速均為6BV/h。

實(shí)施例3

除了S12步驟中用于洗脫的乙醇體積百分比為75％外，其他同實(shí)施例1。