本發(fā)明涉及阿魏酸在治療腦組織缺血損傷中的應(yīng)用，特別是作為直接制備藥物或某藥物添加劑用于腦組織缺血損傷引起的中風(fēng)疾病的治療。

背景技術(shù)：

腦中風(fēng)被列為人類十大疾病之一，具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率、高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn)，嚴(yán)重危害人類健康。腦中風(fēng)主要包括缺血性中風(fēng)和出血性中風(fēng)兩大類，其中大腦缺血性中風(fēng)最常見。制作腦中風(fēng)動物模型已成為研究中風(fēng)治療方法不可或缺的重要組成部分。然而，對弄醒有效的許多藥物在臨床應(yīng)用上卻無效，原因可能為這些中風(fēng)模型不能很好地反應(yīng)臨床中風(fēng)疾病。就實驗動物而言，雖然在許多種類的動物中都能制作重現(xiàn)性好的中風(fēng)模型，但往往動物物種越大，越不易操作，定位差異性越大，且缺血損傷越大，動物存活率越??；而就動物模型的種類而言，按照缺血范圍的大小，可分為全腦缺血模型和局部缺血模型，頸總動脈閉合模型(CCAO)手術(shù)難度較大，造模的成功率也不高；大腦中動脈閉合模型(MCAO)，損傷的范圍和面積不完全可控，其空間分辨率也不夠高，無法將損傷特異地局限在較小的腦區(qū)，且腦缺血損傷的個體差異較大；光化學(xué)誘導(dǎo)模型是最易于操作的動物模型，其空間分辨率較高，損傷位置精確可控，由于組織損傷可以自發(fā)恢復(fù)，與臨床上中風(fēng)病人的情況相似，更能模擬缺血性中風(fēng)的整個病程。因此采用小鼠作為實驗對象，利用光化學(xué)栓塞的方法誘導(dǎo)局部缺血性中風(fēng)模型，不僅價廉、損傷小、定位較準(zhǔn)、重現(xiàn)性好，且小鼠的血管解剖更近于人，更能模擬臨床上小中風(fēng)的慢性發(fā)展病程。

缺血性中風(fēng)后往往導(dǎo)致神經(jīng)損傷，神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生死亡，隨后大量膠質(zhì)細(xì)胞增生形成膠質(zhì)疤痕。研究進(jìn)展表明膠質(zhì)疤痕對于神經(jīng)損傷雖有保護(hù)作用，避免了神經(jīng)損傷的繼續(xù)擴(kuò)大，但密集的膠質(zhì)疤痕在后期不僅妨礙了新生血管、新生神經(jīng)細(xì)胞遷移進(jìn)入神經(jīng)損傷部位，也妨礙了任何藥物穿透進(jìn)入損傷部位實現(xiàn)神經(jīng)損傷修復(fù)的功效。目前，組織纖溶酶原活化因子(tPA)廣泛應(yīng)用于治療中風(fēng)后4.5小時內(nèi)的患者。但是，100多個擬治療中風(fēng)后神經(jīng)損傷的新藥臨床試驗均以失敗告終。盡管這些臨床失敗的原因仍然不完全清楚，膠質(zhì)疤痕可能是妨礙這些藥物順利到達(dá)損傷部位從而發(fā)揮應(yīng)有功效的重要原因之一。因此，要實現(xiàn)中風(fēng)后神經(jīng)損傷部位的修復(fù)，需要先消融或減少膠質(zhì)細(xì)胞的密度，使治療藥物能到達(dá)損傷部位，同時使新生血管、新生神經(jīng)細(xì)胞能夠遷移生長進(jìn)入損傷部位，最終才能真正實現(xiàn)神經(jīng)損傷后的修復(fù)。研究具有減少膠質(zhì)細(xì)胞疤痕密度的新藥可能是治療中風(fēng)后神經(jīng)損傷的關(guān)鍵，具有重大的臨床意義和經(jīng)濟(jì)價值。

阿魏酸(Ferulic Acid,FA)，化學(xué)名稱為3-(4-羥基-3-甲氧基苯)-丙烯酸，3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propenoic acid，又稱4-羥基-3-甲氧基肉桂酸、3-甲氧基-4-羥基肉桂酸，是桂皮酸(又稱肉桂酸)的衍生物之一。阿魏酸水溶性差，因此常用其鈉鹽，阿魏酸鈉(sodium ferulate,SF))。阿魏酸(阿魏酸鈉)具有抗血小板聚集，抑制血小板5-羥色胺釋放，抑制血小板血栓素a2(txa2)的生成，增強(qiáng)前列腺素活性，鎮(zhèn)痛，緩解血管痙攣等藥理作用，此外，阿魏酸在抗炎、抗氧化、清除促自由基產(chǎn)生的酶等方面具有較強(qiáng)的藥理學(xué)活性。阿魏酸能增加冠脈血流量，保護(hù)缺血心肌，由于對α受體有阻斷作用，因而能抑制主動脈平滑肌收縮，對抗甲氯胺、苯腎上腺素β腎上腺素等的升壓作用。阿魏酸鈉有利于改善心肌對氧的供需失衡。還具有抗血小板聚集作用，采用阿魏酸鈉預(yù)處理能減少缺血后的神經(jīng)元凋亡的發(fā)生。然而，阿魏酸鈉抗血小板作用的機(jī)理與環(huán)氧化酶抑制劑阿斯匹林不盡相同，兩者對血栓素A2和動脈壁前列環(huán)素增物質(zhì)的作用各有特點(diǎn)。有研究采用大鼠對為實驗動物，結(jié)果表明阿魏酸與小劑量阿斯匹林聯(lián)用可增強(qiáng)抗血小板作用。阿魏酸鈉抑制血小板聚集和釋放反應(yīng)作用可能與抑制血小板前列腺素代謝，即抑制TXA2生成有關(guān)；實驗犬缺血前10min靜注阿魏酸鈉，開胸后分別結(jié)扎冠狀動脈前降支第3、第2和第1分枝，最后結(jié)扎其主干進(jìn)行缺血，實驗結(jié)果證實阿魏酸鈉有明顯抗缺血心肌再灌注損傷作用；用普通玻璃微電極細(xì)胞內(nèi)記錄觀察阿魏酸鈉對豚鼠心室肌細(xì)胞動作電位、有效不應(yīng)期的影響，3種濃度的阿魏酸鈉溶液(0.1mg/ml,0.2mg/ml,0.4mg/ml)分別灌流30min，動作電位幅值和復(fù)極20％時程無明顯改變，但復(fù)極90％處動作電位時程與有效不應(yīng)期延長。濃度在0.1mg/ml和0.2mg/ml時，藥物可延長復(fù)極50％處的動作電位時程。這些實驗結(jié)果表明，阿魏酸對心腦血管疾病的治療有顯著的作用，但是阿魏酸對于腦組織缺血損傷的影響并未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于利用阿魏酸降低缺血對腦組織損傷的影響，減少或消融膠質(zhì)疤痕以促進(jìn)神經(jīng)損傷的修復(fù)過程，最終實現(xiàn)中風(fēng)疾病的治療。

本發(fā)明為阿魏酸直接用于制備藥物或作為藥物添加劑制備其他藥物應(yīng)用于改善或修復(fù)腦組織缺血損傷。

本發(fā)明為阿魏酸直接在用于制備藥物或作為藥物添加劑制備其他藥物促進(jìn)腦組織缺血損傷而引起的小中風(fēng)疾病治療的應(yīng)用。

本發(fā)明為阿魏酸直接在用于制備藥物或作為藥物添加劑制備其他藥物促進(jìn)膠質(zhì)疤痕的減少或消融的應(yīng)用。

本發(fā)明為阿魏酸直接用于制備藥物或作為添加劑制備其它藥物促進(jìn)神經(jīng)損傷后的修復(fù)過程，預(yù)防或治療與膠質(zhì)細(xì)胞過度增生相關(guān)的神經(jīng)組織損傷或相關(guān)疾病。

本發(fā)明為阿魏酸減小或消融膠質(zhì)疤痕，因而直接用于制備藥物或作為添加劑制備其它藥物，應(yīng)用于神經(jīng)損傷后的膠質(zhì)疤痕治療，最終有助于神經(jīng)損傷修復(fù)。

本發(fā)明為阿魏酸直接用于制備藥物或作為添加劑制備其它藥物，用于預(yù)防或治療與膠質(zhì)疤痕相關(guān)的其它特定疾病。

優(yōu)選的，所述特定疾病是指專業(yè)上顯而易見的膠質(zhì)細(xì)胞過度增生形成膠質(zhì)疤痕因而妨礙了神經(jīng)損傷后的修復(fù)。

優(yōu)選的，所述特定疾病是指血管性癡呆癥、老年癡呆癥和脊髓損傷。

在疾病分類中，將腦局限缺血所引起的臨表現(xiàn)于24小時內(nèi)完全消失，不留任何腦局灶損害的體征，作為短暫性腦缺血發(fā)作的最重要標(biāo)準(zhǔn)，由于癥狀和體征的持續(xù)時間較短，大多數(shù)病人為數(shù)分鐘至幾十分鐘，是腦卒中這組疾病中臨床表現(xiàn)最輕的，故又稱小中風(fēng)。小中風(fēng)是供應(yīng)腦血液循環(huán)的動脈發(fā)生損害，引起腦病變而有相應(yīng)的功能障礙。隨著受損害血管的不同，每個病人的臨床表現(xiàn)各異。小中風(fēng)的征象，基本上可分為頸內(nèi)動脈和椎基底動脈兩大系統(tǒng)，屬于前者主要有一側(cè)手足無力、麻木、失語、單眼視朦或失明等；而后者則是眩暈、復(fù)視、構(gòu)音或吞咽困難、唇舌發(fā)麻、跌倒發(fā)作等。而經(jīng)過本發(fā)明的小鼠試驗，發(fā)現(xiàn)小中風(fēng)和膠質(zhì)疤痕有著直接的關(guān)系，在本發(fā)明中，阿魏酸具有抗血小板聚集，抑制血小板5-羥色胺釋放，抑制血小板血栓素a2(txa2)的生成，增強(qiáng)前列腺素活性，鎮(zhèn)痛，緩解血管痙攣等作用，而且對于膠質(zhì)疤痕形成的初期有明顯的抑制和修復(fù)作用，促進(jìn)腦組織缺血損傷修復(fù)，特別是小中風(fēng)5小時以內(nèi)給藥，效果十分理想，無明顯中風(fēng)后遺癥，愈后較好。

盡管本發(fā)明是以中風(fēng)導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞疤痕為例闡述阿魏酸減少膠質(zhì)細(xì)胞疤痕的功效為基礎(chǔ)的應(yīng)用。許多慢性疾病如血管性癡呆癥、老年癡呆癥、脊髓損傷等也廣泛存在過度增生的膠質(zhì)疤痕問題。本發(fā)明還包括這些在專業(yè)上顯而易見的應(yīng)用范圍。

本發(fā)明中，上述涉及的阿魏酸功效，減少或消融膠質(zhì)細(xì)胞疤痕，是阿魏酸通過促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP陽性細(xì)胞)的重編程，把膠質(zhì)細(xì)胞在原位轉(zhuǎn)化為新生的神經(jīng)細(xì)胞(NeuN陽性細(xì)胞)，從而不僅減少或消融膠質(zhì)疤痕，也直接促進(jìn)神經(jīng)組織的修復(fù)。本發(fā)明所述的腦疾病或腦損傷是指缺血性腦中風(fēng)以及顯而易見的膠質(zhì)細(xì)胞過度增生相關(guān)疾病或損傷。所述的GFAP陽性細(xì)胞，是指膠質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)的膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillaryacid protein(GFAP))，被認(rèn)為是用免疫組化方法檢測膠質(zhì)細(xì)胞的一個典型標(biāo)記分子。本發(fā)明所述的阿魏酸在病灶形成5 h內(nèi)口服一次，每次10 mg/kg，可有效減小腦組織缺血灶的面積，并對因腦組織缺血而產(chǎn)生的膠質(zhì)疤痕具有一定的抑制和修復(fù)作用，對于治療和預(yù)防小中風(fēng)有著重要的作用和意義。

本發(fā)明要解決的問題是,為阿魏酸對腦組織缺血損傷修復(fù)以及對小中風(fēng)中膠質(zhì)疤痕的抑制和修復(fù)提供理論依據(jù)。

為解決上述問題，本發(fā)明采用以下方案：

1阿魏酸腹腔給藥治療昆明小鼠缺血性中風(fēng)的量-效關(guān)系研究

1.1實驗動物

該實驗所使用的實驗動物為SPF級昆明品系小鼠，雄性，體重20-25 g，合格證號為SCXK(滇)2015-0002。實驗動物飼養(yǎng)于云南巔青生物科技有限公司動物房實驗鼠單體換氣籠盒系統(tǒng)(IVC)中，實驗設(shè)施編號為13-11-078、13-11-079，生產(chǎn)日期為2013年11月24日。室溫控制在20-25℃，濕度40-70％，12小時照明，12小時黑暗，開燈時間：7：00am，關(guān)燈時間：19：00pm。每周更換兩次鼠盒及墊料。飼養(yǎng)方式為群養(yǎng)，每籠10只。飼喂蘇州雙獅實驗動物飼料科技有限公司生產(chǎn)的滅菌飼料，飼料合格證號：(2009)05032。每籠每天供給一次飼料，自由攝食。用飲水盒供應(yīng)自來水，由動物自由飲用。受試品為阿魏酸，批號：110773-201313，分子量為194.19。實驗設(shè)置阿魏酸不同劑量組(0.3 mg/kg、1 mg/kg、3 mg/kg、6 mg/kg)、溶媒對照組(陰性對照)。

1.2實驗步驟

采用光化學(xué)誘導(dǎo)小鼠海馬缺血性中風(fēng)模型。腹腔注射玫瑰紅(RB，100 mg/kg)，隨后腹腔注射戊巴比妥鈉(約80 mg/kg)麻醉動物。用鑷子夾后腳腳掌中部無反應(yīng)后把大鼠頭部的毛剃掉，將鹽酸布魯卡因注入小鼠頭皮內(nèi)部，期間需要一直供氧；待普魯卡因在小鼠腦部擴(kuò)散均勻(約5min)之后，用手術(shù)刀片劃開頭皮。將內(nèi)部的結(jié)締組織清理干凈，露出清潔的顱骨。隨后使用腦立體定位儀固定動物頭部，參照腦立體定位操作規(guī)范調(diào)整左右前后水平，再根據(jù)大鼠腦圖譜找出所需要的坐標(biāo)(小鼠海馬定位：x:2.0 mm；y:2.5 mm；h:1.4 mm)，在顱骨的上進(jìn)行標(biāo)點(diǎn)，鉆孔；將光纖插入小鼠腦內(nèi)，腹腔注射玫瑰紅后1小時，給予藍(lán)色激光(473 nm)照射20 min，光強(qiáng)30 mw。

給藥方式：腹腔注射給予治療藥物阿魏酸及對照組生理鹽水。

給藥時間：缺血后立即給藥。

光栓缺血后24 h處死動物，取出大腦(切除小腦和嗅球)，將腦置于人工腦脊液環(huán)境下進(jìn)行切片(厚度為350m)，把腦片放置于PH值為7.4的4％TTC染液中，于37℃避光孵育染色15min，然后取出腦片放入多聚甲醛(PFA)液中固定15min。正常腦組織染成紅色，呈白色部分為缺血腦區(qū)。與對照組對比，根據(jù)缺血最大面積、缺血體積等評價參數(shù)評價藥物對缺血損傷的影響及程度。

檢測指標(biāo)：缺血體積，缺血最大面積。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計：ImageJ統(tǒng)計缺血斑面積；運(yùn)用SPSS 11.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(Independent-Samples T-test)，顯示的結(jié)果為mean±SEM，顯著差異設(shè)置為P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，P>0.05為差異不顯著。運(yùn)用Origin 8.0繪制統(tǒng)計圖。

1.3實驗結(jié)果

1.3.1阿魏酸腹腔給藥治療小鼠缺血性中風(fēng)的劑量-效應(yīng)關(guān)系研究(表1)

表1不同劑量阿魏酸腹腔給藥對治療小鼠缺血性中風(fēng)梗死區(qū)域的比較

注：^*P<0.05；^**P<0.01；^***P<0.001(vs.Saline)。

結(jié)果顯示，缺血性中風(fēng)模型造模后，給予小鼠阿魏酸治療，各劑量阿魏酸的缺血灶最大面積和體積低于對照組。其中1mg/kg、3mg/kg劑量組的缺血灶最大面積和體積與生理鹽水組比較均顯著降低(P<0.01)，表明阿魏酸腹腔對降低急性期缺血灶最大面積和體積有良好的劑量效應(yīng)關(guān)系。說明阿魏酸對小鼠缺血性中風(fēng)腦組織缺血損傷具有良好的修復(fù)作用。

2阿魏酸灌胃給藥治療缺血性中風(fēng)的量-效關(guān)系和時-效關(guān)系研究

2.1實驗動物

該實驗所使用的實驗動物為SPF級昆明品系小鼠，雄性，體重20-25g，合格證號為SCXK(滇)2015-0002。實驗動物飼養(yǎng)于云南巔青生物科技有限公司動物房實驗鼠單體換氣籠盒系統(tǒng)(IVC)中，實驗設(shè)施編號為13-11-078、13-11-079，生產(chǎn)日期為2013年11月24日。室溫控制在20-25℃，濕度40-70％，12小時照明，12小時黑暗，開燈時間：7：00am，關(guān)燈時間：19：00pm。每周更換兩次鼠盒及墊料。飼養(yǎng)方式為群養(yǎng)，每籠10只。飼喂蘇州雙獅實驗動物飼料科技有限公司生產(chǎn)的滅菌飼料，飼料合格證號：(2009)05032。每籠每天供給一次飼料，自由攝食。用飲水盒供應(yīng)自來水，由動物自由飲用。受試品為阿魏酸，批號：110773-201313，分子量為194.19，在水、乙醇、甲基叔丁基醚、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜中易溶。實驗設(shè)置阿魏酸不同劑量組(1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg)、溶媒對照組。

2.2實驗步驟

采用光化學(xué)誘導(dǎo)小鼠海馬缺血性中風(fēng)模型。腹腔注射玫瑰紅(RB，100mg/kg)，隨后腹腔注射戊巴比妥鈉(約80mg/kg)麻醉動物。用鑷子夾后腳腳掌中部無反應(yīng)后把大鼠頭部的毛剃掉，將鹽酸布魯卡因注入小鼠頭皮內(nèi)部，期間需要一直供氧；待普魯卡因在小鼠腦部擴(kuò)散均勻(約5min)之后，用手術(shù)刀片劃開頭皮。將內(nèi)部的結(jié)締組織清理干凈，露出清潔的顱骨。隨后使用腦立體定位儀固定動物頭部，參照腦立體定位操作規(guī)范調(diào)整左右前后水平，再根據(jù)大鼠腦圖譜找出所需要的坐標(biāo)(小鼠海馬定位：x:2.0mm；y:2.5mm；h:1.4mm)，在顱骨的上進(jìn)行標(biāo)點(diǎn)，鉆孔；將光纖插入小鼠腦內(nèi)，腹腔注射玫瑰紅后1小時，給予藍(lán)色激光(473nm)照射20min，光強(qiáng)30mw。

給藥方式：灌胃給予治療藥物阿魏酸及對照組生理鹽水。

給藥時間：光栓缺血后立即灌胃給藥或光栓缺血后0h、3h、5h分別灌胃給藥。

光栓缺血后24h處死動物，取出大腦(切除小腦和嗅球)，將腦置于人工腦脊液環(huán)境下進(jìn)行切片(厚度為350m)，把腦片放置于PH值為7.4的4％TTC染液中，于37℃避光孵育染色15min，然后取出腦片放入多聚甲醛(PFA)液中固定15min。正常腦組織染成紅色，白色部分為缺血腦區(qū)。與對照組對比，根據(jù)有缺血斑的腦片數(shù)、缺血斑面積、缺血斑體積等評價參數(shù)評價藥物對缺血損傷的影響及程度。

檢測指標(biāo)：缺血斑體積，缺血斑最大面積。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計：ImageJ統(tǒng)計缺血斑面積；運(yùn)用SPSS 11.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(Independent-Samples T-test)，顯示的結(jié)果為mean±SEM，顯著差異設(shè)置為P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，P>0.05為差異不顯著。運(yùn)用Origin 8.0繪制統(tǒng)計圖。

2.3實驗結(jié)果

2.3.1阿魏酸灌胃給藥治療缺血性中風(fēng)的量-效關(guān)系研究(表2)

表2不同劑量阿魏酸灌胃給藥對治療小鼠缺血性中風(fēng)梗死區(qū)域的比較

注：^*P<0.05；^**P<0.01；^***P<0.001(vs.Saline).

實驗結(jié)果顯示，阿魏酸中劑量組(3mg/kg)、阿魏酸高劑量組(10mg/kg)缺血灶最大面積和體積與生理鹽水組均有顯著性差異(P<0.05)，其中阿魏酸(10mg/kg)劑量組缺血灶最大面積和體積與生理鹽水組有極顯著差異(P<0.001)，表明口服阿魏酸對降低急性期缺血灶最大面積和體積有良好的劑量效應(yīng)關(guān)系。

2.3.2阿魏酸(10mg/kg)不同時間點(diǎn)灌胃給藥治療缺血性中風(fēng)的時-效關(guān)系研究(表3)

表3阿魏酸(10mg/kg)不同時間點(diǎn)灌胃給藥對治療小鼠缺血性中風(fēng)梗死區(qū)域的比較

注：^*P<0.05；^**P<0.01；^***P<0.001[vs.FA(0h)].

結(jié)果表明，急性缺血后0h、3h口服阿魏酸(10mg/kg)，小鼠缺血灶最大面積與生理鹽水組比較均有顯著性差異(P<0.05)，且急性缺血后5h口服阿魏酸(10mg/kg)，小鼠缺血灶最大面積與缺血后0h口服阿魏酸組比較有顯著差異(P<0.05)；急性缺血后3h、5h口服阿魏酸(10mg/kg)，小鼠缺血灶體積與生理鹽水組比較均有顯著性差異(P<0.05)，且缺血后3h口服阿魏酸(10mg/kg)，小鼠缺血灶體積與缺血后0h口服阿魏酸組比較有顯著差異(P<0.05)。表明口服阿魏酸對降低急性期缺血灶最大面積和體積有良好的時間效應(yīng)關(guān)系且有效治療時間窗為中風(fēng)后0～5h。

3阿魏酸對缺血性中風(fēng)模型導(dǎo)致的膠質(zhì)細(xì)胞疤痕的影響

3.1實驗動物

該實驗所使用的實驗動物為SPF級昆明品系小鼠，雄性，體重20-25g，合格證號為SCXK(滇)2015-0002。實驗動物飼養(yǎng)于云南巔青生物科技有限公司動物房實驗鼠單體換氣籠盒系統(tǒng)(IVC)中，實驗設(shè)施編號為13-11-078、13-11-079，生產(chǎn)日期為2013年11月24日。室溫控制在20-25℃，濕度40-70％，12小時照明，12小時黑暗，開燈時間：7：00am，關(guān)燈時間：19：00pm。每周更換兩次鼠盒及墊料。飼養(yǎng)方式為群養(yǎng)，每籠10只。飼喂蘇州雙獅實驗動物飼料科技有限公司生產(chǎn)的滅菌飼料，飼料合格證號：(2009)05032。每籠每天供給一次飼料，自由攝食。用飲水盒供應(yīng)自來水，由動物自由飲用。受試品為阿魏酸，批號：110773-201313，分子量為194.19，在水、乙醇、甲基叔丁基醚、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜中易溶。實驗設(shè)置阿魏酸給藥組(10mg/kg)、溶媒對照組。

3.2實驗步驟

采用光化學(xué)誘導(dǎo)小鼠海馬缺血性中風(fēng)模型。腹腔注射玫瑰紅(RB，100mg/kg)，隨后腹腔注射戊巴比妥鈉(約80mg/kg)麻醉動物。用鑷子夾后腳腳掌中部無反應(yīng)后把大鼠頭部的毛剃掉，將鹽酸布魯卡因注入小鼠頭皮內(nèi)部，期間需要一直供氧；待普魯卡因在小鼠腦部擴(kuò)散均勻(約5min)之后，用手術(shù)刀片劃開頭皮。將內(nèi)部的結(jié)締組織清理干凈，露出清潔的顱骨。隨后使用腦立體定位儀固定動物頭部，參照腦立體定位操作規(guī)范調(diào)整左右前后水平，再根據(jù)大鼠腦圖譜找出所需要的坐標(biāo)(小鼠海馬定位：x:2.0mm；y:2.5mm；h:1.4mm)，在顱骨的上進(jìn)行標(biāo)點(diǎn)，鉆孔；將光纖插入小鼠腦內(nèi)，腹腔注射玫瑰紅后1小時，給予藍(lán)色激光(473nm)照射20min，光強(qiáng)30mw。

給藥方式：灌胃給予治療藥物阿魏酸及對照組生理鹽水。

給藥時間：光栓缺血后立即灌胃給藥。

光栓缺血后7d片將小鼠用戊巴比妥鈉(60mg/kg)麻醉。用pH值為7.4的0.1M PBS50ml和pH值為7.4的4％PFA 50ml灌流和固定。隨后取出腦組織，放入上述相同4％PFA溶液中4℃固定2d。將后固定好的組織分別放入15％和30％蔗糖生理鹽水溶液中4℃脫水各1d。將脫水后的組織進(jìn)行冠狀切片，腦片厚度為40μm。將腦片用0.1M PBS洗脫3次，每次10分鐘，用封閉液(5％羊血清，0.1％TritonX-100，PBS溶解并稀釋)室溫封閉1小時，再分別用一抗(GFAP,Abcam；稀釋液：5％羊血清，0.1％TritonX-100，PBS溶解稀釋)孵育，4℃過夜。將孵育過一抗的切片用0.1M PBS溶液洗脫4次，每次10min，再孵育二抗(ab64261，Abcam)，室溫1小時。將孵育過二抗的切片用0.1M PBS溶液洗脫4次，每次10min，再孵育鏈霉親和素-過氧化物酶(ab64261，Abcam)，室溫30min，0.1M PBS溶液洗脫4次，每次10min。然后DAB染色液染色1～5分鐘，0.1M PBS溶液洗脫3次，每次10min。再貼附在防脫載玻片上，經(jīng)70％、80％、90％、95％、100％、100％乙醇脫水各2min，再經(jīng)二甲苯透明2次，每次5min，，并用中性樹膠封片。置于顯微鏡下觀察、拍照(FV1000，Olympus)。

檢測指標(biāo)：GFAP陽性細(xì)胞。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計：Cellsense Standard統(tǒng)計缺血斑面積；運(yùn)用SPSS 11.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(Independent-Samples T-test)，顯示的結(jié)果為mean±SEM，顯著差異設(shè)置為P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，P>0.05為差異不顯著。運(yùn)用Origin 8.0繪制統(tǒng)計圖。

3.3實驗結(jié)果

3.3.1阿魏酸對小鼠缺血性中風(fēng)GFAP陽性細(xì)胞區(qū)域的影響(表4)

表4阿魏酸對小鼠缺血性中風(fēng)GFAP陽性細(xì)胞區(qū)域的影響

通過GFAP免疫組化染色顯示，在小鼠缺血性中風(fēng)后7天，中風(fēng)部位顯示了大量密集的星形膠質(zhì)細(xì)胞，其長偽足相互鉸鏈形成膠質(zhì)疤痕。阿魏酸灌胃給藥后，GFAP陽性表達(dá)的星形膠質(zhì)細(xì)胞區(qū)域面積和體積與對照組比較有所降低，不僅膠質(zhì)細(xì)胞有所減少，其膠質(zhì)細(xì)胞的偽足突出變短，表明阿魏酸能顯著的減小或消融膠質(zhì)疤痕。

從上述實驗結(jié)果可知，在缺血中風(fēng)模型造模后，腹腔給予小鼠阿魏酸，在0.3mg/kg～3mg/kg劑量范圍內(nèi)，小鼠缺血灶最大面積和體積隨劑量而呈降低趨勢，其中1mg/kg、3mg/kg劑量組能極顯著降低小鼠缺血灶最大面積和體積(P<0.01)；在缺血中風(fēng)模型造模后，灌胃給予小鼠阿魏酸，在1mg/kg～10mg/kg劑量范圍內(nèi)，小鼠缺血灶最大面積和體積隨劑量而呈降低趨勢，其中10mg/kg劑量組能極顯著降低小鼠缺血灶最大面積和體積(P<0.001)；在缺血中風(fēng)模型造模后，灌胃給予小鼠阿魏酸(10mg/kg)，在0h～5h時間范圍內(nèi)，小鼠缺血灶最大面積和體積隨劑量而呈先降低后升高趨勢，其中缺血后3h給藥，能極顯著減小小鼠缺血灶最大面積和體積；在缺血中風(fēng)模型造模后，灌胃給予小鼠阿魏酸(10mg/kg)，能降低GFAP陽性表達(dá)的星形膠質(zhì)細(xì)胞區(qū)域面積，減少膠質(zhì)細(xì)胞，并使其偽足突出變短。

本發(fā)明的特點(diǎn)和創(chuàng)造性在于，本發(fā)明中阿魏酸主要是減少或消融膠質(zhì)細(xì)胞疤痕，這是阿魏酸通過促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP陽性細(xì)胞)的重編程，把膠質(zhì)細(xì)胞在原位轉(zhuǎn)化為新生的神經(jīng)細(xì)胞(NeuN陽性細(xì)胞)，從而不僅減少或消融膠質(zhì)疤痕，也直接促進(jìn)神經(jīng)組織的修復(fù)。突破了現(xiàn)有技術(shù)對阿魏酸的認(rèn)識，認(rèn)為阿魏酸僅具有抗血小板聚集的作用，采用阿魏酸鈉預(yù)處理能減少缺血后的神經(jīng)元凋亡的發(fā)生。本發(fā)明所述的腦疾病或腦損傷是指缺血性腦中風(fēng)以及顯而易見的膠質(zhì)細(xì)胞過度增生相關(guān)疾病或損傷。本發(fā)明口服即可有效減小腦組織缺血灶的面積，并對因腦組織缺血而產(chǎn)生的膠質(zhì)疤痕具有一定的抑制和修復(fù)作用，對于治療和預(yù)防小中風(fēng)有著重要的作用和意義。

因此，阿魏酸腹腔注射和灌胃給藥對小鼠缺血性中風(fēng)腦組織缺血損傷具有良好的改善和修復(fù)作用，有效治療時間窗為中風(fēng)后0h～5h，并對腦組織缺血而產(chǎn)生的膠質(zhì)疤痕具有一定的抑制和修復(fù)作用，并且阿魏酸毒性低，適于臨床給藥，對于治療小中風(fēng)有著重要的作用和意義。