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納米顆粒組合物用作標(biāo)靶癌癥干細(xì)胞和處理癌癥的方法與流程

文檔序號(hào):12481661閱讀:846來(lái)源:國(guó)知局
納米顆粒組合物用作標(biāo)靶癌癥干細(xì)胞和處理癌癥的方法與流程

本發(fā)明關(guān)于復(fù)合納米顆粒用于靶向癌癥干細(xì)胞和治療癌癥的方法。

發(fā)明背景

人們提出不同的方法來(lái)治療不同類(lèi)型的癌癥。有的建議是用標(biāo)靶癌癥細(xì)胞的方法來(lái)治療癌癥。然而,在表面標(biāo)靶癌細(xì)胞一直是個(gè)挑戰(zhàn),因?yàn)閷?shí)現(xiàn)高效特異性靶向在目前來(lái)說(shuō)仍然是困難的。如果一種治療方法不能有效地標(biāo)靶問(wèn)題細(xì)胞,那么治療的效力會(huì)被削弱,更糟糕的是,會(huì)引起不良副作用。

本發(fā)明旨在解決上述問(wèn)題,或至少向公眾提供一種有用的替代方案。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

根據(jù)該本發(fā)明的第一方面,這里提供復(fù)合納米顆粒包含核心部分,其含有作為熱源的磁性納米顆粒和用于治療癌癥組織的化療劑;外殼部分,其包覆著所述核心部分;抗體,其連接在所述外殼表面并用于靶向癌癥干細(xì)胞。在具體的實(shí)施方式中,該復(fù)合納米顆??赏瑫r(shí)包含用于在活的有機(jī)體內(nèi)定位的熒光染料。

所述外殼部分由二氧化硅或二氧化硅基材料制成。所述復(fù)合納米顆粒的直徑或?qū)挾然旧蠟?至500納米的范圍。所述外殼部分厚度可為10至100納米。所述磁性納米顆粒的直徑或?qū)挾瓤蔀?至50納米。

該磁性納米顆粒是磁響應(yīng)的,根據(jù)不同應(yīng)用的需求,可以為鐵磁性或超順磁性納米顆粒。該磁性納米顆粒可對(duì)交變磁場(chǎng)產(chǎn)生響應(yīng)。該磁性納米顆粒的化學(xué)組成為Fe3O4。

化療藥物包含但不限于熱休克蛋白抑制劑。在此實(shí)施方式中,該熱休克蛋白抑制劑是臨床批準(zhǔn)的藥物,盡管在其他的實(shí)施方式中,其他化療劑也可被使用。該抗體可被連接在所述外殼的外表面上。該抗體可能夠靶向到差異化集群分子或癌癥干細(xì)胞的其他表面分子。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面,這里提供利用靶向癌癥干細(xì)胞來(lái)處理癌癥的方法,包含施用如上述描述的復(fù)合納米顆粒。

該方法可包括制備該納米顆粒與靶向癌癥干細(xì)胞的步驟。

該方法通過(guò)暴露在納米顆粒表面的抗體靶向癌細(xì)胞,經(jīng)外加交變磁場(chǎng)作用,核心部分產(chǎn)生的熱量不僅可用于破壞癌細(xì)胞,而且促進(jìn)化療藥物釋放,從而協(xié)同地治療癌癥可包括一個(gè)步驟曝露標(biāo)靶位置,該癌癥細(xì)胞于該標(biāo)靶位置停留在能量源以影響該磁性納米顆粒的溫度上升和從該外殼部分釋放該化學(xué)治療劑以在該標(biāo)靶位置破壞該組合物-癌癥細(xì)胞的復(fù)合物的該癌癥細(xì)胞,其中交變磁場(chǎng)作為能量源,通過(guò)控制交變磁場(chǎng)的物理參數(shù)可以控制溫度上升和藥物釋放的過(guò)程。

根據(jù)不同的應(yīng)用,該方法可控制提升標(biāo)靶位置的溫度至40℃-52℃。

在一實(shí)施方式中,該方法以每公斤體重靜脈注射10μg至500mg的所述復(fù)合納米顆粒的劑量。該方法可包括每周一次施用所述復(fù)合納米顆粒。

根據(jù)該本發(fā)明的第三方面,這里利用上述復(fù)合納米顆粒來(lái)處理癌癥。

根據(jù)該本發(fā)明的第四方面,這里提供在生物體中處理癌癥的方法,包含對(duì)生物體至少每周一次施用熱療和化療的組合處理的步驟。該方法可包含在接受熱療/化療組合時(shí)利用熒光成像或磁性共振成像識(shí)別標(biāo)靶組織的步驟。該方法可包含使用處理器以控制交替磁性場(chǎng)的功率和頻率來(lái)調(diào)節(jié)標(biāo)靶組織的溫度上升的步驟。

附圖說(shuō)明

本發(fā)明的一些實(shí)驗(yàn)步驟將參照附圖進(jìn)行解釋?zhuān)渲校?

圖1A是本發(fā)明中復(fù)合納米顆粒的示意圖;

圖1B是本發(fā)明中實(shí)施的處理方法,復(fù)合納米顆粒靶向肺癌干細(xì)胞(LCSCs),通過(guò)施用交變磁場(chǎng)(AMF)來(lái)同時(shí)做熱療和化療的示意圖;

圖1C,1D和1E分別是Fe3O4@SiNPs,CD20-Fe3O4@SiNPs,和CD20-Fe3O4@SiNPs的透射電子顯微鏡(TEM)影像;

圖1F通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射(DLS)得到CD20-Fe3O4@SiNP的尺寸分布情況;

圖1G顯示Fe3O4@SiNPs(綠色)和CD20-Fe3O4@SiNPs(紅色)的澤塔(zeta)電位;

圖1H是藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的CD20及該CD20-PE抗體修飾的納米粒子CD20-Fe3O4@SiNPs的熒光光譜;

圖2A,2B分別表示i)Fe3O4@SiNPs,ii)Fe3O4NPs的磁滯回曲線;圖2C表示PBS,SiNPs和Fe3O4@SiNPs的溶液溫度隨AMF處理時(shí)間的變化過(guò)程;圖2D表示SiNPs和HSPI加載的Fe3O4@SiNPs分別在有無(wú)磁場(chǎng)處理情況下的體外藥物釋放曲線。

圖3顯示肺癌干細(xì)胞(LCSCs)對(duì)CD20-Fe3O4@SiNPs和Fe3O4@SiNPs的體外細(xì)胞攝取和內(nèi)化的共聚焦熒光和透射電子顯微鏡(TEM)圖像;

圖4A顯示熱處理后LCSC的相對(duì)存活率;

圖4B顯示納米顆粒介導(dǎo)的熱療和化療的LCSC的相對(duì)存活率;

圖4C示出熱處理時(shí)間相關(guān)的LCSCs的7-AAD攝取和YO-PRO1標(biāo)記的點(diǎn)圖;

圖5是老鼠在靜脈注射(PE)-標(biāo)記的CD20-Fe3O4@SiNPs之后的在活的有機(jī)體內(nèi)和體外的影像;

圖6A,6B,6C,和6D是顯示在活的有機(jī)體內(nèi)同時(shí)熱療和化療標(biāo)靶LCSCs的圖表和影像,其中圖6A示出了在不同處理?xiàng)l件下不同組的老鼠(8只老鼠為一組)的相對(duì)瘤體積;圖6B示出了在不同處理?xiàng)l件下不同組的老鼠(8只老鼠為一組)的存活率;圖6C示出了在不同的處理?xiàng)l件下不同組的老鼠(8只老鼠為一組)的相對(duì)瘤重量;和圖6D示出了在不同的處理?xiàng)l件下不同組的老鼠(8只老鼠為一組)的瘤尺寸;

圖7A分別顯示了實(shí)驗(yàn)組(處理過(guò)CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs)和對(duì)照組(未使用復(fù)合納米顆粒處理)中H&E染色的老鼠腫瘤組織在AMF處理后第36天的的影像;

圖7B為異種移植上CD20的IHC染色顯示經(jīng)CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs處理的LCSC在磁場(chǎng)熱處理后完全消融的影像;

圖7C和圖7D-7F分別是以眼眶后靜脈竇或尾靜脈注射i)PBS和ii)CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs(D-F)經(jīng)磁場(chǎng)處理后老鼠腫瘤組織的TEM影像;

圖8是裸鼠各器官的病理影像;

圖9A,9B,9C和9D顯示CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs介導(dǎo)的AMF處理后的老鼠的i)WBC的數(shù)量和ii)B-細(xì)胞的變化,iii)有CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs的老鼠于7天痊愈后的WBC和B-細(xì)胞的百分比,iv)沒(méi)有CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs的老鼠于7天痊愈后的WBC和B-細(xì)胞的百分比,和iv)老鼠血細(xì)胞對(duì)CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs的攝取;

圖9E顯示了利用流式細(xì)胞儀監(jiān)控該老鼠骨髓內(nèi)的MSCs對(duì)CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs的攝??;

圖10A和圖10B分別是使用水作為陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)和PBS作為陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)的CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs在1mg/mL濃度的PBS的溶血評(píng)價(jià)結(jié)果;和淋巴細(xì)胞,單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析,和通過(guò)前向和側(cè)向散射分析白血細(xì)胞種群的嗜中性粒細(xì)胞;

圖11示出第3代LCSCs(圖11A)和第10代LCSCs(圖11F)的形態(tài);第3代LCSCs(圖11B-E)和第10代LCSCs(圖11G-J)的免疫熒光檢測(cè)干性標(biāo)志物表達(dá),比例尺=25μm;和定量RT-PCR分析不同世代LCSCs的干性基因表達(dá)(圖11K)(數(shù)據(jù)是平均值±SD,*P<0.05,**P<0.01表明顯著差異,n=3);

圖12包括由該第3代LCSCs(圖12A)和第10代LCSCs(圖12B)形成的第一級(jí)腫瘤球的影像,和隨時(shí)間變化的第一級(jí),第二級(jí),和第三級(jí)順序形成的腫瘤球,n=3(圖12C)的圖;

圖13A顯示使用傷口愈合試驗(yàn)評(píng)估LCSCs遷移,于受傷后0小時(shí),24小時(shí),和48小時(shí)對(duì)同一區(qū)域拍攝的影像;圖13B顯示通過(guò)傷口愈合試驗(yàn)評(píng)價(jià)LCSCs的遷移和侵襲能力圖13C為基質(zhì)膠轉(zhuǎn)孔(transwell)侵襲實(shí)驗(yàn)(數(shù)據(jù)表示該平均值±SD,*P<0.05和**p<0.01表明顯著差異,n=3)。

圖14為在活的有機(jī)體內(nèi)LCSCs和dLCSCs的致腫瘤性,圖14A為分別對(duì)裸鼠進(jìn)行皮下注射1×104LCSCs和dLCSCs后形成的異種移植瘤。

本專(zhuān)利或申請(qǐng)文件包含至少一個(gè)彩色附圖。根據(jù)當(dāng)局的要求將支付必要的費(fèi)用并提供具彩色附圖的本專(zhuān)利或申請(qǐng)文件。

該發(fā)明的具體實(shí)施方式

本發(fā)明關(guān)于通過(guò)同時(shí)使用化療和熱療來(lái)協(xié)同地靶向癌癥干細(xì)胞(CSCs)來(lái)處理癌癥的手段和方法。

在特定的實(shí)施方式中,該手段包括使用平均顆粒尺寸為5至500納米范圍的二氧化硅基材料的納米顆粒,包裹磁性核心和化療藥物,并在納米粒子表面連接特定的抗體來(lái)識(shí)別出癌癥細(xì)胞的表面標(biāo)志物并對(duì)抗腫瘤組織尤其是腫瘤組織中的CSCs。使用CSCs作為靶向目標(biāo)治療的策略主要是干預(yù)CSCs的生長(zhǎng)和繁殖。本發(fā)明使用納米顆粒基材料的組合熱療和化療是新穎的,如下所述,于癌癥處理中展示了顯著的效果。以CSCs作為靶向目標(biāo)是特別理想的,因?yàn)樗鼘?duì)腫瘤細(xì)胞的存活,增殖復(fù)發(fā),和轉(zhuǎn)移有著重要作用。通過(guò)利用抗體識(shí)別特定抗原將藥物運(yùn)送到腫瘤位置,結(jié)合加熱,可以在不破壞該周?chē)=M織的情況下進(jìn)一步增強(qiáng)治療效果。

本發(fā)明主要涉及一種復(fù)合納米顆粒,包含由磁性納米顆粒組成的核心部分,作為可加熱源;一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的和生物相容的二氧化硅外殼,用于容納所需或有效的化療藥物并提供功能性表面基團(tuán),用于連接抗體以靶向癌癥細(xì)胞。以下示出本發(fā)明中涉及的材料和方法。

材料和方法

由Fe3O4@SiNPs釋放的HSPI的體外分析

藥物釋放研究是在玻璃裝置中,于37℃下,以AMF進(jìn)行。該藥物被稱(chēng)為如上所述的復(fù)合納米顆粒。請(qǐng)參閱圖1A所示該納米顆粒組合物的結(jié)構(gòu)。該組合物可以被認(rèn)為是一個(gè)由熱敏磁性顆粒和抗癌藥物組成的核心,包覆抗體修飾的硅基外殼而成的復(fù)合納米顆粒。

首先,加載HSPI的Fe3O4@SiNPs分散在1mL培養(yǎng)基并置于10kDa分子量的透析袋。然后將該透析袋浸于9ml的PBS,利用攪拌器保持恒定溫度和攪拌,由AMF設(shè)備提供高頻交變磁場(chǎng)。定期從透析袋外部溶液中收集300mL溶液作為測(cè)試樣品,并補(bǔ)充與該體積相同的新鮮PBS。通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度法(PerkinElmer,PE Lamda 750,USA),以及濃度-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)方程分析HSPI的釋放量。對(duì)每個(gè)該樣品進(jìn)行三次該藥物釋放研究。

LCSCs攝取的多功能的納米顆粒

LCSCs(第3代)在24孔平板以1×104細(xì)胞/孔的密度接種于蓋玻片上,在37℃培養(yǎng)24小時(shí),然后與濃度為100μg/mL的PE-CD20標(biāo)記的Fe3O4@SiNPs(CD20-Fe3O4@SiNPs)和Fe3O4@SiNPs在37℃下分別培養(yǎng)1小時(shí)和24小時(shí)。用DAPI(1mg/mL)核染色5分鐘后,該細(xì)胞被洗滌,利用共聚焦顯微鏡(SPE,Leica,Germany)觀察。

體外標(biāo)靶的內(nèi)化

LCSCs(第3代)以1×104細(xì)胞/孔的密度被接種在24孔板上。培養(yǎng)24小時(shí)后,分別用100mg/ml的CD20-Fe3O4@SiNPs和Fe3O4@SiNPs處理細(xì)胞1小時(shí),并用PBS洗滌兩次。接著,在冷的0.1M的二甲胂酸鈉緩沖液中用2%戊二醛來(lái)收集并固定細(xì)胞至少2小時(shí)。該細(xì)胞隨后在0.2M二甲胂酸鈉緩沖液中用1%的四氧化鋨固定1小時(shí),然后在室溫溫度下用2%水鈾鹽染色30分鐘,接著通過(guò)濃度逐漸升高的乙醇溶液分級(jí)脫水。該超薄切片的樣本用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛染色后在透射電子觀察顯微鏡(TEM)(FEI/Philips Tecnai 12BioTWIN)下觀察。

在交變磁場(chǎng)(AMF)下的體外熱療和化療

該交變磁場(chǎng)(AMF)由3千瓦的交變磁場(chǎng)發(fā)生器供電給直徑5厘米8匝感應(yīng)線圈產(chǎn)生。LCSCs以5×104細(xì)胞/孔的密度被接種在6孔板上。孵育24小時(shí)后,細(xì)胞分別用100mg/ml的CD20-Fe3O4@SiNPs,CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs,F(xiàn)e3O4@SiNPs,HSPI&Fe3O4@SiNPs,SiNPs,和HSPI處理1小時(shí)。未經(jīng)處理的細(xì)胞作為對(duì)照。用PBS洗滌兩次后,細(xì)胞被置于該線圈內(nèi),加熱到一個(gè)限定溫度(37和50℃之間)30分鐘。保持恒定頻率在350kHz,使用溫度計(jì)浸在含有2mL溶液的試管中監(jiān)測(cè)溫度。使用傳統(tǒng)的加熱方法(水浴加熱器)與AMF加熱比較。細(xì)胞存活率利用MTT法評(píng)估。

流式細(xì)胞儀分析

為了檢測(cè)在AMF熱療和水浴加熱后的LCSCs的細(xì)胞凋亡情況,LCSCs用CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs進(jìn)行處理后用PBS洗滌,根據(jù)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)(YO-PRO-1/7-AAD,Invitrogen)對(duì)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行測(cè)試。簡(jiǎn)單地說(shuō),將待處理的細(xì)胞在暗黑中利用YO-PRO-1和7-AAD溶液染色30分鐘,和然后通過(guò)流式細(xì)胞儀分析(BD FACSCanto II system,BD Biosciences)。

建立人肺癌細(xì)胞的異種移植

BAL B/c裸鼠(5-6周齡和重15-20g)由伊利沙伯醫(yī)院(中國(guó)香港)提供,所有的動(dòng)物的培養(yǎng)和使用都遵從護(hù)理和使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物規(guī)定。為建立該腫瘤模型,在裸鼠的背部皮下注射LCSCs(3×104細(xì)胞/200μL)。每4天密切觀察每只小鼠的腫瘤生長(zhǎng)情況。腫瘤體積可以利用本公式計(jì)算:長(zhǎng)×寬×深×π/6。

溶血試驗(yàn)

紅血細(xì)胞(RBCs)從全血中以3000rpm離心5分鐘獲得,然后用鹽水洗滌三次。得到的RBC(100μL)用PBS稀釋至1ml。為了評(píng)價(jià)該溶血作用,500μL的稀釋RBC懸浮液與50μL的CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs(終濃度為1mg/mL)在37℃輕輕搖動(dòng)下孵育。所有實(shí)驗(yàn)中的溶血試驗(yàn)的最終體積為1.0mL。500μL稀釋的RBC懸浮液與500μL PBS混合孵育作為陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。相同份量的RBC與1mL水混合孵育作為陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。1小時(shí)后,將樣品在3000rpm速度下離心5分鐘。通過(guò)酶標(biāo)儀在540nm下測(cè)量上清液的吸光度。陽(yáng)性吸光度值應(yīng)為0.8±0.3,而陰性的應(yīng)小于0.03。利用下面的等式計(jì)算溶血百分比:

溶血率(%)=[(OD樣本-OD陰性)/(OD陽(yáng)性-OD陰性)]×100%

細(xì)胞的免疫分析

為了進(jìn)一步研究納米顆粒對(duì)老鼠免疫系統(tǒng)的副作用,在后注射的第1、2、3、4、5、6、7、和40天從NPs處理的老鼠體內(nèi)收集全血并加入抗凝劑。使用流式細(xì)胞儀的正向和側(cè)向散射分析使白血細(xì)胞種群進(jìn)入淋巴細(xì)胞,單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,和嗜中性粒細(xì)胞。使用對(duì)抗典型B-細(xì)胞抗原(CD20)的抗體來(lái)分析淋巴細(xì)胞中的B-細(xì)胞數(shù)量。沒(méi)有注射N(xiāo)Ps的老鼠作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

活體內(nèi)骨髓衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)對(duì)NPs的攝取情況

在活體內(nèi)骨髓衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)攝取NPs,根據(jù)前期工作,在注射納米粒子后的第40天,從NPs處理的老鼠體內(nèi)提取MSCs。使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀系統(tǒng)分析該純化MSCs。沒(méi)有注射N(xiāo)Ps的老鼠作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

多功能的納米顆粒在裸鼠體內(nèi)的分布

長(zhǎng)有肺癌腫瘤的老鼠經(jīng)眼眶后靜脈竇或尾靜脈注射CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs或HSPI&Fe3O4@SiNPs。利用活體成像系統(tǒng)(XenogenSpectrum)分別在注射后的0.5,1,2,和24小時(shí)拍攝影像。該裸鼠在24小時(shí)被處死并解剖,拍攝包括心,肝,脾,肺,腎的活體外器官影像。

熱療和化療組合在動(dòng)物模型的功效

在大約第10天,當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約100mm3,該老鼠被隨機(jī)分為五組(n=10):CD20-Fe3O4@SiNPs,CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs,HSPI&Fe3O4@SiNPs,CD20-HSPI@SiNPs,和PBS。每周一次通過(guò)眼眶后靜脈竇或尾靜脈注射樣品(50mg/kg)至裸鼠。在注射后的一天,該老鼠暴露于AMF(3千瓦的交變磁場(chǎng)發(fā)生器供電予直徑10cm、12匝感應(yīng)線圈)30分鐘(每星期3次)。每4天測(cè)定所有老鼠體重和瘤體積。

腫瘤異種移植和器官組織的染色

為了進(jìn)一步研究通過(guò)由眼眶后靜脈竇或尾靜脈注射多功能的NPs對(duì)老鼠體內(nèi)腫瘤的治療效果,在注射后的第40天切除該腫瘤進(jìn)行免疫組化分析。同時(shí),收集器官利用免疫組化分析以研究多功能的NPs對(duì)老鼠的副作用。用10%中性緩沖的福爾馬林固定組織,用石蠟包埋,以5μm厚切片,用蘇木和曙紅(H&E)染色。然后通過(guò)數(shù)碼影像系統(tǒng)(Axioplan2,Zeiss)觀察切片。

對(duì)腫瘤異種移植切片進(jìn)行熒光染色以確認(rèn)多功能的NPs對(duì)LCSCs的顯著療效。在血清被阻塞后,在37℃下對(duì)組織切片用PE-共軛的CD20抗體孵育1小時(shí)。利用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察該染色組織。

統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。使用t-檢驗(yàn),當(dāng)P<0.05時(shí),測(cè)定的差異被認(rèn)為是顯著的(P<0.05)。

結(jié)果

多功能的納米顆粒特征

TEM影像顯示Fe3O4@SiNPs和CD20-Fe3O4@SiNPs能夠良好分散在PBS緩沖液中,保存幾個(gè)星期后無(wú)明顯聚集。顆粒尺寸大多在35nm到40nm之間,粒徑分布較窄(圖1C和1F)。與PE-CD20抗體共軛后顆粒尺寸稍微改變(圖1D)。如在圖1E中所示,該二氧化硅厚度可以在15nm至20nm的范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)節(jié)。Fe3O4NPs的核心(深顏色)直徑為大約30納米。zeta電位結(jié)果(圖1G)表明Fe3O4@SiNPs和CD20-Fe3O4@SiNPs的表面電荷分別為-42.86和-22.04mV。此外,PE-CD20抗體在Fe3O4@SiNP的表面上的共軛可以通過(guò)熒光光譜(FluoroMax-4)得到證實(shí)。如圖1H所示,該P(yáng)E-CD20標(biāo)記的NPs的熒光信號(hào)峰在580nm,與PE-CD20抗體溶液相同,說(shuō)明PE-CD20抗體被成功連接在HSPI&Fe3O4@SiNPs的表面上。

磁性超高溫特性研究

從振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)(VSM)獲得的磁滯回線顯示Fe3O4NPs和CD20-Fe3O4@SiNPs的該飽和磁化強(qiáng)度值(Ms)。該曲線通過(guò)原點(diǎn)表明被測(cè)Fe3O4NPs和Fe3O4@SiNPs是超順磁性的。如圖2A和2B所示,該Fe3O4NPs和CD20-Fe3O4@SiNPs的Ms分別為26emu/g和2.6emu/g。在相同強(qiáng)度的應(yīng)用磁場(chǎng)下,F(xiàn)e3O4@SiO2NPs比裸的Fe3O4有較弱的磁化值,因?yàn)橄嗤|(zhì)量的樣品中,前者所含磁性材料量相對(duì)較少。

高M(jìn)s值對(duì)于提高NPs在AMF下的加熱速度至關(guān)重要。圖2C顯示在該暴露時(shí)間下NPs混懸液的溫度上升情況比較。Fe3O4@SiNPs懸浮液實(shí)現(xiàn)的最高溫度為50.5℃,PBS溶液作為對(duì)照。因此,在中性培養(yǎng)基分散該NPs可實(shí)現(xiàn)有效加熱,F(xiàn)e3O4@SiNPs是一個(gè)用磁致熱引發(fā)藥物輸送及其他生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的候選物。

該數(shù)據(jù)在圖2A至2D表示為n=3的平均值±SD。

體外藥物釋放研究

可控和持續(xù)的藥物釋放在藥物輸送系統(tǒng)中非常重要。圖2D示出了以1mg/mL的Fe3O4@SiNPs中HSPI的累計(jì)釋放情況。該體外釋放研究表明,F(xiàn)e3O4@SiNPs在AMF下,HSPI的持續(xù)釋放長(zhǎng)達(dá)72小時(shí)(70%釋放),從而可以在動(dòng)物身上實(shí)現(xiàn)藥物的可控釋放。然而,無(wú)AMF的觸發(fā)下,藥物釋放率在72小時(shí)的觀察中只有21.5%。

體外細(xì)胞攝取和內(nèi)化

LCSCs細(xì)胞(高表達(dá)CD20)對(duì)Fe3O4@SiNPs和CD20-Fe3O4@SiNPs的攝取通過(guò)激光共聚焦掃描顯微鏡進(jìn)行研究。該LCSCs(第3代)利用濃度在100μg/mL的Fe3O4@SiNPs和CD20-Fe3O4@SiNPs分布在37℃下培養(yǎng)1小時(shí)和24小時(shí)。圖3中,包括A至H,表明在1小時(shí)培養(yǎng)后LCSCs對(duì)CD20-Fe3O4@SiNPs的攝取高于Fe3O4@SiNPs。這結(jié)果還表明CD20標(biāo)記的Fe3O4@SiNPs進(jìn)入細(xì)胞的速度比自由的Fe3O4@SiNPs快得多,這可能是由于該受體介導(dǎo)的內(nèi)噬途徑。除此之外,細(xì)胞攝取納米粒子量隨培養(yǎng)時(shí)間從1小時(shí)至24小時(shí)而增加。圖3顯示細(xì)胞使用CD20-Fe3O4@SiNPs(圖3-A和圖3-B)和Fe3O4@SiNPs(圖3C和圖3-D)處理1小時(shí)和24小時(shí)的共聚焦細(xì)胞影像。圖3還顯示LCSCs內(nèi)化CD20-Fe3O4@SiNPs(圖3-E和圖3-F)和Fe3O4@SiNPs(G和H)后的TEM影像。

基于LCSCs的細(xì)胞攝取的結(jié)果,NPs的內(nèi)化通過(guò)TEM進(jìn)行進(jìn)一步的研究。正如圖3E和3F所示,CD20-Fe3O4@SiNPs在與細(xì)胞共同培養(yǎng)1小時(shí)后被發(fā)現(xiàn)在該細(xì)胞膜附近聚集和內(nèi)化,繼而定位在溶酶體和在細(xì)胞質(zhì)中,但是,即使在培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至24小時(shí)后,被定位在溶酶體和在細(xì)胞質(zhì)中的Fe3O4@SiNPs(圖3-G和3-H)仍然較少,這表明CD20能夠促進(jìn)該納米材料靶向受體并被細(xì)胞攝取。

多功能的NPs在LCSCs上的體外熱療和化療效果

為了評(píng)估CD20-Fe3O4@SiNPs的熱治療效果,試通過(guò)MTT方法檢測(cè)LCSCs在AMF下處理30分鐘或在特定的溫度下水浴中的存活率。正如圖4A所示,當(dāng)它們與CD20-Fe3O4@SiNPs處理后可以得出細(xì)胞存活率為76%,68%,和63%和水浴加熱到42℃,45℃,和50℃(該溫度分別地是通過(guò)水浴或AMF在37℃,40℃,42℃,45℃和50℃來(lái)控制)。此結(jié)果表明由于該熱休克蛋白(HSPs)家族成員的高表達(dá),LCSC有熱耐受性。相反地,只有約12%的LCSCs在AMF加熱到42℃可存活。此外,當(dāng)溫度在AMF處理下保持50℃,只有約8%的LCSCs才能生存。這些結(jié)果說(shuō)明LCSCs對(duì)AMF控制的CD20-Fe3O4@SiNPs介導(dǎo)的熱療敏感的。但是,高溫度不僅可以殺死癌細(xì)胞,但它們也可以傷害或殺死正常細(xì)胞和組織。為了實(shí)現(xiàn)在較低的溫度下選擇性殺死LCSCs的目的,HSP90抑制劑17-(甲基氨基乙基氨基)-17-去甲氧基格爾德霉素(17-DMAG)被包裹在CD20-Fe3O4@SiNPs內(nèi)以抑制HSP90的表達(dá)和克服LCSCs的熱耐受性。

為了測(cè)試CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs的組合熱療和化療效果,LCSCs與NPs孵育并在37℃的AMF下加熱30分鐘。結(jié)果顯示,與該對(duì)照實(shí)驗(yàn)(只是培養(yǎng)基)相比,LCSCs在CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs的存活率有顯著下降(約12%)。請(qǐng)參閱圖4B(該溫度是通過(guò)水浴或AMF在37℃處理30分鐘。數(shù)據(jù)中顯示為平均值±SD,*p<0.05和**p<0.01表明顯著差,n=5)。在該其他方面,細(xì)胞存活率在AMF處理下的HSPI,SiNPs,F(xiàn)e3O4@SiNPs,和HSPI&Fe3O4@SiNPs分別地降低到77%,88%,81%,和73%(圖4B)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在AMF處理下CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs組合熱療和化療具有選擇性靶向治療腫瘤干細(xì)胞的功效。

多功能的NP介導(dǎo)的熱療和化療引起的壞疽

為了解多功能的NPs介導(dǎo)的熱療和化療造成細(xì)胞死亡的該機(jī)制,LCSCs通過(guò)水浴或AMF 37℃下30分鐘處理和使用YO-PRO1標(biāo)簽(細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物)和7-AAD滲透性(質(zhì)膜完整性的指示物)量度。與上述發(fā)現(xiàn)一致的是,水浴超高溫沒(méi)有導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。在水浴加熱過(guò)后未觀察到7-AAD和YO-PRO1陽(yáng)性細(xì)胞(圖4C)。與此相反,經(jīng)過(guò)CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs處理LCSCs 7-AAD和YO-PRO1的陽(yáng)性達(dá)到83.9%。然而,凋亡細(xì)胞(YO-PRO1陽(yáng)性,7-AAD陰性)在AMF處理后未有觀察到,表明壞疽是LCSCs觀察到的細(xì)胞死亡的主要形式。納米顆粒介導(dǎo)的組合熱療和化療可引起細(xì)胞的膜破壞并導(dǎo)致壞死的細(xì)胞死亡方式。

靶向腫瘤的納米顆粒在體內(nèi)的積累及全身分布

在評(píng)估小鼠對(duì)納米顆粒的腫瘤標(biāo)靶和治療功效前,以溶血試驗(yàn)和全血分析來(lái)評(píng)估CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs的血兼容性。對(duì)于溶血分析,如果紅細(xì)胞裂解,血紅蛋白將被釋放,上清液會(huì)現(xiàn)紅并可以在吸光度540nm被測(cè)定。如在圖10A中所示,在1mg/mL的高濃度納米顆粒處理后沒(méi)有觀察到可見(jiàn)的血紅蛋白,這表明多功能的NPs具有良好的血液兼容性(<4%溶血)。未檢測(cè)NPs對(duì)白血細(xì)胞的影響,注射N(xiāo)Ps到老鼠并在AMF下處理30分鐘。取小鼠眼緣靜脈血并利用流式細(xì)胞儀正向和側(cè)向散射分析白細(xì)胞中淋巴細(xì)胞,單核細(xì)胞,和嗜中性粒細(xì)胞。結(jié)果在圖10B表明,在對(duì)照實(shí)驗(yàn)和NPs處理之間的免疫細(xì)胞數(shù)目沒(méi)有顯著差異。這些結(jié)果表明多功能的NPs具有良好的血兼容性且可用于小鼠活體實(shí)驗(yàn)。

然后通過(guò)活體成像系統(tǒng),研究CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs的腫瘤標(biāo)靶功效及其在異體種植瘤小鼠體內(nèi)的分布情況。

圖5示出了CD20-Fe3O4@SiNPs和Fe3O4@SiNPs的該熒光信號(hào),這兩個(gè)囊化熒光染料Ru(bppy)3,均在注射后30分鐘位于該肝。該結(jié)果示出了在0.5,1,2,和24小時(shí)的CD20-Fe3O4@SiNPs和Fe3O4@SiNPs(眼眶后靜脈竇或尾靜脈注射)處理。大部分Fe3O4@SiNP聚集在肝,而CD20-Fe3O4@SiNP主要集中在腫瘤區(qū)。(C:對(duì)照實(shí)驗(yàn);1:注射Fe3O4@SiNPs;2:注射CD20-Fe3O4@SiNPs)

隨著時(shí)間的過(guò)去,使用CD20-Fe3O4@SiNPs處理的小鼠,在腫瘤區(qū)域檢測(cè)到明顯的熒光信號(hào),在注射后24小時(shí)的時(shí)間點(diǎn),CD20-Fe3O4@SiNPs的熒光信號(hào)差不多在瘤的位置附近被找出且有少量的積累在肝內(nèi)。然而,沒(méi)有記錄到Fe3O4@SiNPs在腫瘤區(qū)域聚集的熒光信號(hào)。CD20-Fe3O4@SiNPs能夠特異的靶向腫瘤,其比Fe3O4@SiNPs有更高的效率。相比于Fe3O4@SiNPs,CD20-Fe3O4@SiNPs的特異靶向效率和腫瘤積累進(jìn)一步以活體外(ex vivo)成像(圖5)證實(shí)。在脾,肺,心,腎沒(méi)有觀察到明顯的熒光信號(hào),僅在肝檢測(cè)到微弱信號(hào),結(jié)果顯示在24小時(shí)后,存在于其他器官納米顆粒被排出體內(nèi)。

多功能的NPs介導(dǎo)的熱化療法在體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)

為了確定CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs結(jié)合熱療和化療的抗腫瘤功效,LCSCs在幾個(gè)實(shí)驗(yàn)組中(n=10)異種移植在裸鼠背部。本模型是一種高度惡性瘤模型,腫瘤體積可在14天之內(nèi)增加至約1500mm3。根據(jù)獸醫(yī)的咨詢(xún),腫瘤的總體積超過(guò)2000mm3視為垂死或死亡。CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs分散在正常的PBS由該眼眶后靜脈竇尾靜脈注入腫瘤老鼠。該鼠被置于直徑為10cm的水冷磁性感應(yīng)線圈(AMF)。之后對(duì)瘤體積達(dá)進(jìn)行36天監(jiān)控。如在圖6A和6B所示,得到對(duì)照實(shí)驗(yàn)組的一個(gè)快速瘤生長(zhǎng)曲線(在圖6A中,示出了裸老鼠在AMF處理前異種移植LCSCs和AMF處理后的36天;圖6B是納米顆粒處理后的瘤體積(V/V開(kāi)始)相對(duì)日數(shù)的曲線圖;圖6C是裸老鼠注入NPs的累計(jì)存活率;圖6D是該老鼠處理各種納米顆粒后顯示相對(duì)體重的圖與;圖6E顯示皮下瘤注射N(xiāo)Ps(2:CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs;3:HSPI&Fe3O4@SiNPs;4:CD20-Fe3O4@SiNPs;5:CD20-HSPI@SiNPs)后的照片影像。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD,(n=10)。)

結(jié)果顯示,接收CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs的組合熱療和化療處理的腫瘤生長(zhǎng)明顯被抑制且?guī)缀鯖](méi)有明顯的生長(zhǎng)。相反地,未修飾的HSPI&Fe3O4@SiNPs,CD20-Fe3O4@SiNPs或CD20-HSPI@SiNPs沒(méi)有明顯影響瘤的生長(zhǎng)。相比對(duì)照實(shí)驗(yàn)組中,CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs處理的老鼠平均存活期由12天延長(zhǎng)到36天(圖6C)。在觀察期中每組老鼠的體重按比例增加(圖6D)。與其他群體的老鼠比較,用PBS處理的老鼠體重最低(圖6D)。

為了進(jìn)一步評(píng)估多功能的NPs的抗腫瘤效果,對(duì)腫瘤組織進(jìn)行體外切片病理分析。對(duì)照實(shí)驗(yàn)組的腫瘤組織的細(xì)胞形態(tài)維持正常。然而,在NPs處理組的腫瘤切片染色中發(fā)現(xiàn)有明顯的壞疽發(fā)生。壞疽細(xì)胞表現(xiàn)為深色胞漿嗜酸性和密集的紫色核的圓形(圖7A)。為了更好地確定CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs的治療功效,使用PE連接CD20抗體通過(guò)免疫組織化學(xué)染色來(lái)檢查腫瘤標(biāo)本中CD20的表達(dá)(AMF處理36天后)。相比于未處理瘤(圖7B),CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs可殺死大部分LCSCs,如所示的CD20的熒光信號(hào)顯著減弱。另外,利用透射電子顯微鏡成像顯示在CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs處理的腫瘤組織內(nèi)觀察到納米顆粒的堆積,表明該多功能的納米顆粒靶向腫瘤能力(圖7C-F)。圖7C-7E顯示納米顆粒積聚在腫瘤組織,在AMF處理36天后腫瘤組織發(fā)生壞死。

多功能的NPs未有在活的有機(jī)體內(nèi)引起任何毒性的跡象

該多功能的NPs在活的有機(jī)體內(nèi)的毒性在AMF處理36天后,通過(guò)組織病理學(xué)切片觀察納米顆粒對(duì)各器官如心,肺,肝和腎的毒性效果。如在圖8所示,與正常組作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比較,處理組未觀察到組織病理學(xué)的變化。此外,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)NPs在這些組織內(nèi)的積累。從病理組織學(xué)分析,可以確認(rèn)該CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs沒(méi)有嚴(yán)重?fù)p害那些裸鼠的器官。圖8顯示了多功能的NPs在36天后無(wú)誘導(dǎo)的毒性跡象。在那些器官中沒(méi)有觀察到異常病理變比。該影像在20×放大倍數(shù)下拍攝。

根據(jù)白血細(xì)胞(WBC)計(jì)數(shù),包括淋巴細(xì)胞,單核細(xì)胞,和嗜中性粒細(xì)胞(圖9A-D),對(duì)由CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs處理誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞損傷和恢復(fù)進(jìn)行了評(píng)估。AMF處理后3天的淋巴細(xì)胞在WBC內(nèi)明顯減少和第6天數(shù)目回復(fù)到該正常的水平(圖9A)。此外,通過(guò)使用CD20抗體對(duì)B-細(xì)胞進(jìn)行詳細(xì)分析。雖然以CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs處理的B-細(xì)胞于第3天降到最低點(diǎn),但是實(shí)驗(yàn)觀察到B-細(xì)胞于第4天快速恢復(fù),并最早于第6天回復(fù)到基礎(chǔ)水平(圖9B)。值得注意的是,B細(xì)胞數(shù)目同時(shí)在約第4天開(kāi)始增加和該WBCs于第6天恢復(fù)。該結(jié)果展示出通過(guò)造血功能的激活,損壞的B細(xì)胞在AMF處理后的約第4天開(kāi)始恢復(fù)。除此以外,從CD20-HSPI@Fe3O4@SiNPs處理的老鼠骨髓中提取的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)沒(méi)有觀察攝取CD20-HSPI@Fe3O4@SiNPs的證據(jù)(圖9E)。圖9A顯示W(wǎng)BC計(jì)數(shù)和圖9B顯示老鼠以CD20-HSPI&Fe3O4@SiNP介導(dǎo)的AMF處理的B-細(xì)胞的變化。圖9C和圖9D示出老鼠7天痊愈后有或沒(méi)有CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs的白細(xì)胞和B-細(xì)胞的百分比;圖9E顯示通過(guò)流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)該骨髓內(nèi)老鼠MSCs的CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs攝取。

腫瘤內(nèi)異質(zhì)性是癌癥治療過(guò)程中的一個(gè)重大障礙。越來(lái)越多的證據(jù)體表明,腫瘤可由一小群被稱(chēng)為癌癥干細(xì)胞來(lái)驅(qū)動(dòng),它們具有自我更新,對(duì)抗傳統(tǒng)治療的能力,且具有分化成形成不同的癌癥細(xì)胞種群的能力。最新研究結(jié)果顯示,靶向癌癥干細(xì)胞可有效提高癌癥治療的效率。然而,目前并沒(méi)有關(guān)于CSCs的最佳標(biāo)志物的共識(shí),大量研究使用表面抗原作為CSCs的標(biāo)志物。在這個(gè)發(fā)明中,肺癌干細(xì)胞(LCSCs)是從人肺腫瘤細(xì)胞種群中分離并利用細(xì)胞表面標(biāo)志物和干細(xì)胞標(biāo)志物來(lái)表征,例如,CD20,CD15,ABCG2,和Oct4。請(qǐng)參閱圖11。研究結(jié)果顯示,相比CD20陰性細(xì)胞,CD20陽(yáng)性腫瘤干細(xì)胞有更強(qiáng)的腫瘤形成,遷移和侵襲的能力。請(qǐng)參閱圖12和圖13。利用裸鼠體內(nèi)研究結(jié)果表明在注射相同的細(xì)胞數(shù)量后,LCSCs比分化的LCSCs能夠更快的形成腫瘤,表明LCSC的腫瘤起始能力。請(qǐng)參閱圖14。由于這些LCSCs細(xì)胞是高度成瘤的,在常規(guī)治療中有效的消滅LCSC為成功治療肺癌的關(guān)鍵。因此,CSCs標(biāo)靶療法的發(fā)展提供了一個(gè)治療方法來(lái)徹底消除癌癥細(xì)胞以達(dá)到治愈肺癌患者的目標(biāo)。

臨床結(jié)果表明基于納米顆粒的藥物輸送系統(tǒng)可以在癌癥治療過(guò)程中增強(qiáng)功效,同時(shí)降低了副作用。目前基于納米顆粒的同時(shí)熱療和化療(熱化療)的CSCs的癌癥治療則不幸甚少研究。在本專(zhuān)利中,我們合成和表征該生物兼容性多功能的二氧化硅為基礎(chǔ)的納米顆粒;該納米顆粒包裹了磁性核心(Fe3O4NPs)和化療藥物(包括熱休克蛋白抑制劑)并在表面連有特定的抗體(CD20);在交變磁場(chǎng)(AMF)下以肺癌癥干細(xì)胞的表面標(biāo)志物為標(biāo)靶對(duì)其進(jìn)行組合的熱療和化療。為了確定CD20-Fe3O4@SiNPs的磁性和發(fā)熱性,測(cè)試了磁化飽和值并繪制了滯回曲線。該曲線通過(guò)該原點(diǎn)顯示這兩個(gè)Fe3O4NPs和CD20-Fe3O4@SiNPs是超順磁性。同時(shí)評(píng)估了CD20-Fe3O4@SiNPs在AMF下的發(fā)熱性。正如圖2C中所示,該NPs因磁性滯回具有AMF引起的加熱能力和在AMF下發(fā)熱。接下來(lái),響應(yīng)AMF而釋放相應(yīng)的藥物。相比于HSPI,該NPs復(fù)合物可以延長(zhǎng)了HSPI在體外的釋放。

雖然一直有以熱療治療癌癥的建議,但熱療只能殺死大部分癌細(xì)胞而不是癌癥干細(xì)胞(CSCs),結(jié)果癌癥干細(xì)胞形成對(duì)熱療的耐受性,從而引起復(fù)發(fā)。此外,癌細(xì)胞熱休克蛋白的高表達(dá)可以觸發(fā)防御機(jī)制從而保護(hù)癌細(xì)胞免受高溫的破壞。在這方面研究中使用熱休克蛋白抑制劑(使用17-甲基氨基乙基氨基-17-去甲氧基格爾德霉素(17-DMAG)的為例,其靶向HSP90,F(xiàn)DA已批準(zhǔn)用于臨床試驗(yàn))來(lái)結(jié)合磁性納米顆粒同時(shí)同時(shí)進(jìn)行熱療和化療。此外,該多功能的納米顆??梢酝ㄟ^(guò)CD20抗體的修飾靶向LCSC。使用該CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs體內(nèi)應(yīng)用于異種移植小鼠瘤模型來(lái)靶向LCSCs的能力被進(jìn)一步證實(shí)。經(jīng)過(guò)1小時(shí)孵育,與非修飾NPs比較,體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明CD20抗體修飾的NPs促進(jìn)納米顆粒靶向到LCSCs。然而,LCSCs對(duì)該Fe3O4@SiNPs的攝取率相對(duì)于該孵育時(shí)間的增加而略有增加,這表明長(zhǎng)孵育時(shí)間可以提高非特定的攝取和降低標(biāo)靶和非標(biāo)靶納米顆粒的該差異,這與其他研究一致。CD20-Fe3O4@SiNPs在體外可選擇性靶向到LCSCs這表明CD20抗體的修飾可以促進(jìn)LCSCs對(duì)納米顆粒的內(nèi)吞過(guò)程,促進(jìn)納米顆粒能夠更迅速分布于細(xì)胞質(zhì)中。有研究指出受體泛素化可能會(huì)引發(fā)膜網(wǎng)格蛋白涂覆坑斷裂和完成程序內(nèi)吞。預(yù)泛素化表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)和ErbB2的可組成型內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。因此,靶向份子(CD20抗體)和受體(CD20)間的相互作用誘導(dǎo)受體的該泛素化,從而導(dǎo)致抗體修飾的納米顆粒迅速內(nèi)吞。同時(shí),體內(nèi)分布數(shù)據(jù)有力地證明了CD20抗體修飾的納米顆粒可于很短的時(shí)間內(nèi)聚集在腫瘤組織內(nèi),這與許多早先的報(bào)告一致。為了確認(rèn)體內(nèi)成像結(jié)果,解剖各器官用于生物體外(ex vivo)成像。結(jié)果顯示,注入CD20-Fe3O4@SiNPs的裸鼠的異植瘤內(nèi)納米顆粒的熒光信號(hào)清晰可見(jiàn),而其他器官無(wú)該信號(hào),僅有肝臟觀察到弱信號(hào)。該腎顯示清晰影像,可解釋為在注射該NPs的24小時(shí)內(nèi)納米顆粒被腎臟迅速消除。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)這些多功能的納米顆粒的血兼容性,我們進(jìn)行了溶血和全血分析。對(duì)于溶血分析,以1mg/mL高濃度納米顆粒處理紅細(xì)胞,結(jié)果顯示沒(méi)有觀察到可見(jiàn)的血紅蛋白,這表明該多功能的納米顆粒具有良好的血液兼容性。經(jīng)過(guò)靜脈CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs處理的裸鼠,血液中淋巴細(xì)胞,單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞與正常的不經(jīng)過(guò)處理對(duì)照裸鼠相比似乎沒(méi)有任何改變。此外,獲得的數(shù)據(jù)也顯示CD20修飾的納米顆粒是針對(duì)CSCs而不和一般的體內(nèi)“干細(xì)胞”結(jié)合。來(lái)自骨髓和血的MSCs未被檢測(cè)到與CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs的結(jié)合。因此,該納米顆粒上的CD20抗體部分有利于CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs全身用藥時(shí)排除正常的干細(xì)胞非特異性的毒性,防止有害的和有潛在危險(xiǎn)的副作用。本專(zhuān)利發(fā)明的納米顆粒潛在的臨床應(yīng)用的納米輸送系統(tǒng)有顯著的優(yōu)點(diǎn)。多功能的NP的其他優(yōu)點(diǎn)是CD20-HSPI&Fe3O4@SiNP介導(dǎo)的LCSC標(biāo)靶的組合熱療和化療。

研究顯示本發(fā)明表明熱療或超高溫治療在組合療法起著重要的作用,在AMF中的四氧化三鐵納米顆粒產(chǎn)生的40℃-50℃被認(rèn)為是最佳超高溫。在本發(fā)明過(guò)程中,CD20-Fe3O4@SiNPs的熱療效果在體外被評(píng)估。除了預(yù)期的LCSCs細(xì)胞死亡,AMF控制的CD20-Fe3O4@SiNPs介導(dǎo)的熱療也誘導(dǎo)意想不到的生物反應(yīng),例如因熱休克蛋白的表達(dá)引起的腫瘤特定免疫反應(yīng)。這些結(jié)果表明超高溫不僅能殺死暴露在熱處理中的LCSCs,也能在40℃-50℃的溫度殺死正常的細(xì)胞。為實(shí)現(xiàn)選擇性在較低的溫度(37℃)消除LCSCs的目標(biāo),HSP90抑制劑17-DMAG被包裹在CD20-Fe3O4@SiNPs中以抑制HSP90的表達(dá)從而克服了LCSCs的熱耐受性。CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs的組合熱療和化療在AMF下30分鐘對(duì)LCSCs的存活影響進(jìn)行了研究。與其他組別比較,CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs可特異性靶向到LCSCs并降低其存活率。此外,通過(guò)流式細(xì)胞儀的對(duì)細(xì)胞凋亡和壞死進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)證實(shí)多功能的NPs通過(guò)引起臨界膜損傷和隨后的壞死而殺死LCSCs。LCSCs內(nèi)的溫度增加到42℃以上,造成細(xì)胞膜損壞細(xì)胞和隨后的壞死的細(xì)胞死亡,這表明經(jīng)過(guò)NPs介導(dǎo)的AMF處理后,觀察到壞疽是LCSCs細(xì)胞死亡的主要形式。

確認(rèn)該假設(shè)尺寸的瘤的生長(zhǎng)可通過(guò)使用納米顆粒的該多功能選擇性標(biāo)靶CSCs和組合的AMF引起的熱破壞和化療藥物可在活的有機(jī)體內(nèi)可有效被抑制,CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs的瘤標(biāo)靶功效在由人類(lèi)LCSCs衍生的瘤老鼠被評(píng)估。這研究披露了癌癥的動(dòng)物模型在熱療和化療的該組合處理后,不僅瘤的生長(zhǎng)抑制作用,瘤也很齊全的被消退。瘤的這種完整反應(yīng)可反映該LCSCs的消除。該老鼠被放置在水冷磁性感應(yīng)線圈AMF處理30分鐘。對(duì)于未處理的老鼠的該對(duì)照實(shí)驗(yàn)組,瘤尺寸顯著增加。但是,對(duì)于該接受以CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs的熱療和化療的組合處理的該組,該瘤生長(zhǎng)在該同一時(shí)期被抑制。該老鼠處理與HSPI&Fe3O4@SiNPs超高溫表現(xiàn)出類(lèi)似于該不受控制的對(duì)照實(shí)驗(yàn)的生長(zhǎng)行為。以CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs進(jìn)行超高溫處理的該瘤組織使用H&E染色進(jìn)行分析。該瘤組織的溫度明顯增加在45℃以上,這將導(dǎo)致癌癥細(xì)胞的壞疽,但不會(huì)損傷周?chē)恼=M織。此外,PE連接的CD20免疫組化(IHC)染色結(jié)果表明使用CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs處理的在異種移植瘤沒(méi)有熒光信號(hào)(圖7B,右邊),確認(rèn)CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs靶向LCSC和組合治療功效??傊@些結(jié)果證實(shí)組合熱療和化療的納米輸送系統(tǒng)的靶向LCSC的能力以及抗瘤功效。

在本發(fā)明的研究過(guò)程中,對(duì)實(shí)施納米顆粒治療的裸鼠的心,肝,肺,脾,和腎進(jìn)行病理切片分析,結(jié)果顯示該組CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs處理裸鼠對(duì)比沒(méi)有處理的裸鼠的器官形態(tài)未發(fā)現(xiàn)明顯形態(tài)的變化。為了全面了解免疫細(xì)胞和骨髓對(duì)N P s介導(dǎo)的AMF處理的反應(yīng),尤其是在細(xì)胞構(gòu)成造血缺口,收集末梢血和全骨髓(主要是骨的MSCs組成)以便確定該WBCs的變化,特別是,B-細(xì)胞。有報(bào)道指CD20是B-細(xì)胞特定的分化抗原主要在成熟B細(xì)胞中表達(dá)而不是在早期B細(xì)胞或后來(lái)成熟的漿細(xì)胞中表達(dá)。結(jié)果表明通過(guò)CD20-HSPI&Fe3O4@SiNPs的處理B-細(xì)胞的數(shù)量最低點(diǎn)在第3天并顯著降低,但新的B-細(xì)胞通過(guò)在恢復(fù)期的造血干細(xì)胞分化而生成。本專(zhuān)利發(fā)明的多功能性和靈活性的納米顆粒已證實(shí)具有的安全性和靶向CSCs的優(yōu)點(diǎn),這種納米輸送系統(tǒng)具有臨床應(yīng)用的潛力并可成為組合熱療和化療的癌癥治療平臺(tái)。

如上所示,本專(zhuān)利展示的多功能納米顆粒,包含F(xiàn)e3O4納米顆粒和HSPI,同時(shí)提供超高溫和化療劑用于癌癥治療。

應(yīng)當(dāng)理解的是本發(fā)明的某些功能,為了清楚起見(jiàn),在分開(kāi)的實(shí)施方案的內(nèi)容描述的,可以組合提供在單一的實(shí)施例中。相反,本發(fā)明的各種特征,為了簡(jiǎn)潔起見(jiàn),在單一的實(shí)施方案的內(nèi)容描述的,也可以分別或以任何適當(dāng)?shù)拇谓M合中提供。應(yīng)指出的是,實(shí)施例的某些特征是通過(guò)非限制性的例子來(lái)說(shuō)明。此外,為了簡(jiǎn)潔起見(jiàn),本領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解未有在上述說(shuō)明的現(xiàn)有技術(shù)。在這方面,該領(lǐng)域技術(shù)人員將知道在下面列出的參考,和這些參考的內(nèi)容以其整體被并入本文。

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