本發(fā)明涉及生物工程領域，尤其涉及一種多肽生長因子修飾頭發(fā)基材料的制備方法。

背景技術：

多肽生長因子可由體內(nèi)很多細胞產(chǎn)生，具有重要生理病理及治療作用。例如參與調(diào)節(jié)免疫反應及炎癥反應；與細胞表面受體的結合最終導致細胞內(nèi)rna和蛋白合成方式的改變，從而影響細胞行為；在生物體胚胎發(fā)生、發(fā)育、分化以及人體各種組織損傷后再生修復過程中起重要作用。各種因子之間通過相互誘導、交互調(diào)節(jié)對細胞功能產(chǎn)生協(xié)同、相加或拮抗作用。多肽因子在體內(nèi)半衰期極短，故需要加載到生物材料上，延長其在體內(nèi)的作用時間。

頭發(fā)作為自體材料，取材方便，且力學性能優(yōu)異，在生物工程領域的應用得到廣泛關注。頭發(fā)由毛干、毛根和毛囊三部分組成。毛干指露于皮膚表面的部分，是皮膚的附屬器。由角朊細胞組成，其主要成分為角蛋白。其有毛髓質(zhì)、毛皮質(zhì)和毛小皮構成。毛髓質(zhì)位于毛發(fā)中軸部位，由1-2排立方上皮細胞縱列而成，主要從頭皮中吸取營養(yǎng)物質(zhì)，供頭發(fā)生長。毛皮質(zhì)占毛發(fā)的75％至90％，是決定毛發(fā)的顏色、彈性、強度、粗細與屈曲型的重要組成部分，其由柔軟的角蛋白構成；毛小皮，又稱表皮層，是毛發(fā)的最外層，決定毛發(fā)的外觀和亮澤度。其可以抵御外來刺激，保護皮質(zhì)并抑制水分的蒸發(fā)。毛發(fā)在皮膚內(nèi)的部分稱為毛根，同樣也具有毛髓質(zhì)、毛皮質(zhì)和毛小皮三個部分。毛根末端膨大呈球狀，稱毛球。后者位于毛囊內(nèi)，中央內(nèi)凹，接毛囊真皮乳頭。

已有的研究大多關注頭發(fā)內(nèi)部的部分成分——角蛋白。從頭發(fā)中提取角蛋白，通過包封或表面接枝多肽生長因子制得成的水凝膠可以促進止血功能，改善心臟病患者的心臟功能，促進軸突再生等。這些研究均無法直接利用頭發(fā)作為多肽生長因子的載體。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種多肽生長因子修飾頭發(fā)基材料的制備方法，該方法將頭發(fā)作為多肽生長因子的載體，保留了頭發(fā)的整體結構，取材方便。

本發(fā)明提供的一種多肽生長因子修飾頭發(fā)基材料的制備方法，包括如下步驟：

(1)將頭發(fā)置于酒精的水溶液中浸泡，取出頭發(fā)進行清洗和干燥；將干燥后的頭發(fā)置于酸的水溶液中浸泡，取出頭發(fā)進行清洗和干燥，得到頭發(fā)基材料；

(2)在引發(fā)劑的作用下，步驟(1)所述頭發(fā)基材料和多肽生長因子在水中發(fā)生反應，得到所述多肽生長因子修飾頭發(fā)基材料。

上述的制備方法，步驟(1)的處理可在保證頭發(fā)結構完整性的前提下，將頭發(fā)表面的羧基基團暴露。

步驟(1)中，所述頭發(fā)的長度可為0.5～1cm，具體可為1cm。

所述酒精的水溶液中，酒精的質(zhì)量濃度可為75％。所述酒精的水溶液的體積不受限制，能夠保證浸沒頭發(fā)即可。

在酒精的水溶液中浸泡的時間可為30～90min(如60min)，浸泡的溫度可為20～37℃(如37℃)。

從酒精的水溶液中取出后的清洗可為水洗，具體可采用蒸餾水。

所述干燥可為烘干，所述烘干的溫度可為20～37℃(如37℃)，時間可為10～20min(如15min)。

所述酸的水溶液中，酸的質(zhì)量濃度可為1％～15％，具體可為10％。所述頭發(fā)與所述酸的水溶液的質(zhì)量體積比可為(1～10)mg：10ml，具體可為8mg：10ml。

所述酸的水溶液中，酸可為鹽酸、硫酸、硝酸或醋酸。

在酸的水溶液中浸泡的時間可為5～15min，具體可為10min，浸泡的溫度可為20～37℃，具體可為37℃。

從酸的水溶液中取出后的清洗可為水洗，具體可采用蒸餾水。

所述干燥可為冷凍干燥；所述干燥的時間可為24～48h，具體可為36h。

上述的制備方法，步驟(2)中，所述反應為步驟(1)中頭發(fā)基材料表面中暴露的羧基和多肽神經(jīng)生長因子中的氨基發(fā)生的交聯(lián)反應，多肽神經(jīng)生長因子被接枝到頭發(fā)上。

所述引發(fā)劑、所述頭發(fā)基材料、所述多肽生長因子和所述水的比例可為(1～100)mg：(10～200)ng：(1～10)ng：1ml，具體可為0.1mg：0.8mg：5ng：1ml。

所述多肽生長因子包括但不限于：神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)素-3、神經(jīng)營養(yǎng)素-4、神經(jīng)營養(yǎng)素-5、神經(jīng)營養(yǎng)素-6、神經(jīng)營養(yǎng)素-7、堿性成纖維細胞生長因子、酸性成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、紅細胞生成素、膠質(zhì)細胞株源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子-1、運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子-2、骨形成蛋白、nogo的抗體或硫酸軟骨素抗體。

所述引發(fā)劑可為京尼平、戊二醛或質(zhì)量比為1：(1～10)的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)，具體可為質(zhì)量比為1：1的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)。

所述水具體可為蒸餾水。

所述反應可在攪拌的條件下進行，所述攪拌的轉速可為200～500rpm，如400rpm；所述反應的溫度可為0～4℃，具體可為4℃，時間可為24～48h，具體可為48h。

本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明多肽生長因子修飾頭發(fā)基材料的制備方法，包括如下步驟：采用酸對頭發(fā)進行處理使頭發(fā)表面裸露出羧基，得頭發(fā)基材料；在引發(fā)劑的作用下，所述頭發(fā)基材料與多肽生長因子發(fā)生反應，即可得到所述多肽生長因子修飾頭發(fā)基材料。本發(fā)明方法利用稀酸溫和的腐蝕作用對頭發(fā)表面進行表面處理，使頭發(fā)表面暴露出羧基基團，這樣既保證了頭發(fā)的完整結構，又使羧基基團便于與多肽生長因子的氨基在引發(fā)劑作用下發(fā)生交聯(lián)反應，得到多肽生長因子修飾的頭發(fā)基材料。

(2)良好的生物相容性和應用廣泛性。頭發(fā)表面暴露出羧基基團，便于接枝多種多肽因子。頭發(fā)材料作為自體附屬器官，取材方便。而且頭發(fā)基材料可以為多肽生長因子提供支撐作用，將多肽生長因子釋放出來，為缺損組織提供整個再生過程中所需的多肽生長因子，具應用廣泛性。

附圖說明

圖1為頭發(fā)材料原樣、頭發(fā)基材料、ngf修飾頭發(fā)基材料的表面形貌(掃描電子顯微鏡照片)。圖1a為頭發(fā)材料原樣的表面形貌；圖1b為頭發(fā)基材料的表面形貌；圖1c為ngf修飾頭發(fā)基材料的表面形貌。

圖2為頭發(fā)材料原樣、頭發(fā)基材料、ngf修飾頭發(fā)基材料的紅外譜圖。圖2a為頭發(fā)材料原樣的紅外譜圖；圖2b為頭發(fā)基材料的紅外譜圖；圖2c為ngf修飾頭發(fā)基材料的紅外譜圖。

圖3為雞胚背根神經(jīng)節(jié)(drg)在ngf修飾頭發(fā)基材料作用下生長的神經(jīng)纖維(顯微鏡照片)。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

神經(jīng)生長因子(nervegrowthfactor,ngf)是最早被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，于20世紀50年代被首次發(fā)現(xiàn)證實。ngf是由3個亞基(α、β和γ)組成的五聚體蛋白質(zhì)復合物，分子質(zhì)量為130-140kda。β亞單元是ngf的功能活性單位，由雙鏈構成的二聚體-β亞基(βngf)，分子量為26kda。下述實施例中的神經(jīng)生長因子的通用名為注射用鼠神經(jīng)生長因子(mousenervegrowthfactforinjection)，商品名為恩經(jīng)復，生產(chǎn)廠家為廈門北大之路生物工程有限公司，購自國藥集團化學試劑有限公司，規(guī)格為18ug(≥9000au)/支。

實施例1、制備多肽生長因子修飾頭發(fā)基材料

一、制備方法

按照如下步驟制備多肽生長因子修飾頭發(fā)基材料：

(1)經(jīng)鹽酸處理的頭發(fā)基材料的制備

取長度為1cm的頭發(fā)(掃描電鏡照片如圖1a所示)若干根，置于75wt％酒精的水溶液中浸泡60min，浸泡溫度為37℃，蒸餾水洗凈烘干，烘干溫度為37℃，烘干時間為15min。然后將8mg頭發(fā)置于質(zhì)量濃度為10％的10ml鹽酸水溶液中，37℃下浸泡10min；反應完畢后蒸餾水沖洗，冷凍干燥36h，得到頭發(fā)基材料(掃描電鏡照片如圖1b所示)。

(2)ngf修飾經(jīng)鹽酸處理的頭發(fā)基材料的制備

取上述步驟(1)中制備得到的頭發(fā)基材料8mg、神經(jīng)生長因子5ng、n-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽均0.5mg依次加入到10ml蒸餾水中，4℃下攪拌48h(攪拌轉速為400rpm)，得到ngf修飾的頭發(fā)基材料(掃描電鏡照片如圖1c所示)。

由圖1中的掃描電鏡照片可以看出，頭發(fā)表面的毛鱗片并無明顯差異。這表明由于鹽酸僅對頭發(fā)材料表面進行改性，時間短且條件溫和，故不影響頭發(fā)的整體結構。

二、紅外光譜測定

測定方法：分別取上述制備方法一中所用的頭發(fā)原樣、步驟(1)制備得到的頭發(fā)基材料、制備得到的ngf修飾頭發(fā)基材料三組材料各若干根。將試樣首尾兩端用膠帶粘緊，保證中間被測試部分的長度為2cm，直徑為2mm。樣品間盡量不留縫隙，將捆綁好的樣品插入紅外光譜儀的試樣安放處。然后設置參數(shù)：分辨率為4cm^-1，掃描次數(shù)為30次，掃描范圍為4000-400cm^-1，并進行波數(shù)掃描，得到吸收光譜數(shù)據(jù)。最后，將得到的數(shù)據(jù)進行分析處理，得到紅外譜圖。如圖2所示。

在紅外譜圖(圖2)中，2924.39cm^-1與2853.25cm^-1處為-oh羥基伸縮振動特征峰，1648.69cm^-1為-c＝o的伸縮振動特征峰，1235.32cm^-1為-c-o的伸縮振動特征峰，幾組特征峰共同表征羧基基團。頭發(fā)原樣(圖2a)表面的脂肪酸、角蛋白等通過二硫鍵牢固連接，并且頭發(fā)表面形成特殊的復雜保護層，因此紅外光譜顯示其并無明顯特征峰。對頭發(fā)原樣進行表面處理，使頭發(fā)表面暴露出羧基，以便進行接枝，因此頭發(fā)基材料(圖2b)暴露出特征峰。ngf修飾經(jīng)鹽酸處理的頭發(fā)基材料(圖2c)中ngf的氨基與頭發(fā)基材料表面的脂肪酸、角蛋白的羧基結合成酰胺鍵，因此峰尖銳程度均弱于頭發(fā)基材料。atr-ftir結果表明ngf成功接枝到頭發(fā)基材料表面。

三、生物活性

為了驗證上述制備方法一中制備的ngf修飾頭發(fā)基材料中ngf仍具有生物活性，現(xiàn)采用ngf修飾頭發(fā)基材料與雞胚背根神經(jīng)節(jié)共培養(yǎng)的方法，驗證ngf的活性。具體方法如下：將神經(jīng)生長因子修飾頭發(fā)基材料與從8日齡雞胚中提取的雞胚背根神經(jīng)節(jié)共培養(yǎng)。其中培養(yǎng)體系為雞血漿10μl，dmem200μl和100μl。共培養(yǎng)24h后，光 學顯微鏡下觀察背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)軸突的生長情況。

結果如圖3所示：雞胚背根神經(jīng)節(jié)在靠近神經(jīng)生長因子修飾頭發(fā)基材料一側突起更長，并且突起可以沿著材料方向生長。證明包封神經(jīng)生長因子修飾頭發(fā)基材料可以釋放出神經(jīng)生長因子，且神經(jīng)生長因子具有生物活性。