發(fā)明領域

本發(fā)明涉及納米粒子及其在治療癌癥中的用途。

發(fā)明背景

本發(fā)明涉及組合物和產(chǎn)品，以及制備和施用這類組合物和產(chǎn)品的方法，包括用于哺乳動物且尤其是人的治療。

在美國和歐洲，癌癥是目前導致死亡的第二大原因。鱗狀細胞癌(scc)通常采用局部藥物治療、手術切除健康組織的游離緣和/或放射療法進行治療。

wo2011/154711描述了糖化的金納米粒子，其充當用于遞送肽類諸如胰島素的載體。

wo2014/125256描述了用于將生物活性劑靶向到中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)的納米粒子遞送系統(tǒng)，例如，用于治療cns病癥。

setua等(2014,nanoscale,vol.6(18),pp.10865-10873)描述了用于惡性膠質瘤的多峰化學-放射療法的順鉑-限定的(cisplatin-tethered)金納米球。

cui等(2013,nanomedicine:nanotechnology,biology,andmedicine,vol.9,pp.264-273)描述了對巰丙酰甘氨酸(tiopronin)涂覆的金納米粒子的贅生性細胞應答。

schaeublin等(2011,nanoscale,vol.3,pp.410-120)研究了表面電荷對金納米粒子-介導的毒性的影響。

對于單獨地或者與放射療法結合用于治療癌癥(諸如scc)的進一步的治療劑，仍有未滿足的需要。本發(fā)明解決了這些和其它需要。

發(fā)明概述

廣泛地，本發(fā)明涉及納米粒子作為抗癌劑的用途。本發(fā)明人已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)具有共價附連的配體(α-半乳糖和peg胺)的混合冠的金核納米粒子在集落形成(clonogenic)實驗中表現(xiàn)出選擇性毒性，殺傷腫瘤細胞系，但是不傷害非-癌癥控制細胞系。在不存在任何添加的“有效負荷”的細胞毒性劑的情況下，表現(xiàn)出抗癌活性。事實上，不希望受任何特定理論的約束，本發(fā)明人相信細胞殺傷的機制可涉及介導活性氧物質生產(chǎn)的納米粒子的生產(chǎn)。本文描述的結果表明癌細胞的殺傷通過放射療法加強。

因此，在第一方面，本發(fā)明提供一種用于在治療哺乳動物受試者的癌癥的方法中的納米粒子，其包含核和冠，所述核包含金屬，所述冠包含共價連接至所述核的多個配體。所述多個配體包括至少第一種包含乙二醇部分和胺基的配體和至少第二種包含碳水化合物基團的配體。

在一些情況下，根據(jù)本發(fā)明的這一方面和其他方面，所述第一種配體可包括胺-官能化聚(乙二醇)或胺-官能化寡聚(乙二醇)。在一些情況下，第一種配體可包含c2-c15烷基(例如c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、c10、c11、c12、c13、c14或c15，直鏈或支鏈)和/或c2-c15二醇(例如c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、c10、c11、c12、c13、c14或c15)。優(yōu)選地，氨基為在配體的端部除了結合至納米粒子的核的端部的末端胺。在一些情況下，所述第一種配體包括胺-官能化六甘醇。具體地，第一種配體包括根據(jù)式(i)的配體：

在一些情況下，根據(jù)本發(fā)明的這一方面和其他方面，所述第二種配體可包括單糖、寡糖或多糖。在一些情況下，所述第二種配體包括半乳糖、葡萄糖或n-乙酰葡糖胺。在一些情況下，所述第二種配體包括葡萄糖、α-半乳糖、甘露糖、海藻糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖胺和/或n-乙酰葡糖胺。在具體的情況下，所述第二種配體包括α-半乳糖。在具體情況下，所述第二種配體包括通過巰基乙基(thioethyl)共價連接至所述核的α-半乳糖。在一些情況下，根據(jù)本發(fā)明，所述第二種配體包括通過硫醇硫原子共價附連至核的2’-巰基乙基-β-d-吡喃葡萄糖苷或2’-巰基乙基-α-d-吡喃葡萄糖苷。

第一種配體和/或第二種配體可通過連接體被結合至納米粒子核(例如金核)的表面原子。在一些情況下，連接體可包括含硫基團、含氨基基團、含磷酸基團或含氧基團。在具體情況下，連接體包括硫醇基團并且所述一種或多種配體通過硫-核結合(例如對于含金的核，鍵可為金-硫鍵、金-硫醇鍵或金-硫化物鍵)被結合至核。在一些情況下，連接體可包括巰基乙基或巰基丙基。在某些情況下，納米粒子可具有如圖1所示出的一般結構。

在一些情況下，根據(jù)本發(fā)明，納米粒子包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、至少20、至少30、至少40或至少50個配體。在某些情況下，所述第一種配體的數(shù)量可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、至少20、至少30、至少40或至少50個。在某些情況下，所述第二種配體的數(shù)量可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、至少20、至少30、至少40或至少50個。

如在本文實施例中所述，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)第一種配體和第二種配體的比例在一些情況下可影響活性，例如納米粒子的癌細胞殺傷活性。具有eg6-胺:α-半乳糖配體的比例為大約40:60的六甘醇(eg)6-胺:α-半乳糖金納米粒子表現(xiàn)出針對hsc-3細胞的尤其高的細胞殺傷活性，其通過集落形成實驗評價。而且，具有eg6-胺:α-半乳糖配體的比例為大約80:20、40:60和20:80的的金納米粒子也表現(xiàn)出針對hsc-3細胞的強有力的細胞殺傷活性，其通過集落形成實驗評價。因此，在某些情況下，所述第一種配體和所述第二種配體可以以95:5(即95個含二醇-胺的配體比5個含碳水化合物的配體)至5:95、或80:20至20:80、或60:40至40:60范圍內的摩爾比存在于本發(fā)明的這一方面和其他方面的納米粒子上。在具體情況下，所述第一種配體和所述第二種配體可以以30:70至50:50或55:45至45:55范圍內的比例存在。配體的比例可由本領域技術人員已知的分析方法確定，包括例如¹h-nmr和/或uv光譜法。另外，納米粒子上不同種的配體的比例通常直接受到在納米粒子合成過程中存在的配體的比例的影響。如在實施例1中所述，硫醇-eg6-胺配體和硫醇-c2-α-半乳糖配體的比例為1:1，并導致具有這兩種配體的納米粒子，這兩種配體以大約1:1的比例存在于納米粒子上。

本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)本文所述的納米粒子即使在不存在“常規(guī)的”細胞毒性藥物或有效負荷的情況下也表現(xiàn)出針對癌細胞系(hsc-3和hela)的細胞殺傷活性。因此，雖然順鉑-限定的金納米粒子已經(jīng)被提議用于惡性膠質瘤的化學-放射療法時(setua等,2014,nanoscale,vol.6(18),pp.10865-10873)，但這是我們所知的即使在不存在放射療法或滯后誘導的殺傷的情況下，“無有效負荷”的納米粒子的抗癌效果的首次報道。因此，在某些情況下，本發(fā)明的這一方面和其他方面的納米粒子可僅僅具有共價連接至核的配體，所述配體是所述第一種配體和所述第二種配體。具體地，本發(fā)明的這一方面和其他方面的納米粒子在某些情況下不具有結合至納米粒子核或冠表面的任何細胞毒性藥物或毒素。在某些情況下，本發(fā)明的這一方面和其他方面的納米粒子的配體可由所述第一種配體和所述第二種配體組成。

在一些情況下，根據(jù)本發(fā)明，納米粒子的核的直徑在1nm至5nm的范圍內。

在一些情況下，根據(jù)本發(fā)明，包含其配體的納米粒子的直徑在3nm至20nm，任選地4nm至15nm或4nm至5nm的范圍內。

根據(jù)本發(fā)明，發(fā)明的納米粒子可包含具有二價態(tài)的組分(諸如具有二價態(tài)的金屬或化合物)、或其氧化物或鹽。例如，具有表現(xiàn)出二價態(tài)能力的金屬或金屬復合物尤其有用。這類組分可以以二價態(tài)添加或在添加后轉化成二價態(tài)。二價組分的氧化物和鹽也有用，并且可直接被添加或在原位形成之后添加。在有用的二價組分的鹽之中包括鹵鹽，諸如氯化物、碘化物、溴化物或氟化物。這類二價組分可包括，例如鋅、鎂、銅、鎳、鈷、鎘或鈣，以及它們的氧化物和其鹽。期望該組分以一定的量存在，所述量足以提高癌細胞殺傷的水平超過在不存在具有二價態(tài)的組分的情況下納米粒子的癌細胞殺傷的水平。在一些情況下，具有二價態(tài)的組分理想地以對于核金屬(例如金)大約0.5至2.0當量、或任選地對于核金屬(例如金)大約0.75至1.5當量的量存在。在本發(fā)明的上下文中，“當量”可為摩爾當量，例如1.0當量的鋅意思是鋅原子或zn²⁺陽離子的數(shù)量與納米粒子核中金原子的數(shù)量相同。

在一些情況下，二價組分可存在于納米粒子的冠中。在此特別考慮的是二價組分可被包含在納米粒子中(包括在納米粒子的冠中)，由于在納米粒子的合成過程中包含了二價組分。此外或可替代地，二價組分可在納米粒子合成后添加。在一些情況下，根據(jù)本發(fā)明，二價組分諸如鋅可選自：zn²⁺和zno。例如，鋅可以為zncl2的形式。

可替代地，在一些情況下，納米粒子或包含納米粒子的組合物可基本上無zn²⁺離子。

在一些情況下，根據(jù)本發(fā)明，核包含選自由以下組成的組的金屬：au、ag、cu、pt、pd、fe、co、gd、eu和zn，或其任何組合。

在一些情況下，根據(jù)本發(fā)明，核是有磁性的。

在一些情況下，根據(jù)本發(fā)明，核包含半導體。具體地，在一些情況下，半導體可選自由以下組成的組：硒化鎘、硫化鎘、碲化鎘和硫化鋅。

在一些情況下，根據(jù)本發(fā)明，核能夠充當量子點。

在某些情況下，本發(fā)明的這一方面和其他方面的納米粒子可用于治療癌癥，所述癌癥選自由以下組成的組：鱗狀細胞癌(scc)、宮頸癌、皮膚癌、口腔癌、神經(jīng)膠質瘤、肺癌、膀胱癌、眼癌、胃癌和食道癌。癌癥可為固體腫瘤。在一些情況下，癌癥可包括通過將納米粒子直接導向腫瘤和/或周圍組織(例如通過局部施用)而適合治療的腫瘤。已經(jīng)觀察到針對口腔scc衍生的細胞系(hsc-3)和針對宮頸癌細胞系(hela細胞)的抗癌活性—參見本文實施例。另外，不希望受任何特定理論的約束，本發(fā)明人認為由本文描述的納米粒子誘導的癌細胞殺傷的機制可涉及活性氧物質的生產(chǎn)，這將會使本發(fā)明的納米粒子潛在地可適用于廣泛的各種不同的癌癥。在具體情況下，所述癌癥是口腔scc(例如舌scc)或皮膚scc。

如在本文的實施例中進一步描述的，對癌細胞的細胞殺傷效果可通過對用本文所述的納米粒子治療的受試者細胞也進行x-射線放射來增強。因此，本發(fā)明的這一方面和其他方面的納米粒子可用于治療所述癌癥的方法中，所述方法進一步包括向受試者施用放射療法。在一些情況下，治療所述癌癥的所述方法包括向受試者施用所述納米粒子和隨后或同時施用所述放射療法。優(yōu)選地，放射療法在某個時間點施用，在這個時間內，所述納米粒子在腫瘤部位或腫瘤附近保持適當?shù)臐舛?。在納米粒子包含含金的核或含鉑的核的情況下，x-射線放射被認為是發(fā)出能夠損壞和/或殺傷細胞的俄歇電子。根據(jù)本發(fā)明，所述放射療法可包括x-射線放射，例如外粒子束x-射線放射。

在第二方面，本發(fā)明提供了用于根據(jù)本發(fā)明的第一方面的方法中的藥物組合物，該組合物包含一種或多種根據(jù)本發(fā)明的第一方面的納米粒子和藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。在一些情況下，根據(jù)本發(fā)明的任一方面，納米粒子藥物組合物包含載體，諸如溶液，聚合物、粉末、或乳劑，納米粒子懸浮于其中。組合物可以是締合形式，懸浮液或一起包含在單一的包裝、容器或載體中。在某些情況下，組合物可采用一種或多種劑量(例如定義的納米粒子的數(shù)量或定義的抗癌活性單位的數(shù)量)的形式，諸如以治療劑量或定義的劑的數(shù)量的形式。

在一些情況下，根據(jù)本發(fā)明的這一方面，納米粒子藥物組合物可進一步包含至少一種滲透增強劑。某些滲透增強劑可有利地結合至納米粒子或以其他方式存在于組合物中并提供增強的細胞或組織穿透力。在某些情況下，所述滲透增強劑選自：n-月桂酰基肌氨酸、脫水山梨醇單月桂酸酯(“20”)、烷基-d-麥芽糖苷(例如十四烷基-d-麥芽糖苷、十二烷基-β-d-麥芽糖苷、己基-β-d-麥芽糖苷、辛基-β-d-麥芽糖苷、壬基-β-d-麥芽糖苷、癸基-β-d-麥芽糖苷、十一烷基-β-d-麥芽糖苷、十三烷基-β-d-麥芽糖苷或十六烷基-β-d-麥芽糖苷)和凝膠蛋白酸(lysalbinicacid)。

根據(jù)本發(fā)明的這一方面，納米粒子藥物組合物可通過任何合適的途徑被施用或用于施用。在具體情況下，納米粒子藥物組合物可通過選自由以下組成的組的途徑被施用或用于施用：局部的、靜脈內的(i.v.)、肌內的(i.m.)、真皮內的(i.d.)、腹膜內的或皮下的(s.c.)注射或輸注；口的；唇下的；舌下的；通過吸入；通過一種或多種黏膜；泌尿生殖器的；直腸的和真皮的。在某些情況下，納米粒子藥物組合物可被配制成局部施用或可被局部施用。在具體情況下，納米粒子藥物組合物可被用于向皮膚scc腫瘤或口腔scc腫瘤和/或周圍組織局部施用或可被局部施用于皮膚scc腫瘤或口腔scc腫瘤和/或周圍組織。

在第三方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的第一方面的納米粒子或本發(fā)明的第二方面的藥物組合物在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。所述癌癥可為根據(jù)該發(fā)明的第一方面所定義的。在一些情況下，所述癌癥選自由以下組成的組：鱗狀細胞癌(scc)、宮頸癌、皮膚癌、口腔癌、神經(jīng)膠質瘤、肺癌、膀胱癌、眼癌、胃癌和食道癌。在某些情況下，所述癌癥是口腔scc或皮膚scc。

在一些情況下，根據(jù)該發(fā)明的這一方面，所述藥物與放射療法結合用于治療所述癌癥。所述放射療法可為根據(jù)該發(fā)明的第一方面所定義的。

在第四方面，本發(fā)明提供了在有需要的受試者中治療癌癥的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的第一方面所定義的納米粒子或根據(jù)本發(fā)明的第二方面所定義的藥物組合物。所述癌癥可為根據(jù)該發(fā)明的第一方面所定義的。在一些情況下，所述癌癥選自由以下組成的組：鱗狀細胞癌(scc)、宮頸癌、皮膚癌、口腔癌、神經(jīng)膠質瘤、肺癌、膀胱癌、眼癌、胃癌和食道癌。在某些情況下，所述癌癥是口腔scc或皮膚scc。

在一些情況下，根據(jù)本發(fā)明的這一方面，所述方法進一步包括向所述受試者施用放射療法。所述放射療法可為根據(jù)該發(fā)明的第一方面所定義的。

在第五方面，本發(fā)明提供了一種制品，其包含：

根據(jù)本發(fā)明的第一方面所定義的納米粒子或根據(jù)本發(fā)明的第二方面所定義的藥物組合物；

用于容納納米粒子或藥物組合物的容器；和

具有用于治療癌癥的施用和/或劑量說明的插入物或標記物。所述癌癥可為根據(jù)該發(fā)明的第一方面所定義的。在一些情況下，所述癌癥選自由以下組成的組：鱗狀細胞癌(scc)、宮頸癌、皮膚癌、口腔癌、神經(jīng)膠質瘤、肺癌、膀胱癌、眼癌、胃癌和食道癌。在某些情況下，所述癌癥是口腔scc或皮膚scc。

根據(jù)本發(fā)明的任一方面，所述受試者可為人、伴侶動物(例如狗或貓)、實驗動物(例如小鼠、大鼠、兔子、豬或非人靈長類動物)、家畜或農(nóng)畜(例如豬、牛、馬或羊)。優(yōu)選地，受試者是人。具體地，受試者可能遭受、被診斷為癌癥或被評估為具有發(fā)展成癌癥的風險，所述癌癥包括根據(jù)該發(fā)明的第一方面所定義的癌癥。

本發(fā)明包括所描述的方面和優(yōu)選的特征的組合，除了這種組合是明顯不允許的或者被規(guī)定明確避免的。本發(fā)明的這些方面和進一步的方面和實施方案在下面進一步詳細描述，并且參考所附的實施例和附圖。

附圖簡述

圖1顯示納米粒子的示意圖，所述納米粒子具有比例為1:1的α-半乳糖:peg胺的多個配體和金核。

圖2以兩個6孔板照片的形式顯示集落形成實驗三次重復的結果，其中：上板的上行具有三個孔，所述孔具有hsc-3細胞+np37納米粒子(50:50α-半乳糖-c2:peg胺-gnp)；上板的下行具有hacat細胞+np37納米粒子；下板的上行具有hsc3細胞，沒有納米粒子(對照)；和下板的下行具有hacat細胞，沒有納米粒子(對照)。所述板以1000細胞/孔接種24小時，然后暴露于np37納米粒子(15μg/ml)或沒有納米粒子3小時，沖洗掉，然后在正常培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天。結果顯示當用np37納米粒子處理口腔scc腫瘤細胞系hsc3時與未經(jīng)處理的hsc3細胞相比和與用np37納米粒子處理的或未經(jīng)處理的角化細胞hacat細胞相比，表現(xiàn)出幾乎全部細胞死亡。

圖3以兩個24孔板照片的形式顯示集落形成實驗的兩次重復結果，其中：hsc-3(上板)和hacat(下板)細胞用3(第1行)、10(第2行)、15(第3行)和30(第4行)μg/ml的mp253(60:40α-半乳糖-c2:peg胺-gnp；第1和2列)、np37(50:50α-半乳糖-c2:peg胺-gnp；第3和4列)和mp254(40:60α-半乳糖-c2:peg胺-gnp；第5和6列)納米粒子處理。板用500細胞/孔接種并且應用納米粒子3小時，然后沖洗掉并替換為新鮮的培養(yǎng)基，然后放置7天。結果顯示與hacat細胞相比所有三種納米粒子類型對于hsc-3細胞的細胞殺傷。效力的順序(最高至最低)是mp253>mp254>np37。

圖4顯示各種納米粒子對hsc-3細胞(第1、2和3列)和hacat細胞(第4、5和6列)的集落形成試驗結果。所有的納米粒子處理以15μg/ml進行3小時。頂行處理為(左至右)：mp184(50:50α-半乳糖-c2:peg胺-gnp)、mp185(50:50β-葡萄糖-c2:peg胺-gnp)和mp186(50:50n-乙酰-葡糖胺-c2:peg胺-gnp)。下行處理為(左至右)：mp187(100％α-半乳糖-c2-gnp)、mp188(100％peg胺-gnp)和未經(jīng)處理的對照“zero”。結果顯示在測試濃度下通過mp184、mp185、mp186和mp188，hsc-3細胞與hacat細胞相比的清晰的細胞殺傷。

圖5顯示來源于具有三種細胞系：hacat(上線；紅色)；hsc-3(中線；在10μg/ml以上穿越成為下線；綠色)；和hela(下線；在10μg/ml以上穿越成為中線；藍色)的集落形成試驗結果的劑量反應曲線(集落％對照vs.np37納米粒子的濃度μg/ml)。細胞用1、3、10、30和100μg/ml的np37納米粒子培養(yǎng)6小時。在15μg/ml的np37納米粒子的數(shù)據(jù)點來自單獨的試驗，所述試驗用np37納米粒子培養(yǎng)3小時。

圖6顯示用銀增強的細胞吸收np37納米粒子的顯微照片。黑點表示金納米粒子；亮綠色是細胞核染色。顯示為對于hsc-3細胞和hacat細胞在用np37納米粒子處理后在時間0(0小時)、2小時和4小時的結果。結果顯示np37納米粒子集聚在細胞中，鄰近細胞核，其可能表示在高爾基體中的積累。

圖7顯示hsc-3細胞(左)和hacat細胞(右)對納米粒子急性(3小時)吸收的銀增強圖像。成對的圖像顯示相場(左)和明視場(右)。納米粒子處理(所有15μg/ml)為(上至下)：mp184(50:50α-半乳糖-c2:peg胺-gnp)、mp185(50:50β-葡萄糖-c2:peg胺-gnp)、mp186(50:50n-乙酰-葡糖胺-c2:peg胺-gnp)、mp187(100％α-半乳糖-c2-gnp)、mp188(100％peg胺-gnp)和zero(未經(jīng)處理的對照)。結果表明mp184-186較高的細胞吸收，mp187和mp188較低的細胞吸收。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)染色的位置是近細胞核的。

圖8顯示在存在或不存在抗壞血酸(aa)和丙酮酸鈉(pyr)兩者中任一個作為抗氧化劑的情況下用np37納米粒子(30μg/ml，3小時)處理的hsc-3細胞的顯微圖像。測試的pyr的濃度為(左至右)：0、0.1mm、1mm、2mm和5mm。測試的aa的濃度為(左至右)：0、0.05mm、0.1mm、0.5mm和1mm。結果表明兩種抗氧化劑處理都能夠阻止np37介導的hsc-3細胞的細胞死亡。

圖9顯示局部應用200μg/ml的納米粒子4小時后np37納米粒子的小鼠皮膚穿透。皮膚部分被固定，并用銀增強劑染色。圖像顯示未經(jīng)處理的對照(左)和np37納米粒子(右)。在左邊的圖像上，皮膚中黑色的區(qū)域是黑色素。在右邊的圖像上，銀染揭示了金納米粒子作為另一種灰色/綠色染色，這與黑色素是不同的。結果表明了np37納米粒子穿透小鼠皮膚。

圖10顯示局部應用200μg/ml的納米粒子4小時后np37納米粒子的皮膚穿透。皮膚樣本被固定、明膠包埋、振動切片，然后銀染。銀反應產(chǎn)物是棕色的。上行顯示未經(jīng)處理的對照。中行顯示用200μg/mlnp37+穿透增強劑(每10ml磷酸鹽緩沖劑:乙醇(1:1)中60mgn-月桂?；“彼岷?0mg脫水山梨醇單月桂酸酯(20))處理4小時的皮膚。下行顯示用200μg/ml納米粒子4小時。結果表明np37納米粒子快速地被吸收入小鼠皮膚。

圖11顯示各種比例的糖：peg胺納米粒子針對hsc-3口腔scc細胞(左圖)和hacat對照角化細胞的劑量依賴毒性(％對照存活)。右圖的右邊的圖例表示(從上至下)：α-半乳糖：peg胺100:0(橙色圓)；80:20(紅色方形)；60:40(綠色三角形)；50:50(藍色倒三角形)；40:60(藍色菱形)；20:80(粉紅色圓)；0:100(黑色方形)；xgal(灰色三角形)；和氨基連接體(al)(灰色圓)。發(fā)現(xiàn)50:50α-半乳糖：peg胺納米粒子的ic50為0.96μg/ml(大約50nm)，這比用相同的納米粒子針對hacat細胞測量的ic50(>10000μg/ml)低很多，表明選擇性抗癌毒性。發(fā)現(xiàn)50:50比例的α-半乳糖：peg胺aunp表現(xiàn)出最高的抗癌毒性，其后是60:40比例的α-半乳糖：peg胺aunp作為下一個最有效的。

圖12顯示針對用于對照(紅線；無藥物)、0.3μg/ml的具有50:50α-半乳糖：peg胺的冠的金納米粒子(藍色)和0.6μg/ml的具有50:50α-半乳糖：peg胺的冠的金納米粒子(綠色)的hsc-3細胞(左圖)和hacat細胞(右圖)的放射劑量(gray；x-軸)繪制的毒性(存活率；y-軸)。納米粒子處理的hsc-3細胞表現(xiàn)出放射誘導的細胞殺傷的增強(對于0.3μg/mlaunp大約1.4x；對于0.6μg/mlaunp大約2.8x)。在非癌癥hacat細胞中發(fā)現(xiàn)放射穿透水平低很多(對于0.3μg/mlaunp大約1.0x；對于0.6μg/mlaunp大約1.1x)。

發(fā)明詳述

在描述本發(fā)明時，將采用下述術語，并且這些術語旨在如下所示進行定義。

納米粒子

如本文所用，“納米粒子”是指具有納米尺度的粒子，并且不旨在表示任何特別的形狀限制。具體地，“納米粒子”包括納米球、納米管、納米盒、納米簇、納米棒等。在某些實施方案中，本文考慮的納米粒子和/或納米粒子核具有總體多面體或球形的幾何形狀。

包含多個含碳水化合物的配體的納米粒子已描述在例如wo2002/032404、wo2004/108165、wo2005/116226、wo2006/037979、wo2007/015105、wo2007/122388、wo2005/091704(其各自的全部內容通過引用明確地并入本文)中，并且這類納米粒子可以根據(jù)本發(fā)明使用。

如本文所用，“冠”是指層或涂層，其可以部分地或完全地覆蓋納米粒子核的暴露表面。冠包含多個配體，所述配體通常包含至少一個碳水化合物部分、一個表面活性劑部分和/或一個谷胱甘肽部分。因此，冠可被認為是圍繞或部分圍繞金屬核的有機層。在某些實施方案中，冠提供和/或參與納米粒子的核的鈍化。因此，在某些情況下，冠可以包括充分完整的涂層，以基本上使半導體或含金屬的核穩(wěn)定。然而，本文特別考慮具有核(例如，包括由貴金屬涂覆的含金屬氧化物的內核)的某些納米粒子可包含僅部分涂覆核表面的冠。在某些情況下，冠促進本發(fā)明的納米粒子的溶解度，諸如水溶解度。

納米粒子為小粒子，例如金屬或半導體原子的簇，其可用作固定配體的基底。

優(yōu)選地，納米粒子具有平均直徑在0.5與50nm之間，更優(yōu)選地在0.5與10nm之間，更優(yōu)選地在0.5與5nm之間，更優(yōu)選地在0.5與3nm之間，還更優(yōu)選地在0.5與2.5nm之間的核。當除了核以外還考慮配體時，優(yōu)選地，粒子的總平均直徑在2.0與20nm之間，更優(yōu)選地在3與10nm之間，并且最優(yōu)選地在4與5nm之間?？墒褂帽绢I域熟知的技術諸如透射電子顯微鏡法來測量平均直徑。

核材料可以為金屬或半導體(所述半導體任選地包括金屬原子或為有機半導體)并且可由超過一種類型的原子形成。優(yōu)選地，核材料為選自au、fe或cu的金屬。納米粒子核也可由包括au/fe、au/cu、au/gd、au/fe/cu、au/fe/gd和au/fe/cu/gd的合金形成，并可用于本發(fā)明。優(yōu)選的核材料為au和fe，最優(yōu)選的材料為au。納米粒子的核優(yōu)選地包括約100至500個原子(例如金原子)以提供納米范圍內的核直徑。其它特別有用的核材料摻雜有一種或多種具有nmr活性的原子，允許使用nmr在體外和體內檢測納米粒子。nmr活性原子的實例包括mn⁺²、gd⁺³、eu⁺²、cu⁺²、v⁺²、co⁺²、ni⁺²、fe⁺²、fe⁺³和鑭系元素⁺³，或在本申請其它地方描述的量子點。

包括可作為納米尺度半導體晶體而檢測的半導體化合物的納米粒子核能夠充當量子點，即它們可吸收光從而將材料中的電子激發(fā)至更高的能級，隨后在該材料特有的頻率下釋放光子。半導體核材料的實例為硒化鎘、硫化鎘、碲化鎘。也包括鋅化合物，諸如硫化鋅。

在一些實施方案中，納米粒子或其配體包括可檢測的標記物。標記物可以為納米粒子的核或配體的元素。由于納米粒子的該元素的固有性質，或通過與可檢測的另外部分連接、軛合或締合，該標記物可被檢測。標記物的優(yōu)選的實例包括為熒光基團、放射性核素、磁性標記物或染料的標記物。熒光基團包括熒光素、若丹明或四甲基若丹明、德克薩斯紅、cy3、cy5等，并且可以通過激發(fā)熒光標記物并用拉曼散射光譜檢測發(fā)出的光而檢測(y.c.cao,r.jin,c.a.mirkin,science2002,297:1536-1539)。

在一些實施方案中，納米粒子可包括放射性核素，其用于使用由放射性核素發(fā)出的放射性來檢測納米粒子(例如，通過使用pet、spect)或用于治療(即，用于殺傷靶細胞)。本領域常用的能夠容易地加以修改而用于本發(fā)明的放射性核素的實例包括^99mtc，其以多種氧化態(tài)存在，但最穩(wěn)定的是tco^4-；³²p或³³p；⁵⁷co；⁵⁹fe；⁶⁷cu，其通常作為cu²⁺鹽使用；⁶⁷ga，其通常作為ga³⁺鹽使用，例如檸檬酸鎵；⁶⁸ge；⁸²sr；⁹⁹mo；¹⁰³pd；¹¹¹in，其通常作為in³⁺鹽使用；¹²⁵i或¹³¹i，其通常作為碘化鈉使用；¹³⁷cs；¹⁵³gd；¹⁵³sm；¹⁵⁸au；¹⁸⁶re；²⁰¹tl，其通常作為tl⁺鹽使用，諸如氯化鉈；³⁹y³⁺；⁷¹lu³⁺和²⁴cr²⁺。放射性核素作為標記物和示蹤劑的一般使用是本領域熟知的并且可由本領域的技術人員容易地修改而用于本發(fā)明的多個方面。放射性核素可通過以下方式最容易地使用：摻雜納米粒子的核或包括它們而作為固定在納米粒子上的配體的一部分而存在的標記物。

施用和治療

可將本發(fā)明的納米粒子和組合物通過多種不同的途徑(包括腸內或腸胃外途徑)施用給患者。腸胃外施用包括通過以下途徑施用：靜脈內、皮膚或皮下、鼻腔、肌內、眼內、經(jīng)上皮、腹膜內和局部(包括真皮、眼、直腸、鼻腔、吸入和氣溶膠)以及直腸系統(tǒng)途徑。

本發(fā)明的納米粒子可被配制成可以呈固體或液體組合物的形式的藥物組合物。這類組合物將通常包含某種載體，例如固體載體或液體載體，諸如水、石油、動物或植物油、礦物油或合成油。也可包括生理鹽水溶液，或二醇類，諸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。這類組合物和制劑通常含有至少0.1wt％的化合物。

對于靜脈內、皮膚或皮下注射，或在病灶部位的注射，活性成分將呈腸胃外可接受的無熱源且具有合適ph、等滲性和穩(wěn)定性的水溶液或液體的形式。本領域的相關技術人員完全能夠使用例如化合物或其衍生物例如在生理鹽水中的溶液，用甘油、液體聚乙二醇或油制備的分散體來制備合適的溶液。

除了任選地與其它活性成分組合的一種或多種化合物外，組合物可包含一種或多種藥學上可接受的賦形劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑、等滲劑、防腐劑或抗氧化劑或本領域技術人員熟知的其它材料。這類材料應為無毒的并且不應影響活性成分的功效。載體或其它材料的確切性質可取決于施用途徑，例如肌內注射。

優(yōu)選地，藥物組合物以預防有效量或治療有效量(根據(jù)具體情況，預防也可被認為是治療)給予個體，該量足以顯示出對個體的益處。通常，這將產(chǎn)生治療上有用的活性，從而向個體提供益處。施用的化合物的實際量、以及施用速率和時間進程將取決于所治療的病狀的性質和嚴重程度。治療處方(例如劑量決定等)在全科醫(yī)生和其它醫(yī)生的責任范圍內，并通?？紤]到待治療的病癥、個體患者的病狀、遞送部位、施用方法和執(zhí)業(yè)醫(yī)師已知的其它因素。上文提到的技術和方案的實例可見于handbookofpharmaceuticaladditives,第2版(m.ash和i.ash編)，2001(synapseinformationresources,inc.,endicott,newyork,usa)；remington’spharmaceuticalsciences,第20版,2000年出版.lippincott,williams&wilkins；和handbookofpharmaceuticalexcipients,第2版,1994。舉例來說，組合物優(yōu)選地以每kg體重約0.01至100mg之間的活性化合物的劑量，并且更優(yōu)選地以每kg體重約0.5至10mg之間的劑量施用給患者。

下文通過實施例的方式來展示，并且不應被解釋為是對權利要求范圍的限制。

實施例

實施例1–納米粒子的合成

基本上如以前所述(wo2011/154711；和lund等,2011,biomaterialsvol.32pp.9776-9784，其全部內容通過引用明確地并入本文)合成具有碳水化合物配體或谷胱甘肽配體的冠的金納米粒子。

al/α-galnp

2-巰基-乙基-α-d-半乳糖苷(α-半乳糖c2sh)的制備

向半乳糖(3g，16.65mmol)在2-溴乙醇(30ml)中的懸浮液中加入酸性樹脂安伯來特(amberlite)120-h達到ph2。在50-60℃攪拌反應16小時。過濾反應混合物并用meoh洗滌。添加三乙胺達到ph8。濃縮反應的粗品，并用甲苯共蒸發(fā)3次。反應混合物溶解在吡啶(75ml)和ac2o(35ml)中，并在0℃添加催化量的dmap并在室溫下攪拌3h?；旌衔镉胊coet稀釋并用1.h2o；2.hcl(10％)3.nahco3dis4.h2o稀釋。收集有機層并在無水na2so4上干燥。tlc(己烷:acoet3:1，2次洗脫)顯示主要產(chǎn)物(所需)和較低rf少數(shù)。產(chǎn)物利用己烷:乙酸乙酯為6:1的混合物作為洗脫液通過快速色譜純化，并得到2-溴乙基-α-半乳糖苷(2)。

將之前反應的產(chǎn)物2溶解在27ml的2-丁酮中。向該溶液添加催化量的四丁基碘化銨和4當量的硫代乙酸鉀。在室溫條件下攪拌產(chǎn)生的懸浮液2h。在整個該過程中，反應通過tlc(己烷-acoet2:1，2次洗脫)檢測起始材料的消失。混合物用20ml的acoet稀釋并用飽和nacl溶液洗滌。有機相被干燥、過濾和在真空下蒸發(fā)。產(chǎn)物在2:1→1:1的己烷/acoet中純化，以獲得乙?；鶐€基-α-半乳糖苷3。

將反應的新產(chǎn)物3溶解在2:1的二氯甲烷-甲醇混合物中。向該混合物添加1n甲醇鈉(1當量)溶液并在室溫下攪拌1小時。添加安伯來特ir-120h樹脂以達到ph5-6。然后過濾并濃縮產(chǎn)生的混合物至干以獲得最終產(chǎn)物(α-半乳糖c2sh)。

氨基-硫醇連接體的制備。

向pph3(3g，11.4mmol)在20ml無水thf中的溶液中添加diac(2.3g，11.4mmol)。允許在0℃攪拌混合物15min直到出現(xiàn)白色產(chǎn)物。向該混合物逐滴添加(添加漏斗)六甘醇(1.45ml，5.7mmol)和hsac(610μl，8.55mmol)在無水thf(20ml)中的溶液。15min后，產(chǎn)物開始出現(xiàn)，在tlc上rf0.2。在蒸發(fā)器中濃縮溶液。反應的粗品溶解在50ml的二氯甲烷中，并用10％的k2co3溶液洗滌。有機相在無水na2so4之上干燥、過濾和真空濃縮。使用1:1的acoet:己烷、acoet和最后以4:1的dcm:meoh作為洗脫液對粗品進行快速色譜，得到乙酰巰基-六甘醇衍生物。

將反應產(chǎn)物溶解在5ml的dmf和pph3(2.25g，8.55mmol)中，添加nan3(0.741g，11.4mmol)和brcl3c(0.845ml，8.55mmol)，并隨后在室溫下攪拌溶液40min。當進行tlc(dcm:meoh25:1)時，產(chǎn)生的產(chǎn)物較起始產(chǎn)物具有更高的rf。反應混合物用100ml的二乙醚稀釋并用h2o洗滌三次。有機相在無水na2so4之上干燥、過濾和真空蒸發(fā)。使用洗脫液dmc/meoh200:1和dcm/meoh40:1的混合物通過快速色譜純化產(chǎn)物以獲得疊氮基-乙酰巰基-六甘醇衍生物。

為了除去三苯基氧化膦，將反應產(chǎn)物溶解在10ml的thf中，并向該溶液添加0.5g的mgcl2。在80℃攪拌反應2h，直到出現(xiàn)白色沉淀，然后通過硅藻土過濾。將產(chǎn)物溶解在3:1的乙醇:水的混合物中，并添加zn粉(0.45g，6.84mmol)和nh4cl(0.6g，11.4mmol)。反應在回流下攪拌1h直到存在的起始材料不再可通過tlc(dcm/meoh25:1)檢測到。通過硅藻土過濾反應并蒸發(fā)溶劑。反應的粗品用acoet稀釋并用5ml水萃取。將水相蒸發(fā)至干以獲得氨基-硫醇-六甘醇產(chǎn)物。

α-半乳糖c2衍生物3和六甘醇胺連接體6取自midatechbiogune原料。n-(3-二甲基氨基丙基)-n’-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)、haucl4、nabh4從sigma-aldrich化學公司購買。咪唑-4-乙酸單鹽酸鹽從alfaaesar購買。所有實驗和溶液都使用公司高質量的meoh和nanopure水(18.1mω)。

α-galc2(α)

2′-巰基乙基-α-d-吡喃半乳糖苷(α)

eg6nh2

1-氨基-17-巰基-3,6,9,12,15,-五氧雜-十七烷醇或

1-氨基-6-巰基-六甘醇(俗名)

al/α-galnp的制備：向1:1比例的胺-巰基六甘醇連接體6和α-半乳糖配體3在meoh(49ml)中的混合物(0.58mmol，3當量)添加金鹽的水溶液(7.86ml，0.19mmol，0.025m)。攪拌反應30秒，且然后以若干份添加nabh4(1n)的水溶液(4.32ml,4.32mmol)。在900rpm下震蕩反應100分鐘。此后，在14000rpm下離心懸浮液1分鐘。移除上清液，并將沉淀溶解在2ml的水中。然后，將2ml的懸浮液引入兩個過濾器(amicon，10kda，4ml)中，并在4500g下離心5分鐘。過濾器中的殘渣用水再洗滌兩次。將最終的殘渣溶解在80ml的水中。

對于金np的制備，在層流櫥內制造。所有的玻璃和塑料材料(諸如eppendorfs、小瓶和瓶子)和溶劑(水、hac)首先在高壓釜內滅菌。所有的其他一次性用品(諸如刀片和過濾器)都提前經(jīng)過滅菌。

實施例2-納米粒子的生物活性

細胞殺傷

用10％胎牛血清維持hsc-3、hacat和hela細胞系在低水平的葡萄糖dmem中。

對于集落形成試驗，以500細胞/孔的密度在24孔塑料培養(yǎng)板內或者以1000細胞/孔的密度在6孔培養(yǎng)板內接種細胞。允許24小時的細胞附著后，以要求的濃度加入納米粒子3小時，然后沖洗掉，并替換為新鮮的培養(yǎng)基。然后保持細胞7天以成長為單個集落。然后用在50％乙醇中的0.5％w/v亞甲藍對集落染色。計數(shù)每個條件的集落(>50細胞)的數(shù)量并在相同的照明條件下拍照。

對于放射療法，該方案與上面使用的24孔板一樣。細胞用納米粒子加載3小時，并且然后用4gy的150kevx-射線輻照。大約1小時后沖洗細胞，并替換為新鮮的培養(yǎng)基且保持7天。

如圖2中所示，集落形成試驗結果表明當用np37納米粒子(50:50α-半乳糖-c2:peg胺-gnp)處理的口腔scc腫瘤細胞系hsc-3時與未經(jīng)處理的hsc-3細胞相比和與用np37納米粒子處理或未經(jīng)處理的角化細胞hacat細胞相比表現(xiàn)出幾乎全部細胞死亡。

在圖3中所示的結果表明與hacat細胞相比，所有三種納米粒子類型，mp253(60:40α-半乳糖-c2:peg胺-gnp)、np37(50:50α-半乳糖-c2:peg胺-gnp)和mp254(40:60α-半乳糖-c2:peg胺-gnp)，對于hsc-3細胞的細胞殺傷。效力的順序(最高至最低)是mp253>mp254>np37。

研究了一系列納米粒子冠類型的癌細胞殺傷活性。圖4顯示各種納米粒子對hsc-3細胞和hacat細胞的集落形成試驗結果。納米粒子處理為：mp184(50:50α-半乳糖-c2:peg胺-gnp)、mp185(50:50β-葡萄糖-c2:peg胺-gnp)、mp186(50:50n-乙酰-葡糖胺-c2:peg胺-gnp)、mp187(100％α-半乳糖-c2-gnp)、mp188(100％peg胺-gnp)和未經(jīng)處理的對照“zero”。結果顯示與hacat細胞相比，在測試濃度(15μg/ml，3小時)下，mp184、mp185、mp186和mp188對hsc-3細胞的清晰的細胞殺傷。

如在圖5中所示，np37納米粒子以劑量依賴的方式殺傷hsc-3、hela和(以更高的濃度)hacat細胞。對于np37納米粒子針對這三種細胞類型的ld50值顯示在表1中。腫瘤細胞系hela(宮頸)和hsc-3(口腔scc)相對于hacat(角化細胞)的敏感度表明了在癌癥治療中的治療的益處。

表1：對于np37在3種細胞類型中的ld50

在用4gy150kevx-射線輻照后觀察到納米粒子誘導的hsc-3細胞殺傷的增強。

細胞殺傷的機制

研究了活性氧物質(ros)在納米粒子介導的細胞死亡中的潛在作用。用15μg/ml的np37納米粒子處理hsc-3和hacat細胞3.5小時。如在表2中所示，當np37納米粒子存在時，ros-敏感探針dcfhda在hsc-3細胞中顯示出選擇性較高的熒光信號。結果也表明對癌細胞表現(xiàn)出細胞毒性的納米粒子在加入的幾秒內也引起細胞內鈣的上升。不希望受任何特定理論的約束，發(fā)明人相信鈣信號傳導在細胞殺傷的機制中可能發(fā)揮著作用。

表2：np37增加細胞中活性氧物質(ros)

如在圖8中所示，抗氧化劑丙酮酸鈉和抗壞血酸能夠在測試的濃度范圍內能夠防止np-37介導的hsc-3細胞死亡。在存在或不存在丙酮酸鈉(pyr)和抗壞血酸(aa)兩者中任一種作為抗氧化劑的情況下，用np37納米粒子(30μg/ml，3小時)處理hsc-3細胞。測試的pyr濃度為：0、0.1mm、1mm、2mm和5mm。測試的aa濃度為：0、0.05mm、0.1mm、0.5mm和1mm。

納米粒子的細胞吸收

如在圖6中所示，np37納米粒子表現(xiàn)出快速吸收入hsc-3細胞和hacat細胞，納米粒子在鄰近細胞核處、可能在高爾基體中積累。

在圖7中所示的結果表明由hsc-3和hacat細胞對納米粒子mp184-186較高的細胞吸收，對mp187和mp188較低的吸收。再次發(fā)現(xiàn)大多數(shù)染色的位置是近細胞核的。納米粒子處理(所有為15μg/ml)為：mp184(50:50α-半乳糖-c2:peg胺-gnp)、mp185(50:50β-葡萄糖-c2:peg胺-gnp)、mp186(50:50n-乙酰-葡糖胺-c2:peg胺-gnp)、mp187(100％α-半乳糖-c2-gnp)、mp188(100％peg胺-gnp)和zero(未經(jīng)處理的對照)。

也研究了皮膚樣本的納米粒子穿透。圖9顯示局部應用200μg/ml的納米粒子4小時后np37納米粒子的小鼠皮膚穿透。圖10顯示局部應用200μg/ml的納米粒子4小時后np37納米粒子的皮膚穿透。顯示的是：未經(jīng)處理的對照、用200μg/mlnp37+穿透增強劑(每10ml磷酸鹽緩沖劑:乙醇(1:1)中60mgn-月桂酰基肌氨酸和40mg脫水山梨醇單月桂酸酯(20))處理4小時的皮膚和用200μg/mlnp37處理4小時的皮膚。結果表明np37納米粒子被快速地吸收入小鼠皮膚中。

實施例3-進一步的生物活性試驗

利用如以上實施例2中所述的相同的方法學進行進一步的毒性研究。結果在圖11和12中顯示。

圖11顯示各種比例的糖：peg胺納米粒子針對hsc-3口腔scc細胞(左圖)和hacat對照角化細胞的劑量依賴毒性(％對照存活)。發(fā)現(xiàn)50:50α-半乳糖：peg胺納米粒子的ic50為0.96μg/ml(大約50nm)，這比用相同的納米粒子針對hacat細胞測量的ic50(>10000μg/ml)低很多，表明選擇性抗癌毒性。發(fā)現(xiàn)50:50比例的α-半乳糖：peg胺aunp表現(xiàn)出最高的抗癌毒性，其后是60:40比例的α-半乳糖：peg胺aunp為下一個最有效的。

圖12顯示研究納米粒子增強放射誘導的細胞殺傷能力的研究結果，即化學放射治療的效果。圖12圖形顯示針對hsc-3細胞(左圖)和hacat細胞(右圖)的放射劑量(gray；x-軸)繪制的毒性(存活率；y-軸)。納米粒子處理的hsc-3細胞表現(xiàn)出放射誘導的細胞殺傷的增強(對于0.3μg/mlaunp大約1.4x；對于0.6μg/mlaunp大約2.8x)。在非癌癥hacat細胞中發(fā)現(xiàn)放射穿透水平低很多(對于0.3μg/mlaunp大約1.0x；對于0.6μg/mlaunp大約1.1x)。

電子顯微鏡研究(tem；未顯示)表明aunp在皮膚癌細胞中選擇性積累(即與hacat細胞相比，hsc細胞具有較高的吸收)。不希望被任何特定理論所約束，本發(fā)明人認為aunp對皮膚癌細胞的選擇性毒性可能是由于在皮膚癌細胞中的選擇性積累。

這些結果表明本發(fā)明的納米粒子對癌細胞是選擇性有毒的，并選擇性增強放射治療。

本文引用的所有文獻通過引用以其整體并入本文，并且對于所有目的，達到如同每個單個出版物或專利或專利申請被具體地和單獨地指出以其整體通過引用并入的相同程度。

本文的具體的實施方案通過實施例的方式，而不是通過限制的方式提供。本文包括的任何副標題僅僅為了方便起見，并且不被解釋為以任何方式限制公開。