相關(guān)申請的交叉引用本申請要求于2014年12月12日提交的美國臨時專利申請?zhí)?2/091,431的優(yōu)先權(quán)，其公開內(nèi)容通過引用并入本申請。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明大體上涉及選擇性細(xì)胞消除。發(fā)明背景癌癥是世界范圍內(nèi)發(fā)病和死亡的主要原因。在2012年，出現(xiàn)了約1400萬例新病例和820萬癌癥相關(guān)性死亡，或占全部人類死亡的14.6％(who網(wǎng)站(2014年11月)“癌癥”)。癌癥的主要特征是具有侵襲或蔓延至機體其它部位的潛能的異常細(xì)胞增長。癌癥的理想療法是完全消除所有癌細(xì)胞，而使所有健康細(xì)胞無恙。然而，經(jīng)歷當(dāng)前系統(tǒng)性療法的癌癥患者由于治療劑的非選擇性而遭受從惡心至不孕的多種副作用。因此，對于開發(fā)用于選擇性消除癌細(xì)胞但保留非癌細(xì)胞的新療法存在持續(xù)需求。發(fā)明概述本發(fā)明公開大體上涉及適用于選擇性殺滅靶細(xì)胞，而不影響非靶細(xì)胞的組合物和方法。在一個方面，本申請公開了一種組合物，所述組合物包含：a)向?qū)na，所述向?qū)na能夠與靶細(xì)胞的基因組中的靶序列雜交；b)cas蛋白；和c)編碼自殺基因的多核苷酸。在一些實施方式中，所述靶序列特定于所述靶細(xì)胞。在一個實施方式中，所述靶序列包含所述靶細(xì)胞中染色體易位的斷點連接。在一個實施方式中，所述靶細(xì)胞是癌細(xì)胞。在一個實施方式中，所述cas蛋白是cas9蛋白。在一個實施方式中，所述自殺基因選自下組：病毒胸苷激酶、胞嘧啶脫氨酶、針對抗氧化酶(aoe)的胞內(nèi)抗體、細(xì)菌硝基還原酶、半胱天冬酶和脫氧核糖核酸酶(dnase)。在一個實施方式中，所述自殺基因可操作地連接至調(diào)控元件。在一個實施方式中，所述調(diào)控元件是最小啟動子。在一個實施方式中，所述自殺基因可操作地連接至癌特異性啟動子。在一個方面，本申請公開了一種組合物，所述組合物包含一個或多個載體，所述載體包含：a)編碼向?qū)na的第一核苷酸序列，所述向?qū)na能夠與靶細(xì)胞的基因組中的靶序列雜交；b)編碼cas蛋白的第二核苷酸序列；和c)編碼自殺基因的第三核苷酸序列；其中所述第一、第二和第三核苷酸序列在相同或不同載體中。在一個實施方式中，所述編碼cas蛋白的第二核苷酸序列可操作地連接至癌特異性啟動子。在一方面中，本申請公開了一種組合物，所述組合物包含：a)第一向?qū)na，所述第一向?qū)na能夠與靶細(xì)胞的基因組中的第一靶序列雜交；b)第二向?qū)na，所述第二向?qū)na能夠與所述靶細(xì)胞的基因組中的第二靶序列雜交；c)cas蛋白；和d)編碼自殺基因的多核苷酸。在另一方面中，本申請公開了一種組合物，所述組合物包含：a)編碼第一向?qū)na的第一核苷酸序列，所述第一向?qū)na能夠與靶細(xì)胞的基因組中的第一靶序列雜交；b)編碼第二向?qū)na的第二核苷酸序列，所述第二向?qū)na能夠與所述靶細(xì)胞的基因組中的第二靶序列雜交；c)編碼cas蛋白的第三核苷酸序列；和d)編碼自殺基因的第四核苷酸序列；其中所述第一、第二、第三和第四核苷酸序列在相同或不同載體中。在一個方面，本申請公開了一種細(xì)胞，所述細(xì)胞包含一個或多個載體，所述載體包含：a)編碼向?qū)na的第一核苷酸序列，所述向?qū)na能夠與靶細(xì)胞的基因組中的靶序列雜交；b)編碼cas蛋白的第二核苷酸序列；和c)編碼自殺基因的第三核苷酸序列；其中所述第一、第二和第三核苷酸序列在相同或不同載體中。在一個方面，本申請公開了一種組合物，所述組合物包含：a)第一向?qū)na，所述第一向?qū)na能夠與多個靶細(xì)胞的基因組中的第一靶序列雜交；b)第二向?qū)na，所述第二向?qū)na能夠與所述多個靶細(xì)胞的基因組中的第二靶序列雜交；c)cas蛋白；和d)編碼自殺基因的多核苷酸。在另一個方面，本申請公開了一種組合物，所述組合物包含一個或多個載體，所述載體包含：a)編碼第一向?qū)na的第一核苷酸序列，所述第一向?qū)na能夠與多個靶細(xì)胞的基因組中的第一靶序列雜交；b)編碼第二向?qū)na的第二核苷酸序列，所述第二向?qū)na能夠與所述多個靶細(xì)胞的基因組中的第二靶序列雜交；c)編碼cas蛋白的第三核苷酸序列；和d)編碼自殺基因的第四核苷酸序列；其中所述第一、第二、第三和第四核苷酸序列在相同或不同載體中。又在另一個方面，本申請公開了一種方法，所述方法包含將組合物引入靶細(xì)胞的方法，所述組合物包含：a)向?qū)na，所述向?qū)na能夠與所述靶細(xì)胞的基因組中的靶序列雜交；b)cas蛋白；和c)編碼自殺基因的多核苷酸。在一些實施方式中，所述靶序列在對照細(xì)胞的基因組中不存在。在一個實施方式中，所述靶細(xì)胞是癌細(xì)胞且所述對照細(xì)胞是健康細(xì)胞。在另一個方面，本申請公開了一種方法，所述方法包括將靶細(xì)胞與一個或多個載體接觸，所述載體包含：a)編碼向?qū)na的第一核苷酸序列，所述向?qū)na能夠與所述靶細(xì)胞的基因組中的靶序列雜交的；b)編碼cas蛋白的第二核苷酸序列；和c)編碼自殺基因的第三核苷酸序列；其中所述第一、第二和第三核苷酸序列在相同或不同載體中。在一個方面，本申請公開了一種方法，所述方法包含將多個靶細(xì)胞與組合物接觸，所述組合物包含：a)第一向?qū)na，所述第一向?qū)na能夠與多個靶細(xì)胞的基因組中的第一靶序列雜交；b)第二向?qū)na，所述第二向?qū)na能夠與所述多個靶細(xì)胞的基因組中的第二靶序列雜交；c)cas蛋白；和d)編碼自殺基因的多核苷酸。在一個方面，本申請公開了一種方法，所述方法包括將多個靶細(xì)胞與一個或多個載體接觸，所述載體包含：a)編碼第一向?qū)na的第一核苷酸序列，所述第一向?qū)na能夠與所述多個靶細(xì)胞的基因組中的第一靶序列雜交的；b)編碼第二向?qū)na的第二核苷酸序列，所述第二向?qū)na能夠與所述多個靶細(xì)胞的基因組中的第二靶序列雜交；c)編碼cas蛋白的第三核苷酸序列；和d)編碼自殺基因的第四核苷酸序列；其中所述第一、第二、第三和第四核苷酸序列在相同或不同載體中。在一個方面，本申請公開了一種用于治療癌癥的方法，所述方法包括將癌細(xì)胞與一個或多個載體接觸，所述載體包含：a)編碼向?qū)na的第一核苷酸序列，所述向?qū)na能夠與所述癌細(xì)胞的基因組中的靶序列雜交；b)編碼cas蛋白的第二核苷酸序列；和c)編碼自殺基因的第三核苷酸序列；其中所述第一、第二和第三核苷酸序列在相同或不同載體中。在一個實施方式中，所述靶序列特定于所述癌細(xì)胞。在另一個方面，本申請公開了一種組合物，所述組合物包含：a)基因靶向核酸酶或其變體；和b)編碼自殺基因的多核苷酸；其中所述基因靶向核酸酶能夠促進所述自殺基因整合進入靶細(xì)胞的基因組中的靶序列。在一個實施方式中，所述基因靶向核酸酶是鋅指核酸酶(zfn)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(talen)、cas蛋白或大范圍核酸酶。在一個方面，本申請公開了一種向?qū)na，所述向?qū)na包含第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列與靶細(xì)胞中第一染色體中的序列互補；和第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列與所述靶細(xì)胞中第二染色體中的序列互補。在一個方面，本申請公開了一種載體，所述載體包含(a)編碼自殺基因的多核苷酸；(b)第一同源臂，所述第一同源臂位于編碼所述自殺基因的所述多核苷酸的上游，其中所述第一同源臂包含靶細(xì)胞中第一染色體中的序列；和(c)第二同源臂，所述第二同源臂位于編碼所述自殺基因的所述多核苷酸的下游，其中所述第二同源臂包含所述靶細(xì)胞中第二染色體中的序列。在另一個方面，本發(fā)明公開涉及一種用于在包含至少第一細(xì)胞和第二細(xì)胞的細(xì)胞群中選擇性消除所述第一細(xì)胞的方法，所述方法包括：a)識別所述第一細(xì)胞的基因組中的基因座，所述基因座包含多核苷酸序列，其中所述第二細(xì)胞在其基因組中不包含所述多核苷酸序列；和b)在所述基因座處整合自殺基因以誘導(dǎo)所述第一細(xì)胞的細(xì)胞死亡。在某些實施方式中，所述第一細(xì)胞是癌細(xì)胞。在某些實施方式中，本發(fā)明公開提供了一種選擇性地消除或減少受試者中癌細(xì)胞的方法，所述方法包含a)識別所述受試者中癌細(xì)胞的基因組中的靶基因座，所述基因座包含靶多核苷酸序列，其中健康細(xì)胞在其基因組中不包含所述靶多核苷酸序列；和b)向所述受試者施用組合物，所述組合物包含：(i)向?qū)na，所述向?qū)na能夠與所述靶多核苷酸序列雜交，(ii)cas蛋白，和(iii)自殺基因；c)在所述癌細(xì)胞的基因組中的所述基因座處整合所述自殺基因；和d)誘導(dǎo)所述癌細(xì)胞的細(xì)胞死亡。通過考慮以下說明書、所附權(quán)利要求和附圖，將更好地理解本發(fā)明的這些和其它特性、方面和優(yōu)勢。附圖簡述圖1示出在特定于含有染色體易位的靶細(xì)胞的靶序列處插入自殺基因?；?的dna片段易位至基因2的基因座，并融合至基因2的dna片段?；谶B接點周圍的序列來識別特定于含有染色體易位的細(xì)胞的靶序列。圖2示出aavs1基因座的序列。用于設(shè)計向?qū)na的序列(t1和t2)用下劃線標(biāo)出。圖3示出all患者中t(9；22)中的連接序列。染色體9、9q+、22q-和22代表易位前后斷點連接周圍的序列。染色體9來源的序列以大寫字母標(biāo)示；染色體22來源的序列以小寫字母標(biāo)示。含有cas9pam序列(加下劃線)的靶序列通過crisprgrna設(shè)計工具識別。發(fā)明詳述在以上發(fā)明概述和發(fā)明詳述中，以及以下權(quán)利要求書中和附圖中，提及了本發(fā)明的特定特征(包括方法步驟)。應(yīng)當(dāng)理解，說明書中的本發(fā)明公開內(nèi)容包括上述特定特征的全部可能的組合。例如，當(dāng)特定特征公開于本發(fā)明的特定方面或?qū)嵤┓绞?，或特定?quán)利要求的背景下，此時，，在可能的范圍內(nèi)，該特征也可用于與本發(fā)明的其它特定方面和實施方式的背景下，和/或與其組合以及用于本發(fā)明整體。本文使用的術(shù)語“包含”及其語法等效詞是指其它組件、成分、步驟等任選存在。例如，一個“包含”(或“其包含”)組件a、b和c的物品可由組件a、b和c所構(gòu)成(即僅含有以上組件)，或可不但含有組件a、b和c，還含有一種或一種以上的其它組件。當(dāng)本文提及一種包含兩個或兩個以上經(jīng)定義的步驟的方法時，所述經(jīng)定義的步驟可以任何順序進行或同時進行(上下文排除該可能性的情況除外)，且所述方法可包括一個或一個以上的其它步驟，其在任何經(jīng)定義的步驟之前、兩個經(jīng)定義的步驟之間，或在全部經(jīng)定義的步驟之后進行(上下文排除該可能性的情況除外)。在提供了數(shù)值范圍的情況下，應(yīng)當(dāng)理解，受限于所述范圍中明確排除的界限，介于該范圍的上下限之間的每個數(shù)值，至下限單位的十分之一(除非上下文另有明確指示)，以及所述范圍內(nèi)的任何其它所述的或介于其中的數(shù)值，均涵蓋于本公開之內(nèi)。在所述范圍包括一個或兩個界限的情況下，本公開也包括排除了上述包括的界限中的一個或兩個的范圍。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會，為了使說明簡單清楚，在適當(dāng)情況下，參考數(shù)字在不同圖中重復(fù)使用以指示對應(yīng)或類似要素。此外，列出了許多具體細(xì)節(jié)，以便提供對本文所述實施方式的深入理解。然而，本文描述的實施方式在沒有具體細(xì)節(jié)的情況下也可實施。在其它情況下，未對方法、步驟和組件進行詳細(xì)描述，以免模糊所涉及的相關(guān)所述功能。而且，不應(yīng)認(rèn)為說明書是對本文所述實施范圍的限制。應(yīng)當(dāng)理解，除非另有說明，不應(yīng)認(rèn)為本公開中列出的實施方式的描述和表征互相排斥。本發(fā)明公開涉及可用于特異性殺滅靶細(xì)胞的組合物。在一個方面，本申請公開了一種組合物，所述組合物包含：a)向?qū)na，所述向?qū)na能夠與靶細(xì)胞的基因組中的靶序列雜交；b)cas蛋白；和c)編碼自殺基因的多核苷酸。本文所用的“靶序列”是指向?qū)蛄斜辉O(shè)計為與之具有互補性的序列，其中靶序列和向?qū)蛄兄g的雜交促進形成crispr(成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù))復(fù)合物。crispr復(fù)合物的組分以及將crispr復(fù)合物用于基因編輯的機制已有記述(例如，mjinek等人，science，2012，337:816-821；lcong等人，science，2012，339:819-823；pct公開wo2013176772、wo2013169802、wo2014018423和美國專利號8,697,359)。靶序列可為靶細(xì)胞基因組中的任何序列，只要所述靶序列包含前間區(qū)序列鄰近基序(pam)序列，其是在靶序列的3’末端處形成crispr復(fù)合物所需的。示例性的靶序列包括靶細(xì)胞基因組中獨有的序列。例如，對于化膿性鏈球菌(s.pyogenes)cas9，基因組中獨有的靶序列可包括mmmmmmmmnnnnnnnnnnnnxgg形式的cas9靶位點，其中nnnnnnnnnnnnxgg(n是a、g、t或c；且x可為任何核苷酸)在基因組中僅出現(xiàn)一次。在該情況下，nnnnnnnnnnnn與向?qū)na互補，且xgg是pam序列。對于嗜熱鏈球菌(s.thermophilus)crispr1cas9，基因組中獨有的靶序列可包括mmmmmmmmnnnnnnnnnnnnxxagaaw形式的cas9靶位點，其中nnnnnnnnnnnnxxagaaw(n是a、g、t或c；x可為任何核苷酸；且w是a或t)在基因組中僅出現(xiàn)一次。在每一個這樣的序列中，“m”可為a、g、t或c，且在確定序列是否為獨有時無需考慮。在一些實施方式中，所述靶序列特定于靶細(xì)胞的基因組，即所述靶序列在對照細(xì)胞的基因組中不存在。本文所用的“對照細(xì)胞”是指其基因組相比于靶細(xì)胞的基因組缺乏靶序列的細(xì)胞。對照細(xì)胞可為任何細(xì)胞。對照細(xì)胞和靶細(xì)胞可以來源于相同或不同的物種。對照細(xì)胞可以是與靶細(xì)胞相同或不同的類型。在一些實施方式中，對照細(xì)胞和靶細(xì)胞可以取自相同的動物。在一個實施方式中，靶細(xì)胞是癌細(xì)胞且對照細(xì)胞是健康細(xì)胞。在一個實施方式中，所述癌細(xì)胞取自癌癥患者。在一個實施方式中，癌細(xì)胞和健康細(xì)胞均取自同一患者。在一些優(yōu)選實施方式中，對于特定于靶細(xì)胞的靶序列，所述靶序列體現(xiàn)出以下特征：1)所述靶序列特定于靶細(xì)胞但在非靶細(xì)胞中不存在(例如癌細(xì)胞中的靶序列是由染色體重排或易位所形成的區(qū)域，且因此在非癌細(xì)胞中不存在)；2)所述靶序列包括與向?qū)na序列互補的序列以及pam序列，使得crispr復(fù)合物可以在靶序列處形成。靶序列優(yōu)選地(盡管并不必需)位于靶細(xì)胞中染色體的活性或高表達(dá)區(qū)域中?？梢韵胂螅紤]到當(dāng)前的基因組序列技術(shù)(schustersc，next-generationsequencingtransformstoday'sbiology.nat.methods2008，5(1):16–8)，這些序列或者是公共領(lǐng)域中已知的，或者是針對任何給定的靶細(xì)胞或靶細(xì)胞樣本易于定序的。多種特定于靶細(xì)胞的dna序列的實例已有記錄。例如，在癌細(xì)胞背景下，在某些癌癥(例如急性髓性白血病和慢性髓性白血病)中已描述了由染色體易位引起的獨特的異常dna序列。在此類癌癥中，當(dāng)兩個在其它情況下為分離狀態(tài)的基因，通過易位連接在一起時，可造成基因融合，導(dǎo)致所述基因整合的過度表達(dá)以及癌細(xì)胞異常增殖。癌癥相關(guān)性易位的示例性實例包括在伯基特淋巴瘤(8號染色體上的c-myc易位至14號染色體上的免疫球蛋白重基因座)、套細(xì)胞淋巴瘤(11號染色體上的cyclind1易位至免疫球蛋白重基因座)、濾泡性淋巴瘤(bcl-2易位至免疫球蛋白重基因座)、濾泡性甲狀腺癌(2號染色體上的pax-8基因易位至3號染色體上的ppar-γ1基因，并與其融合)、慢性髓性白血病(cml)和急性淋巴細(xì)胞白血病(9號染色體上的abl1基因易位至22號染色體上的bcr(斷點簇區(qū))，并與其融合)中的易位。在上述各例中，可基于易位斷點連接周圍的dna序列來識別特定于癌細(xì)胞的靶序列(參見例如，mjvanderfeltz等人，nucleicacidsres.，1月11日，1989；17(1):1-10；授權(quán)于rossi的美國專利號4,874,853和授權(quán)于saunders等人的美國專利號5,066,792；以及美國授權(quán)前公開號20130209473a1)。在識別可與向?qū)na雜交的靶序列時，靶序列可選自長度約或超過約5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75個或更多的核苷酸的核苷酸序列，包含所述易位的連接點，并在序列的3’末端處包含cas蛋白的pam序列(例如對于化膿性鏈球菌cas9是xgg)?？墒褂胏risprgrna設(shè)計工具(例如，fengzhang實驗室的targetfinder、michaelboutros實驗室的targefinder(e-crisp)、rgentools(cas-offinder)、casfinder、crisproptimaltargetfinder，dna2.0)來識別此類靶序列。在一個實施例中，在來自all患者的癌細(xì)胞中識別此類靶序列，其中9號染色體上的abl1易位至22號染色體上的bcr，并與其融合。值得注意的是，靶向特異性序列不是在靶細(xì)胞和非靶細(xì)胞中均存在的序列(例如導(dǎo)致正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘?xì)胞的癌基因)。靶向特異性序列產(chǎn)生于細(xì)胞發(fā)育(例如癌癥的增長)，其使得基因在癌細(xì)胞中突變或者在癌細(xì)胞中重排或易位，這兩種情況在正常或非癌細(xì)胞中均不存在。識別特定于靶細(xì)胞的靶序列的方法是現(xiàn)有技術(shù)中已知的。示例性方法包括pcr、southern印跡法、微陣列和測序。在一個實施方式中，可對靶細(xì)胞和對照細(xì)胞的基因組進行測序和比較，以識別特定于靶細(xì)胞的序列。例如，garnett等人已系統(tǒng)識別了癌細(xì)胞中的突變癌基因(nature，2012，433:570-575)。對于另一個實施例，nwinhold等人對癌癥中的非編碼調(diào)節(jié)突變進行了基因組范圍的分析，并系統(tǒng)識別了癌癥中的非編碼突變(naturegenetics，2014，46，1160-1165)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會想到可用于識別特定于靶細(xì)胞的序列的其它方法。在一個實施例中，確認(rèn)癌癥患者，并進行活檢以從所述患者獲得癌細(xì)胞。然后對所述癌細(xì)胞的基因組測序并將其與來自相同患者的健康細(xì)胞的基因組相比較。然后識別僅存在于所述癌細(xì)胞基因組中并在3’末端包含pam序列的序列，并當(dāng)特征符合本文列出的參量時將其用作靶序列。本文所用的“向?qū)na”是指指導(dǎo)crispr復(fù)合物序列特異性結(jié)合于靶序列的rna。通常，向?qū)na包含(i)與靶多核苷酸序列具有足夠互補性以與靶序列雜交的向?qū)蛄?，?ii)反式激活cr(tracr)伴侶序列。向?qū)na可進一步包含融合于3’末端的tracrrna，從而形成單一嵌合向?qū)na。cas、向?qū)na、在3’末端具有pam的靶序列和tracrrna(其可與向?qū)na融合或與向?qū)na分離)相連接，形成crispr復(fù)合物。在一些實施方式中，當(dāng)使用適當(dāng)?shù)谋葘λ惴ㄟM行最優(yōu)比對時，向?qū)蛄泻推湎鄳?yīng)靶序列之間的互補度為約或超過約50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更高。可使用用于比對序列的任何適當(dāng)?shù)乃惴▉泶_定最優(yōu)比對，其非限制性的實例包括smith-waterman算法、needleman-wunsch算法、基于以下的算法：burrows-wheeler變換(例如burrowswheeleraligner)、clustalw、clustalx、blat、novoalign(novocrafttechnologies，eland(illumina，加州圣地亞哥)、soap(可在soap.genomics.org.cn可)和maq(可在maq.sourceforge.net獲得)。在一些實施方式中，向?qū)蛄虚L度為約或超過約5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75個或更多的核苷酸。在一些實施方式中，向?qū)蛄虚L度約或小于約75、50、45、40、35、30、25、20、15、12個或更少的核苷酸。向?qū)蛄兄笇?dǎo)crispr復(fù)合物序列特異性結(jié)合于靶序列的能力可通過任何適當(dāng)?shù)臏y定來評估。例如，足以形成crispr復(fù)合物的crispr系統(tǒng)的組分，包括待測試的向?qū)蛄?，可被提供至具有相?yīng)靶序列的宿主細(xì)胞，例如通過采用編碼crispr序列組件的載體轉(zhuǎn)染，然后評估靶序列內(nèi)的優(yōu)選切割，例如通過如本文所述的surveyor測定。類似地，可在測試管中通過以下方式評估靶多核苷酸序列的切割：提供靶序列、crispr復(fù)合物組分，包括待測試的向?qū)蛄泻筒煌跍y試向?qū)蛄械膶φ障驅(qū)蛄?，并比較測試和對照向?qū)蛄蟹磻?yīng)之間靶序列處的結(jié)合或切割率。其它測定是可能的，并將被本領(lǐng)域技術(shù)人員所想到。在一些實施方式中，選擇向?qū)蛄幸詼p少向?qū)蛄袃?nèi)二級結(jié)構(gòu)的程度。二級結(jié)構(gòu)可通過任何適當(dāng)?shù)亩嗪塑账嵴郫B算法確定。一些程序是基于計算最小吉布斯自由能。一個此類算法的實例是如zuker和stiegler所述的mfold(nucleicacidsres.9(1981)，133-148)。另一實例折疊算法是維也納大學(xué)理論化學(xué)研究所開發(fā)的在線網(wǎng)站服務(wù)器rnafold，其使用質(zhì)心結(jié)構(gòu)預(yù)測算法(參見例如a.r.gruber等人，2008，cell106(1):23-24；以及pacarr和gmchurch，2009，naturebiotechnology27(12):1151-62)。本文所用的tracr伴侶序列包括與tracr序列具有足夠互補性的任何序列，以促進以下的一項或多項：(1)在含有相應(yīng)tracr序列的細(xì)胞中切除tracr伴侶序列側(cè)接的向?qū)蛄?；?2)在靶序列處形成crispr復(fù)合物，其中所述crispr復(fù)合物包含雜交至tracr序列的tracr伴侶序列。互補度一般參照tracr伴侶序列和tracr序列的最優(yōu)比對，比對沿兩條序列中較短者的長度進行。最優(yōu)比對可通過任何適當(dāng)?shù)谋葘λ惴▉泶_定，并可進一步解釋二級結(jié)構(gòu)，例如tracr序列或tracr伴侶序列內(nèi)的自我互補。在一些實施方式中，在最優(yōu)比對時，tracr序列和tracr伴侶序列之間沿著二者中較短者的長度的互補度為約或超過約25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％或更高。在一些實施方式中，向?qū)na包含融合至tracr序列的向?qū)蛄?，即tracr序列和tracr伴侶序列包含在單一轉(zhuǎn)錄物內(nèi)，以致二者之間的雜交產(chǎn)生具有二級結(jié)構(gòu)(例如發(fā)夾)的轉(zhuǎn)錄物。在一些實施方式中，tracr序列的長度為約或超過約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50個或更多的核苷酸。用于發(fā)夾結(jié)構(gòu)中的優(yōu)選的成環(huán)序列長度為四個核苷酸，且最為優(yōu)選地，具有序列g(shù)aaa。但也可使用更長或更短的環(huán)序列，以及替代序列。序列優(yōu)選包括核苷酸三連體(例如aaa)，和一個另外核苷酸(例如c或g)。成環(huán)序列的實例包括caaa和aaag。在本申請的一個實施方式中，向?qū)na具有至少兩個或更多個發(fā)夾。在優(yōu)選實施方式中，向?qū)na具有兩個、三個、四個或五個發(fā)夾。在本發(fā)明的進一步實施方式中，向?qū)na具有至多五個發(fā)夾。在一些實施方式中，向?qū)na進一步包括轉(zhuǎn)錄終止序列，優(yōu)選地為多t序列，例如六個t核苷酸。在一些實施方式中，tracr序列是與包含tracr伴侶序列的轉(zhuǎn)錄物分離的轉(zhuǎn)錄物。在某些實施方式中，tracr序列在與向?qū)na分離的載體中(參見例如，美國授權(quán)前公開號20140068797)。本文所用的“cas蛋白”是指結(jié)合向?qū)na并呈現(xiàn)核酸酶活性的多肽。cas蛋白的非限制性實例包括cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9(又稱csn1和csx12)、cas10、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2.csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4，其同源物，或其修飾版本。這些酶使已知的；例如，化膿性鏈球菌cas9蛋白的氨基酸序列可在登記號q99zw2下在swissprot數(shù)據(jù)庫中找到。在一些實施方式中，未修飾的cas蛋白具有dna切割活性。在一些實施方式中，cas蛋白指導(dǎo)對一條或兩條鏈在靶序列位置處的切割，如在靶序列內(nèi)和/或靶序列的補體內(nèi)。在一些實施方式中，cas蛋白指導(dǎo)在自靶序列的首位或末位核苷酸起約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500或更多堿基對之內(nèi)，對一條或兩條鏈進行切割。在一些實施方式中，cas蛋白經(jīng)突變，使得突變的cas蛋白缺乏切割含有靶序列的靶多核苷酸的一條或兩條鏈的能力。例如，來自化膿性鏈球菌的cas9的ruvci催化域中天冬氨酸至丙氨酸替代(d10a)，將cas9從切割兩條鏈的核酸酶轉(zhuǎn)變?yōu)榍锌诿?切割單鏈)。將cas9變成切口酶的其它突變實例包括但不限于h840a、n854a和n863a。本文所用的術(shù)語，前間區(qū)序列鄰近基序(pam)是指緊接cas蛋白靶向的dna序列的dna序列。在一些實施方式中，pam序列位于靶序列的3’末端處，并為cas蛋白成功結(jié)合靶序列所需。pam序列根據(jù)cas蛋白所來源的細(xì)菌種類的不同而不同。例如，來自化膿性鏈球菌的cas9的pam序列是ngg(n可為a、t、c或g中的任意一個)。對于另一實例，腦膜炎奈瑟菌(neisseriameningitides)的pam序列是nnnngatt。嗜熱鏈球菌的pam序列是nnaggaa。齒垢密螺旋體(treponemadenticola)的pam序列是naaaac。本文所用的術(shù)語“自殺基因”是指致使細(xì)胞殺滅自身的基因。在一些實施方式中，自殺基因致使細(xì)胞通過凋亡殺滅自身。自殺基因的非限制性實例包括病毒胸苷激酶、胞嘧啶脫氨酶、針對抗氧化酶的胞內(nèi)抗體(aoes)、細(xì)菌硝基還原酶、半胱天冬酶和脫氧核糖核酸酶(參見maleckim.，frontiersinsuicidegenetherapyofcancer，jgenetsyndrgenether.2012(3)，和其中引用的參照)。在一個實施方式中，自殺基因是病毒胸苷激酶(tk)。胸苷激酶是一種將脫氧胸苷轉(zhuǎn)化為脫氧胸苷5’-單磷酸鹽的atp-胸苷5’-磷酸轉(zhuǎn)移酶，所述脫氧胸苷5’-單磷酸鹽由病毒胸苷激酶進一步磷酸化為脫氧胸苷二磷酸鹽，隨后由核苷二磷酸激酶磷酸化為脫氧胸苷三磷酸酯。脫氧胸苷三磷酸酯由dna聚合酶并入合成dna分子。一些dntp類似物，例如更昔洛韋(gcv)，一種2’-脫氧鳥苷的合成類似物，一旦其并入合成dna則具有終止dna合成的能力。合成的終止觸發(fā)凋亡信號級聯(lián)。雖然gcv不被人胸苷激酶所識別，但被一些病毒胸苷激酶識別為底物，例如單純皰疹病毒-1胸苷激酶(hsv-tk)。因此，表達(dá)hsv-tk的人類細(xì)胞將gcv轉(zhuǎn)化為gcv磷酸鹽，其被進一步磷酸化并并入合成dna中，導(dǎo)致合成的終止和凋亡。在一個實施方式中，自殺基因是胞嘧啶脫氨酶。胞嘧啶脫氨酶將胞嘧啶水解為尿嘧啶并釋放氨。在生理條件下，修飾位點被內(nèi)切核酸酶識別，然后dna中的磷酸二酯鍵斷裂，通過并入新的胞嘧啶啟動修復(fù)。然而，胞嘧啶脫氨酶還可將5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-氟尿嘧啶(5-fu)。因此，一旦提供無毒性前藥5-fc，胞嘧啶脫氨酶則將其轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨拘缘?-fu(一種胸苷酸合成酶的自殺抑制劑)，導(dǎo)致細(xì)胞生長抑制和凋亡。在另一方面中，本申請公開了一種組合物，其包含一個或多個載體，所述載體包含：a)編碼向?qū)na的第一核苷酸序列，所述向?qū)na能夠與靶細(xì)胞的基因組中的靶序列雜交；b)編碼cas蛋白的第二核苷酸序列；和c)編碼自殺基因的第三核苷酸序列；其中所述第一、第二和第三核苷酸序列在相同或不同載體中。在一個實施方式中，所述編碼cas蛋白的第二核苷酸序列可操作地連接至癌特異性啟動子。本文所用的術(shù)語“載體”是指包含特別關(guān)注的基因或核酸序列的多核苷酸分子。通常，該構(gòu)建體還包括合適的調(diào)控序列。例如，所述多核苷酸分子可包括調(diào)控序列，其位于編碼向?qū)na的核苷酸序列、和/或編碼cas蛋白的核苷酸序列、和/或編碼自殺基因的核苷酸序列的5’-側(cè)翼區(qū)中，以能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并表達(dá)期望基因的方式可操作地連接至編碼序列。在一些實施方式中，包含自殺基因的載體進一步包含適用于將自殺基因整合至靶序列的核苷酸序列。例如，所述自殺基因側(cè)接兩個適用于在靶序列周圍重組的區(qū)域。典型地，第一區(qū)域與由在上游與cas蛋白造成的雙鏈斷裂(dsb)緊鄰的序列具有高度同源性，而第二區(qū)域與在下游與dsb緊鄰的序列具有高度同源性。一旦在靶序列處通過cas造成dsb，則靶細(xì)胞內(nèi)源性的同源導(dǎo)向修復(fù)(hdr)裝置被召集至dsb的基因座，并使用該載體作為適宜的模板以在dsb處如實引入自殺基因。在一個實施方式中，當(dāng)靶序列為靶細(xì)胞中的染色體易位所造成時，dsb上游的序列來自一個染色體，而dsb下游的序列來自另一染色體。如此，所述載體不會被用作非靶細(xì)胞中hdr裝置的模板，所述非靶細(xì)胞不含特定于靶細(xì)胞的靶序列?？墒褂帽绢I(lǐng)域公知的方法制備包含編碼向?qū)na的核苷酸序列、和/或編碼cas蛋白的核苷酸序列、和/或編碼自殺基因的核苷酸序列的載體。例如，多核苷酸分子可被制備為較大質(zhì)粒的一部分。此制備允許以如現(xiàn)有技術(shù)已知的有效方式克隆和分離正確的構(gòu)建體。在制備質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化宿主生物體中使用的各種方法是現(xiàn)有技術(shù)中已知的(參見例如，molecularcloningalaboratorymanual，第2版，sambrook、fritsch和maniatis編，coldspringharborlaboratorypress，1989)。在一些實施方式中，載體包含編碼向?qū)na的核苷酸序列。在一些實施方式中，向?qū)na包含tracr序列。在一些實施方式中，向?qū)na和tracr序列在來自一個或兩個載體的兩個獨立的轉(zhuǎn)錄物中表達(dá)。在一些實施方式中，編碼向?qū)na的核苷酸序列和編碼cas蛋白和/或自殺基因的核苷酸序列可在相同或不同載體中。本文所公開的組合物引入靶細(xì)胞中時，可介導(dǎo)在靶序列處整合自殺基因，導(dǎo)致自殺基因的表達(dá)并造成靶細(xì)胞的死亡。在一個實施方式中，自殺基因被整合至特定于靶細(xì)胞的靶序列，導(dǎo)致對靶細(xì)胞的特異性殺滅，而不包含所述靶序列的細(xì)胞存活。在一個實施方式中，自殺基因可操作地連接至調(diào)控元件。在一個實施方式中，調(diào)控元件是啟動子。在一個實施方式中，調(diào)控元件是最小啟動子。在一個實施方式中，所述包含自殺基因的多核苷酸不包含可操作地連接至自殺基因的啟動子；在此種情況下，自殺基因在并入已為活性基因轉(zhuǎn)錄區(qū)的靶序列區(qū)域之后進行表達(dá)。術(shù)語“可操作地連接”是指元件的排列，其中配置所描述的組件以執(zhí)行其通常功能。就啟動子而言，可操作地連接至編碼序列的啟動子將指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。啟動子或其它控制元件無需與編碼序列相接，只要它們具有指導(dǎo)編碼序列表達(dá)的功能即可。例如，在啟動子序列和編碼序列之間可存在插入的未翻譯但已轉(zhuǎn)錄的序列，而啟動子序列仍可被認(rèn)為“可操作地連接”至編碼序列?！皢幼印笔侵竼愚D(zhuǎn)錄特定基因的dna序列。常用于啟動真核細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的啟動子的非限制性實例包括：sv40啟動子、cmv啟動子、ef1a啟動子、ubc啟動子、人β-肌動蛋白啟動子、cag啟動子和四環(huán)素反應(yīng)元件(tre)啟動子。在一個實施方式中，用于本文所述組合物中的啟動子是最小啟動子。當(dāng)編碼自殺基因的多核苷酸整合進入靶細(xì)胞基因組時，最小啟動子啟動自殺基因的低轉(zhuǎn)錄或無轉(zhuǎn)錄。在一個實施例中，最小或核心啟動子是位于相對轉(zhuǎn)錄起始位點的-35至+35區(qū)域之間的啟動子的一部分。其具有以下3個保守序列中的一個或多個：即tata框，啟動區(qū)，rna聚合酶和下游啟動子元件的結(jié)合位點。在此實施例中，將組合物引入靶細(xì)胞中時，除非發(fā)生自殺基因整合，否則組合物不會殺滅靶細(xì)胞。在一個實施方式中，包含自殺基因的多核苷酸不包含可操作地連接至自殺基因的啟動子。在一個實例中，靶序列位于靶細(xì)胞基因組中內(nèi)源性啟動子的附近。當(dāng)自殺基因整合至基因組中靶序列時，自殺基因的轉(zhuǎn)錄由于內(nèi)源性啟動子的存在而啟動。在另一個實施例中，靶序列位于高活性表達(dá)的基因座處(例如b細(xì)胞中的免疫球蛋白基因座)。自殺基因僅整合至在高表達(dá)基因座時才高度表達(dá)并殺滅靶細(xì)胞。在一個實例中，chiarle等人已系統(tǒng)識別了b細(xì)胞中染色體斷裂和重排在基因組范圍的易位，并發(fā)現(xiàn)易位優(yōu)先靶向已轉(zhuǎn)錄的染色體區(qū)域(cell.2011，147(1):107-19)?；谝孜粩帱c連接周圍的dna序列來識別特定于b細(xì)胞的易位的靶序列。當(dāng)未可操作地連接至啟動子的自殺基因整合進入靶序列時，其經(jīng)表達(dá)殺滅b細(xì)胞。相反，未整合的自殺基因不表達(dá)，即便其被引入細(xì)胞。在一些實施方式中，所述靶細(xì)胞是真核細(xì)胞。在一些實施方式中，所述靶細(xì)胞是動物細(xì)胞。在一些實施方式中，所述靶細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞，例如嚙齒動物細(xì)胞(例如小鼠細(xì)胞)和人類細(xì)胞。示例性的靶細(xì)胞包括上皮細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞(例如神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞)、肝細(xì)胞、血細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和腎細(xì)胞。在一些實施方式中，所述靶細(xì)胞是癌細(xì)胞。癌細(xì)胞是指以不受調(diào)控的、加速的步調(diào)生長和分裂的細(xì)胞。癌癥的實例包括急性淋巴細(xì)胞白血病(all)、急性髓性白血病、腎上腺皮質(zhì)癌、肛門癌、、兒童小腦或大腦星形細(xì)胞瘤、基底細(xì)胞癌、膽管癌、膀胱癌、骨瘤、腦癌、小腦星形細(xì)胞瘤、大腦星形細(xì)胞瘤/惡性膠質(zhì)瘤、室管膜瘤、髓母細(xì)胞瘤、幕上原始神經(jīng)外胚瘤、視路和下丘腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌、伯基特淋巴瘤、宮頸癌、慢性淋巴細(xì)胞白血病、慢性髓性白血病、結(jié)腸癌、肺氣腫、子宮內(nèi)膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因氏肉瘤、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、胃部(胃)癌、膠質(zhì)瘤、頭頸癌、心臟癌、霍奇金淋巴瘤、胰島細(xì)胞癌(內(nèi)分泌胰腺)、卡波西肉瘤、腎癌(腎細(xì)胞癌)、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、咽喉癌、前列腺癌、直腸癌、腎細(xì)胞癌(腎癌)、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、尤因氏腫瘤家族、皮膚癌、胃癌、睪丸癌、喉癌、甲狀腺癌、陰道癌。癌癥治療的關(guān)鍵議題是選擇性消除癌細(xì)胞，這在癌細(xì)胞與健康細(xì)胞混合的情況下尤為關(guān)鍵。手術(shù)切除不可避免地將功能性的健康細(xì)胞連同癌細(xì)胞一起除去。放射治療影響所有暴露的細(xì)胞。雖然放射治療依賴于快速增殖的細(xì)胞(例如癌細(xì)胞)對電離輻射較高的敏感性，但一些健康細(xì)胞，包括生殖細(xì)胞、免疫細(xì)胞和內(nèi)分泌系統(tǒng)細(xì)胞也對此敏感，且因此在放射治療中受損。同樣地，化學(xué)療法滲入并影響所有細(xì)胞。大部分化學(xué)療法依賴于快速增殖的細(xì)胞較高的攝入率，以及對有絲分裂的阻斷，從而導(dǎo)致激活凋亡級聯(lián)。然而，包括涉及再生和免疫的健康細(xì)胞群體，也嚴(yán)重受到影響。本文公開的組合物可用于選擇性消除癌細(xì)胞。通過識別特定于癌細(xì)胞的靶序列，所述組合物能夠促進自殺基因選擇性地整合于癌細(xì)胞中，致使癌細(xì)胞殺滅自身。在一個實施方式中，編碼cas蛋白的第二核苷酸序列可操作地連接至癌特異性啟動子。通過將編碼cas蛋白的序列可操作地連接至癌特異性啟動子，cas蛋白的表達(dá)限于癌細(xì)胞。因此，自殺基因整合進入靶細(xì)胞的基因組僅發(fā)生在癌細(xì)胞中。癌特異性啟動子的示例性實例包括表皮生長因子受體(egfr)啟動子、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(tfr)啟動子、癌胚抗原(cea)啟動子、端粒酶啟動子、前列腺特異性抗原(psa)啟動子、細(xì)胞角蛋白18和19(ck19)啟動子和環(huán)氧合酶(cox)啟動子。在另一實施方式中，自殺基因可操作地連接至癌特異性啟動子。如此，經(jīng)整合的自殺基因僅在癌細(xì)胞中表達(dá)，盡管可能發(fā)生一些脫靶整合。大部分人類癌癥是高度異質(zhì)的。單一細(xì)胞在其基因組中可能具有多重突變。因此，在一個方面，本申請公開了一種組合物，所述組合物包含：a)第一向?qū)na，所述第一向?qū)na能夠與靶細(xì)胞的基因組中的第一靶序列雜交；b)第二向?qū)na，所述第二向?qū)na能夠與靶細(xì)胞的基因組中的第二靶序列雜交；c)cas蛋白；和d)編碼自殺基因的多核苷酸。該組合物可用于促進自殺基因整合進入靶細(xì)胞基因組的多個靶序列。在另一個方面，本申請公開了一種組合物，所述組合物包含一個或多個載體，所述載體包含：a)編碼第一向?qū)na的第一核苷酸序列，所述第一向?qū)na能夠與靶細(xì)胞的基因組中的第一靶序列雜交；b)編碼第二向?qū)na的第二核苷酸序列，所述第二向?qū)na能夠與靶細(xì)胞的基因組中的第二靶序列雜交；c)編碼cas蛋白的第三核苷酸序列；和d)編碼自殺基因的第四核苷酸序列；其中所述第一、第二、第三和第四核苷酸序列在相同或不同載體中。癌癥異質(zhì)性不僅存在于單個癌細(xì)胞中，還存在于癌組織內(nèi)的癌細(xì)胞群中，即不同癌細(xì)胞可顯示不同的形態(tài)和表型概況，包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)、基因表達(dá)、代謝、機動性、增殖和轉(zhuǎn)移潛能。因此，癌細(xì)胞的異質(zhì)性為有效治療策略的設(shè)計帶來了重大的挑戰(zhàn)，因為對于一種癌細(xì)胞有效的癌癥療法，對于相同癌組織內(nèi)的另一癌細(xì)胞可能不是有效的。癌癥異質(zhì)性的一個共同特性是基因異質(zhì)性，其可起因于多種來源。一些癌癥是在當(dāng)外在因素引入突變時起始的，例如紫外輻射(例如皮膚癌)和煙草(例如肺癌)。一種更常見的來源是基因組不穩(wěn)定性，其經(jīng)常在細(xì)胞中關(guān)鍵調(diào)控通路被破壞時出現(xiàn)。一些實例包括受損的dna修復(fù)機制，其可導(dǎo)致增加的復(fù)制錯誤和有絲分裂裝置中的缺陷，致使整個染色體大規(guī)模的增加或丟失。因此，在一個方面，本申請公開了一種組合物，所述組合物包含：a)第一向?qū)na，所述第一向?qū)na能夠與多個靶細(xì)胞的基因組中的第一靶序列雜交；b)第二向?qū)na，第二向?qū)na能夠與所述多個靶細(xì)胞的基因組中的第二靶序列；c)cas蛋白；和d)編碼自殺基因的多核苷酸。在另一個方面，本申請公開了一種組合物，所述組合物包含一個或多個載體，所述載體包含：a)編碼第一向?qū)na的第一核苷酸序列，所述第一向?qū)na能夠與多個靶細(xì)胞的基因組中的第一靶序列雜交；b)編碼能第二向?qū)na的第二核苷酸序列，所述第二向?qū)na夠與所述多個靶細(xì)胞的基因組中的第二靶序列雜交；c)編碼cas蛋白的第三核苷酸序列；和d)編碼自殺基因的第四核苷酸序列；其中所述第一、第二、第三和第四核苷酸序列在相同或不同載體中。在一些實施方式中，如上所述的組合物可用于殺滅基因異質(zhì)性的細(xì)胞群體，即所述群體中的細(xì)胞具有基因變異。在一個實施方式中，如上所述的組合物可用于殺滅基因異質(zhì)性的癌細(xì)胞。在一個實施例中，獲取癌細(xì)胞的活檢并對所述癌細(xì)胞的基因組進行測序，識別相比于健康細(xì)胞的基因組，特定于癌細(xì)胞的基因組學(xué)的兩個或更多靶核苷酸序列。設(shè)計能夠與靶核苷酸序列雜交的向?qū)na。引入癌細(xì)胞中后，自殺基因整合至癌細(xì)胞基因組中的靶序列，導(dǎo)致所述癌細(xì)胞的死亡。如此，盡管癌細(xì)胞群體中具有基因異質(zhì)性，自殺基因仍整合進入該群體的基因組，只要各癌細(xì)胞具有至少一個靶序列。在又一個方面中，本申請公開了一種方法，所述方法包括組合物引入靶細(xì)胞，所述組合物包含：a)向?qū)na，所述向?qū)na能夠與靶細(xì)胞的基因組中的靶序列雜交；b)cas蛋白；和c)編碼自殺基因的多核苷酸。在一些實施方式中，所述靶序列特定于所述靶細(xì)胞的基因組。在另一個方面，本申請公開了一種方法，所述方法包括將靶細(xì)胞一個或多個載體接觸，所述載體包含：a)編碼向?qū)na的第一核苷酸序列，所述向?qū)na能夠與靶細(xì)胞的基因組中的靶序列雜交；b)編碼cas蛋白的第二核苷酸序列；和c)編碼自殺基因的第三核苷酸序列；其中所述第一、第二和第三核苷酸序列在相同或不同載體中。在一個實施方式中，所述第二核苷酸序列可操作地連接至癌特異性啟動子?？墒褂脗鹘y(tǒng)的基于病毒和非病毒的轉(zhuǎn)基因方法以在靶細(xì)胞中引入載體?？墒褂么祟惙椒ㄒ詫⒕幋a所述組合物組分的核酸施用于培養(yǎng)中的或宿主生物體中的細(xì)胞。非病毒載體遞送系統(tǒng)包括dna質(zhì)粒、rna(例如本文所述載體的轉(zhuǎn)錄物)、裸核酸、以及與運載工具復(fù)合的核酸，例如脂質(zhì)體、與運載工具復(fù)合的蛋白，例如脂質(zhì)體。病毒載體遞送系統(tǒng)包括dna和rna病毒，其在遞送至細(xì)胞后具有游離或整合的基因組?；蛑委熯^程的綜述參見anderson，science256:808-813(1992)；nabel&felgner，tibtech11:211-217(1993)；mitani&caskey，tibtech11:162-166(1993)；dillon，tibtech11:167-175(1993)；miller，nature357:455-460(1992)；vanbrunt，biotechnology6(10):1149-1154(1988)；vigne，restorativeneurologyandneuroscience8:35-36(1995)；kremer&perricaudet，britishmedicalbulletin51(1):31-44(1995)；haddada等人，在currenttopicsinmicrobiologyandimmunology中，doerfler和bihm(編)(1995)；和yu等人，genetherapy1:13-26(1994)。核酸的非病毒遞送方法包括脂轉(zhuǎn)染、核轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、基因槍、病毒體、脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體、聚陽離子或脂質(zhì)：核酸綴合物、裸dna、人工病毒粒子和試劑增強的dna攝取。脂轉(zhuǎn)染描述于例如美國專利號5,049,386、4,946,787；和4,897,355中)且脂轉(zhuǎn)染試劑是市售的(例如，transfectamtm和lipofectintm)。適用于多核苷酸的有效受體識別脂轉(zhuǎn)染的陽離子和中性脂質(zhì)包括feigner，wo91/17424；wo91/16024中所述的。遞送可至細(xì)胞(例如體外或離體施用)或靶組織(例如，體內(nèi)施用)。脂質(zhì)的制備：核酸復(fù)合物，包括被靶向的脂質(zhì)(例如免疫脂質(zhì)復(fù)合物)，是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(參見例如，crystal，science270:404-410(1995)；blaese等人，cancergenether.2:291-297(1995)；behr等人，bioconjugatechem.5:382-389(1994)；remy等人，bioconjugatechem.5:647-654(1994)；gao等人，genetherapy2:710-722(1995)；ahmad等人，cancerres.52:4817-4820(1992)；美國專利號4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028和4,946,787)。使用基于rna或dna病毒的系統(tǒng)遞送核酸，利用了將病毒靶向至體內(nèi)特定細(xì)胞，并運送病毒負(fù)載至細(xì)胞核的高度進化的進程。病毒載體可直接向患者(體內(nèi))施用，或者可用于在體外治療細(xì)胞，且經(jīng)修飾的細(xì)胞可以被可選地向患者(體內(nèi))施用。傳統(tǒng)的基于病毒的系統(tǒng)可包括用于基因轉(zhuǎn)移的逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)和單純皰疹病毒載體。采用逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒和腺病毒相關(guān)病毒基因轉(zhuǎn)移方法在宿主基因組中的整合是可能的，其經(jīng)常導(dǎo)致經(jīng)插入轉(zhuǎn)基因的長期表達(dá)。此外，在許多不同細(xì)胞類型和靶組織中已觀測到了高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。如本文所公開的，當(dāng)自殺基因未整合進入靶序列時，優(yōu)選地，其表達(dá)最小化。在一個實施方式中，使用基于腺病毒的系統(tǒng)，因為在不存在crispr/cas系統(tǒng)的情況下，其使自殺基因整合進入靶細(xì)胞基因組的可能性較低?；谙俨《镜妮d體能夠在許多細(xì)胞類型中具有非常高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率且不需要細(xì)胞分裂。采用此類載體已獲得了高效價高水平的表達(dá)。該載體可在相對簡單的系統(tǒng)中大量生產(chǎn)。腺病毒相關(guān)病毒(“aav”)載體也可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)具有靶核酸的細(xì)胞，例如，在核酸和肽的體外生產(chǎn)中，以及用于體內(nèi)和離體基因治療過程中(參見例如，west等人，virology160:38-47(1987)；美國專利號4,797,368；wo93/24641；kotin，humangenetherapy5:793-801(1994)；muzyczka，j.clin.invest.94:1351(1994)。在許多出版物中描述了重組aav載體的構(gòu)建，包括美國專利號5,173,414；tratschin等人，mol.cell.biol.5:3251-3260(1985)；tratschin等人，mol.cell.biol.4:2072-2081(1984)；hermonat&muzyczka，pnas81:6466-6470(1984)；和samulski等人，j.virol.63:03822-3828(1989)。通常使用包裝細(xì)胞以形成能夠感染宿主細(xì)胞的病毒顆粒。此類細(xì)胞包括包裝腺病毒的293細(xì)胞，以及包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒的ψ2細(xì)胞或pa317細(xì)胞。通常是通過生產(chǎn)將核酸載體包裝入病毒顆粒的細(xì)胞系，來生成基因治療中使用的病毒載體。所述載體通常含有用于包裝并隨后整合進入宿主所需的最小病毒序列，其它病毒序列被用于待表達(dá)的多核苷酸的表達(dá)盒所替代。缺失的病毒功能通常由包裝細(xì)胞系反式提供。例如，基因治療中使用的aav載體通常僅具有用于包裝和整合進入宿主基因組所需的、來自aav基因組的itr序列。病毒dna包裝于細(xì)胞系中，其含有編碼其它aav基因(即rep和cap)的輔助質(zhì)粒，但缺乏itr序列。所述細(xì)胞系還被作為輔助病毒的腺病毒感染。輔助病毒促進aav載體的復(fù)制，和aav基因從輔助質(zhì)粒的表達(dá)。輔助質(zhì)粒由于缺乏itr序列而未被大量包裝。腺病毒污染可通過例如熱處理以減少。腺病毒對熱處理比aav更敏感。用于將核酸遞送至細(xì)胞的其它方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。參見例如us20030087817，其通過引用并入本文。在一個方面，本申請公開了一種方法，所述方法包含將組合物引入多個靶細(xì)胞，所述組合物包含：a)第一向?qū)na，所述第一向?qū)na能夠與多個靶細(xì)胞的基因組中的第一靶序列雜交的；b)第二向?qū)na，所述第二向?qū)na能夠與多個靶細(xì)胞的基因組中的第二靶序列雜交；c)cas蛋白；和d)編碼自殺基因的多核苷酸。在一個方面，本申請公開了一種方法，所述方法包含將多個靶細(xì)胞與包含一個或多個載體接觸，所述載體包含：a)編碼第一向?qū)na的第一核苷酸序列，所述第一向?qū)na能夠與多個靶細(xì)胞的基因組中的第一靶序列雜交；b)編碼第二向?qū)na的第二核苷酸序列，所述第二向?qū)na能夠與多個靶細(xì)胞的基因組中的第二靶序列雜交；c)編碼cas蛋白的第三核苷酸序列；和d)編碼自殺基因的第四核苷酸序列；其中所述第一、第二、第三和第四核苷酸序列在相同或不同載體中。在一個方面，本申請公開了一種用于治療癌癥的方法，所述方法包含將癌細(xì)胞與一個或多個載體接觸，所述載體包含：a)編碼向?qū)na的第一核苷酸序列，所述向?qū)na能夠與癌細(xì)胞的基因組中的靶序列雜交；b)編碼cas蛋白的第二核苷酸序列；和c)編碼自殺基因的第三核苷酸序列；其中所述第一、第二和第三核苷酸序列在相同或不同載體中。在一個實施方式中，所述靶序列特定于所述癌細(xì)胞的基因組。在一個實施方式中，所述方法進一步包括用例如gcv和5-fc的前藥治療癌細(xì)胞。在另一個方面，本申請公開了一種組合物，所述組合物包含：a)基因靶向或其變體；和b)編碼自殺基因的多核苷酸；其中所述基因靶向或其變體能夠促進自殺基因整合進入靶細(xì)胞的基因組中的靶序列。在一個實施方式中，基因靶向核酸酶是鋅指核酸酶(zfn)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(talen)、cas蛋白或大范圍核酸酶。基因靶向核酸酶能夠在基因組中期待的位點(例如，靶序列)處生成特定的雙鏈斷裂，并利用細(xì)胞的內(nèi)生機制以通過同源重組(hr)和非同源末端連接(nhej)修復(fù)所誘導(dǎo)的斷裂，使自殺基因整合至期望的位點。在某些實施方式中，基因靶向核酸酶的變體是基因靶向重組酶，例如鋅指重組酶(zfr)(proudfoot等人，(2011)zincfingerrecombinaseswithadaptablednaspecificity，plosone6(4):e19537)。在一個方面，本申請公開了一種方法，所述方法通過將一個或多個載體引入被懷疑患有癌癥的受試者以治療所述受試者癌癥，追述載體包含：a)編碼向?qū)na的第一核苷酸序列，所述向?qū)na能夠與癌細(xì)胞的基因組中的靶序列雜交；b)編碼cas蛋白的第二核苷酸序列；和c)編碼自殺基因的第三核苷酸序列；其中所述第一、第二和第三核苷酸序列在相同或不同載體中。在一些實施方式中，受試者是動物，例如，哺乳動物(例如嚙齒動物(例如，小鼠、大鼠、兔)、貓、狗、牛、靈長類和人)。在一些實施方式中，所述方法進一步包括從受試者獲得癌細(xì)胞樣本以進行基因組測序，以識別特定于所述癌細(xì)胞的靶序列。在一些實施方式中，所述方法進一步包括向受試者施用化合物，所述化合物殺滅基因組中整合了自殺基因的癌細(xì)胞，但不殺滅非癌細(xì)胞。在一個實施例中，自殺基因是hsv-tk時所述化合物是gcv。在另一實施例中，自殺基因是胞嘧啶脫氨酶時所述化合物是5-fc。在一個方面，本申請公開了用于如本文所公開的組合物中的向?qū)na。在一個實施方式中，所述向?qū)na包含互補于靶細(xì)胞中第一染色體中序列的第一核苷酸序列；和互補于所述靶細(xì)胞中第二染色體中序列的第二核苷酸序列。通常，第一核苷酸序列長度約為或超過5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個核苷酸，且第二核苷酸序列長度約為或超過5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個核苷酸。在一個實施方式中，所述向?qū)na包含互補于染色體易位的斷點連接周圍的序列的核苷酸序列。在一個方面，本申請公開了一種載體，所述載體包含：(a)編碼自殺基因的多核苷酸；(b)第一同源臂，所述第一同源臂位于編碼所述自殺基因的所述多核苷酸的上游，其中所述第一同源臂包含靶細(xì)胞中第一染色體中的序列；和(c)第二同源臂，所述第二同源臂位于編碼所述自殺基因的所述多核苷酸的下游，其中所述第二同源臂包含所述靶細(xì)胞中第二染色體中的序列。本文所用的“同源臂”是指適于通過同源重組將基因靶向至基因組的多核苷酸。通常，兩條同源臂與待整合進入基因組的基因側(cè)接，其中各同源臂包含位于整合基因座上游和下游的序列。通常，第一同源臂長度約為或超過50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000個堿基對，且第二同源臂長度至少為50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000個核苷酸。實施例1以下是將自殺基因插入細(xì)胞中的靶序列以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的實施例。為測試本申請中所公開策略的功能性，將hsv-tk整合至位于hek293t細(xì)胞19號染色體上ppp1r12c基因中的aavs1(腺病毒相關(guān)病毒整合位點1)基因座。制備cas9和grna表達(dá)構(gòu)建體從addgene(idno：48140)獲得質(zhì)粒px330，其包含兩種表達(dá)盒：人密碼子優(yōu)化的化膿性鏈球菌cas9表達(dá)盒，和表達(dá)單一向?qū)na的u6啟動子驅(qū)動盒。將編碼針對兩個cas9靶標(biāo)，t1和t2(參見圖2)的向?qū)na的dna序列，分別克隆入px330質(zhì)粒的向?qū)na表達(dá)盒(參見ran等人(2013)genomeengineeringusingthecrispr-cas9system，natureprotocols8，2281-2308)。制備包含hsv-tk基因的靶質(zhì)粒使用multisitegatewaythree-fragment載體構(gòu)建試劑盒(lifetechnologies)制備包含hsv-tk基因的靶質(zhì)粒的(參見boudabe和okkenhaug(2013)aprotocolforconstructionofgenetargetingvectorsandgenerationofhomologousrecombinationescells，methodsmolbiol.1064:337-354)。簡而言之，將對應(yīng)于aavs1基因座周圍序列的5’同源臂和3’同源臂，分別插入入門載體。然后將hsv-tk基因插入含有5’同源臂的入門載體。將所得入門載體與目的載體重組以生成靶載體ptarget-hsv-tk-1。作為對照，生成帶有g(shù)fp(綠色熒光蛋白)基因的靶載體(ptarget-gfp)，gfp基因與5’和3’同源臂側(cè)接。該對照靶載體還含有位于gfp基因的3’下游，且在ires(內(nèi)部核糖體進入位點)序列之后的前間區(qū)2序列。通過在載體骨架中接近一個同源臂的限制位點處切割一次來線性化靶質(zhì)粒。將crispr質(zhì)粒和供體dna共轉(zhuǎn)染進入hek293t細(xì)胞根據(jù)制造商的建議維持hek293t細(xì)胞(lifetechnologies)并在37℃和5％co2下在d10培養(yǎng)基(補充了glutamax和10％(體積/體積)fbs的dmem培養(yǎng)基)中培養(yǎng)?；旌蟘rispr質(zhì)粒(500ng)和線性化靶質(zhì)粒(500ng)并使用amaxasf細(xì)胞系4d-nucleofectorx試劑盒s(lonza)制備轉(zhuǎn)染溶液。將轉(zhuǎn)染溶液加至細(xì)胞并通過使用amaxa，cm-130(lonza)電穿孔所述細(xì)胞。將自殺基因插入aavs1基因座共轉(zhuǎn)染三天后，將g418(400ug/ml)加至細(xì)胞培養(yǎng)物以選擇包含靶載體的細(xì)胞。選擇7天后，克隆并擴增細(xì)胞。通過pcr或測序確定各克隆aavs1基因座處的序列，以確認(rèn)hsv-tk基因的插入。結(jié)果顯示t1和t2grna二者均可誘導(dǎo)同源重組以及hsv-tk基因插入aavs1基因座。對于對照靶載體，使用相同實驗方案克隆在aavs1處插入gfp基因的細(xì)胞。選擇性消除插入自殺基因的細(xì)胞對于含有hsv-tk插入的各克隆，加入更昔洛韋(0.5ug/ml)。三天后，在含有hsv-tk的克隆中未發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞。作為對照，更昔洛韋在插入gfp基因的細(xì)胞中未誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。為證實對插入自殺基因的細(xì)胞的選擇性消除，將含有hsv-tk插入的細(xì)胞與含有g(shù)fp基因的細(xì)胞混合。在更昔洛韋處理后，細(xì)胞培養(yǎng)物中僅存活表達(dá)gfp的細(xì)胞。實施例2以下是選擇性消除所關(guān)注細(xì)胞的實施例。在該實施例中，將hsv-tk基因插入含有前間區(qū)序列的細(xì)胞并誘導(dǎo)所述細(xì)胞死亡。如實施例1中公開的插入gfp基因的細(xì)胞在gfp基因的下游處還含有前間區(qū)2序列(seqidno:5)，其在該實施例中用于插入自殺基因。根據(jù)前間區(qū)2序列設(shè)計向?qū)na并將其插入px330載體以生成crispr質(zhì)粒px330-p。靶載體如實施例1中公開的方式構(gòu)建，并且含有hsv-tk基因，其與由gfp基因構(gòu)成的5’同源臂和與實施例1中所用相同的3’同源臂側(cè)接。由此，若通過同源重組插入靶載體，則不會擾亂gfp的表達(dá)。為顯示對含有前間區(qū)序列的細(xì)胞的選擇性消除，將插入了gfp-前間區(qū)序列的hek293t細(xì)胞(參見實施例1)與未修飾的hek293t細(xì)胞混合。將混合的細(xì)胞群分入兩個皿中。一個皿與crispr質(zhì)粒px330-p和靶質(zhì)粒ptarget-hsv-tk-2共轉(zhuǎn)染。另一個皿作為對照，與px330和靶質(zhì)粒ptarget-hsv-tk-2共轉(zhuǎn)染。三天后，將更昔洛韋加至兩個皿中。再一天后使用facs計算各皿中表達(dá)gfp的細(xì)胞的數(shù)目。觀測到在px330-p轉(zhuǎn)染的皿中，表達(dá)gfp的細(xì)胞的百分比顯著下降，表明含有前間區(qū)序列的細(xì)胞被選擇性消除。實施例3以下是在費城陽性急性淋巴細(xì)胞白血病(all)受試者中消除癌細(xì)胞的實施例。在成人all中最常觀測到的染色體畸變是t(9；22)(q34；q11)易位。通過克隆和限制性內(nèi)切圖譜表征來自一個患者的dna的斷點連接片段(nucleicacidsres.jan1989，17(1):1-10)。連接位于外顯子ia和共有外顯子(a2)之間的abl內(nèi)含子中。22號染色體上的斷點位于第一內(nèi)含子中。使用crisprgrna設(shè)計工具(dna2.0)來確定(圖3)和分析連接周圍的序列。識別潛在向?qū)蛄?圖3)。獲得受試者的血樣。通過pcr和測序來表征斷點連接周圍的序列。基于斷點連接周圍的序列設(shè)計向?qū)蛄?。將向?qū)蛄锌寺∪胂俨《鞠嚓P(guān)病毒(aav)/crispr載體(senise等人，biotechnolj.2014，9:1402-12)。將經(jīng)克隆的aav/crispr載體連同aav/hsv-tk載體(kanazawat等人，genether2003，10:51-58)一起包裝進入重組aav。aav/hsv-tk載體含有側(cè)接hsv-tk基因的兩條同源臂，然而各同源臂包含在上游和下游緊鄰斷點連接的序列。aav載體中的hsv-tk可操作地連接至最小啟動子以確保在未整合進入斷點連接的基因座時，hsv-tk的表達(dá)最小化。然后將重組aav遞送入受試者。獲得受試者的血樣以確認(rèn)hsv-tk基因在費城陽性癌細(xì)胞中斷點連接的基因座處的整合和表達(dá)。然后向受度者施用更昔洛韋(gcv)。觀測到費城陽性癌細(xì)胞的細(xì)胞死亡，而健康細(xì)胞未受損傷。序列表<110>朱堅<120>用于選擇性消除所關(guān)注細(xì)胞的方法和組合物<130>063148-8002wo01<150>62/091,431<151>2014-12-12<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>1368<212>prt<213>化膿性鏈球菌<400>1metasplyslystyrserileglyleuaspileglythrasnserval151015glytrpalavalilethraspglutyrlysvalproserlyslysphe202530lysvalleuglyasnthrasparghisserilelyslysasnleuile354045glyalaleuleupheaspserglygluthralaglualathrargleu505560lysargthralaargargargtyrthrargarglysasnargilecys65707580tyrleuglngluilepheserasnglumetalalysvalaspaspser859095phephehisargleuglugluserpheleuvalglugluasplyslys100105110hisgluarghisproilepheglyasnilevalaspgluvalalatyr115120125hisglulystyrprothriletyrhisleuarglyslysleuvalasp130135140serthrasplysalaaspleuargleuiletyrleualaleualahis145150155160metilelyspheargglyhispheleuilegluglyaspleuasnpro165170175aspasnseraspvalasplysleupheileglnleuvalglnthrtyr180185190asnglnleupheglugluasnproileasnalaserglyvalaspala195200205lysalaileleuseralaargleuserlysserargargleugluasn210215220leuilealaglnleuproglyglulyslysasnglyleupheglyasn225230235240leuilealaleuserleuglyleuthrproasnphelysserasnphe245250255aspleualagluaspalalysleuglnleuserlysaspthrtyrasp260265270aspaspleuaspasnleuleualaglnileglyaspglntyralaasp275280285leupheleualaalalysasnleuseraspalaileleuleuserasp290295300ileleuargvalasnthrgluilethrlysalaproleuseralaser305310315320metilelysargtyraspgluhishisglnaspleuthrleuleulys325330335alaleuvalargglnglnleuproglulystyrlysgluilephephe340345350aspglnserlysasnglytyralaglytyrileaspglyglyalaser355360365glnglugluphetyrlyspheilelysproileleuglulysmetasp370375380glythrglugluleuleuvallysleuasnarggluaspleuleuarg385390395400lysglnargthrpheaspasnglyserileprohisglnilehisleu405410415glygluleuhisalaileleuargargglngluaspphetyrprophe420425430leulysaspasnargglulysileglulysileleuthrpheargile435440445protyrtyrvalglyproleualaargglyasnserargphealatrp450455460metthrarglysserglugluthrilethrprotrpasnphegluglu465470475480valvalasplysglyalaseralaglnserpheilegluargmetthr485490495asnpheasplysasnleuproasnglulysvalleuprolyshisser500505510leuleutyrglutyr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