發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及包封在聚合物微粒中的納米粒子，尤其涉及在醫(yī)藥中的用途，并包括用于病癥的治療的方法。還公開了藥物組合物、用于所述微粒的生產(chǎn)的方法和它們的應(yīng)用的方法。

發(fā)明背景

本發(fā)明涉及組合物和產(chǎn)品，以及制備和施用這類組合物和產(chǎn)品的方法，包括用于哺乳動物且尤其是人的治療。

藥物遞送提出了若干重大的挑戰(zhàn)，尤其是關(guān)于作用的部位和持續(xù)時(shí)間。在治療某些腫瘤的情況下，例如，仍然需要能夠?qū)⒖拱┧幬锇邢虻侥[瘤部位的遞送系統(tǒng)，并且其能夠在延長的時(shí)期內(nèi)理想地維持有效的藥物濃度，同時(shí)最小化頻繁地重復(fù)施用藥物的需要。

wo2012/042273和wo2012/042274描述了用于制備固體珠粒的儀器和方法，所述固體珠粒包封生物活性劑，并且其適合用于緩釋中，例如，通過積存注射。

wo2013/042125描述了用于保護(hù)和控制疏水性或親水性的活性劑從具有相反特性的穩(wěn)定的納米粒子的釋放的雙納米包封物。

wo2011/154711描述了糖化的金納米粒子，其充當(dāng)用于遞送肽類諸如胰島素的載體。

wo2011/156711和wo2012/170828描述了治療的或生物作用的膜遞送系統(tǒng)，在所述膜遞送系統(tǒng)中，具有與其結(jié)合或締合的活性物的納米粒子被引入聚合物膜基質(zhì)中。

wo2014/125256描述了用于將生物活性劑靶向到中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)的納米粒子遞送系統(tǒng)，例如，用于治療cns病癥。

對于進(jìn)一步的納米粒子遞送系統(tǒng)、以及對于在適當(dāng)?shù)奈恢煤?或適當(dāng)?shù)某掷m(xù)時(shí)間向受試者遞送這類生物活性劑的方法仍然未得到滿足。本發(fā)明解決了這些和其它需要。

發(fā)明概述

廣泛地，本發(fā)明涉及包封在微米級珠粒中的納米粒子-藥物綴合物(conjugate)。本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，可以以高包埋率將金屬-(例如金-)核納米粒子包封在生物相容性聚合物微粒中。

因此，在第一方面，本發(fā)明提供微粒，其包含至少一種生物相容性聚合物，所述微粒包封至少一種納米粒子，所述納米粒子包括：

(i)核，其包括金屬和/或半導(dǎo)體；

(ii)冠，其包括共價(jià)連接至所述核的多個(gè)配體，其中所述配體包括至少一種碳水化合物和/或谷胱甘肽。

根據(jù)本發(fā)明的這一方面和其他方面，所述至少一種納米粒子優(yōu)選地進(jìn)一步包括至少一種生物活性劑(例如，作為“有效載荷”的藥物活性物)和/或可檢測標(biāo)記物(例如熒光團(tuán))。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些納米粒子即使在不存在另外的活性劑的情況下也表現(xiàn)出生物活性。因此，在本文中具體考慮，納米粒子不需要一定具有任何添加的活性劑。當(dāng)納米粒子確實(shí)包括所述生物活性劑時(shí)，該活性劑通常與納米粒子的核和/或冠相締合。適宜地，該締合可以是共價(jià)連接的形式，例如通過連接到所述納米粒子核或連接到一個(gè)或多個(gè)納米粒子配體的連接體基團(tuán)。例如，烷基和/或二醇連接體可以將活性劑諸如化學(xué)治療劑連接到納米粒子核。在某些情況下，活性劑可以非共價(jià)結(jié)合至所述冠和/或所述核。例如，活性劑可包括肽或多肽，所述肽或多肽非共價(jià)(例如通過靜電相互作用或范德華力或其他方式)結(jié)合至構(gòu)成所述納米粒子的冠的配體。

在某些情況下，所述至少一種生物活性劑可包括化學(xué)治療劑和/或可通過連接體被共價(jià)連接至所述核。

在某些情況下，所述至少一種生物活性劑可通過連接體被共價(jià)連接至所述核，所述連接體包括c2-c15烷基和/或c2-c15二醇。

在某些情況下，所述生物活性劑包括化學(xué)治療劑或“抗-癌”劑，所述生物活性劑可優(yōu)選地選自由以下組成的組：替莫唑胺(temozolomide)、伊立替康(irinotecan)、氯毒素(chlorotoxin)、卡莫司汀(carmustine)、鉑(iv)、鉑(ii)、喜樹堿、阿霉素(doxorubicin)、多西他賽(docetaxel)、美登素、美登木素生物堿(maytansinoids)、一甲基澳瑞他汀e(monomethylauristatine,mmae)和組蛋白脫乙?；?hdac)抑制劑，諸如帕比司他(panobinostat)、伏立諾他(vorinostat)、羅醚酯肽(romidepsin)和西達(dá)本胺(chidamide)。

在某些情況下，所述納米粒子進(jìn)一步包括細(xì)胞、組織或腫瘤靶向部分。由于由納米粒子呈遞的多配體的有利的親合力效應(yīng)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個(gè)靶向部分能夠?qū)⒈疚乃龅募{米粒子靶向某些目標(biāo)部位，例如腫瘤或病變的組織部位、器官類型或特定細(xì)胞類型。在某些情況下，所述靶向部分可選自由以下組成的組：葉酸、乳糖、白蛋白、谷氨酰胺、結(jié)合配體的細(xì)胞表面受體(例如egfr配體，諸如吉非替尼(gefitinib))和抗體，尤其是選擇性地結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原的抗體。

在一些情況下，所述至少一種生物活性劑包括至少一種肽或多肽，所述肽或多肽非共價(jià)結(jié)合至所述冠。例如，所述肽或多肽可選自由以下組成的組：胰島素、glp-1、淀粉不溶素、艾塞那肽(exenatide)、奧曲肽(octreotide)、特立帕肽(teriparatide)、胰高血糖素、細(xì)胞因子和抗體。

在一些情況下，所述納米粒子的冠包括以每納米粒子核至少5個(gè)、至少10個(gè)、至少20個(gè)或至少50個(gè)配體。在某些情況下，所述冠可以是混合的冠。例如所述冠可包括兩種或更多種不同的配體(例如，碳水化合物和非碳水化合物，諸如α-半乳糖和peg胺；谷胱甘肽和碳水化合物；兩種不同的糖類諸如葡萄糖和半乳糖或n-乙酰基葡萄糖胺和乳糖)。第一種配體與第二種配體的比例可以在1:100至100:1的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在80:20至20:80的范圍內(nèi)，還更優(yōu)選地在60:40至40:60的范圍內(nèi)。

在一些情況下，每納米粒子核的所述生物活性劑的分子的數(shù)量選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

在一些情況下，所述納米粒子的核的直徑在1nm至5nm的范圍內(nèi)。在某些情況下，包括其配體的所述納米粒子的直徑可在2nm至50nm的范圍內(nèi)、或在3nm至30nm的范圍內(nèi)、或在4nm至20nm的范圍內(nèi)、或在5nm至15nm的范圍內(nèi)。

在一些情況下，所述納米粒子的核包括金屬，所述金屬選自由以下組成的組：au、ag、cu、pt、pd、fe、co、gd、eu和zn，或其任何組合。在某些情況下，所述納米粒子具有包括金原子的核或由金原子組成的核。

本發(fā)明的這一方面和其他方面的微粒通常具有超過一個(gè)，例如超過10個(gè)、超過100個(gè)、超過1,000個(gè)、超過10,000個(gè)、超過100,000個(gè)、超過10⁶個(gè)、超過10⁷個(gè)或超過10⁸個(gè)包封在其中的獨(dú)立的納米粒子。

在某些情況下，所述微粒包括多個(gè)所述納米粒子，其中在所述微粒中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的納米粒子具有綴合至或結(jié)合至其的至少一種生物活性劑。

在某些情況下，所述微粒包括至少兩種不同種類的生物活性劑。優(yōu)選地，與單獨(dú)的任一種物質(zhì)相比，所述至少兩種不同種類的生物活性劑協(xié)同地起作用以增強(qiáng)或以其他方式提高生物或治療活性。本文具體考慮的實(shí)施例是胰島素和glp-1、兩種或更多種化學(xué)治療劑、與抗癌藥物抗性的抑制劑組合的化學(xué)治療劑。

在某些情況下，所述至少兩種不同種類的生物活性劑包括第一生物活性劑和第二生物活性劑。在一些情況下，所述第一生物活性劑被綴合或結(jié)合至第一納米粒子，且所述至少兩種不同種類的生物活性劑的第二種被綴合或結(jié)合至第二納米粒子。所述兩個(gè)或更多個(gè)納米粒子然后可有利地存在于單個(gè)微粒內(nèi)(即兩個(gè)不同的納米粒子)?？商娲鼗蛄硗?，所述至少一種納米粒子可具有綴合至或結(jié)合至其的至少兩種不同種類的生物活性劑(即組合有效載荷納米粒子)。

在一些情況下，所述微粒沿其最長維度的直徑在1μm至900μm、5μm至500μm、10μm至100μm或25μm至75μm的范圍內(nèi)。在一些情況下，所述微粒的形態(tài)是基本上球形的。不希望被任何特定理論所限，本發(fā)明人認(rèn)為球形提供更大的結(jié)構(gòu)抗性，例如對壓差的抗性。在一個(gè)特別考慮的形式中，所述微粒是球形的并包括與化學(xué)治療劑諸如替莫唑胺或卡莫司汀綴合的納米粒子。這類微?？砂l(fā)現(xiàn)用于治療腦腫瘤，包括繼發(fā)性腫瘤，其中微粒在手術(shù)切除后或手術(shù)切除時(shí)被植入，例如以預(yù)防或抑制癌癥復(fù)發(fā)。由于其結(jié)構(gòu)上更堅(jiān)固的形狀，球形微粒預(yù)計(jì)將克服在這種治療環(huán)境中用卡莫司汀植入膜劑(gliadelwafer)已經(jīng)看到的缺陷。然而，其他非球形的形狀在本文中具體考慮。在某些情況下，本發(fā)明的微粒可以是相對扁平的或圓盤形的，例如，微粒形態(tài)可以是透鏡狀的。

在某些情況下，本發(fā)明的所述微粒的表面孔隙度的特征在于<20nm、<100nm、<1μm或<10μm的平均表面孔隙大小。如在wo2012/042274(通過引用以其整體并入本文)中所述，某些工藝條件諸如第二液體的溫度和/或第二液體的ph(例如ph3至ph9)。

根據(jù)本發(fā)明的這一方面和其他方面，所述至少一種生物相容性聚合物可以是在wo2012/042274(通過引用以其整體并入本文——具體見其第9頁和第10頁)中公開的任何聚合物。在某些情況下，所述聚合物可選自由以下組成的組：聚交酯(polylactide)、聚己內(nèi)酯、聚酐以及乳酸和乙醇酸的共聚物(“plga”)。所述聚合物的平均分子量(mw)可從4kda(kdaltons)至700kda、優(yōu)選地從4kda至120kda、更優(yōu)選地從4kda至15kda。在某些情況下，聚合物端基和固有粘度可如wo2012/042274(通過引用以其整體并入本文-具體見其第9頁和第10頁)中所述。在某些情況下，所述聚合物包括至少一個(gè)端基或末端官能團(tuán)，所述端基或末端官能團(tuán)選自由以下組成的組：羧基、羥基和酯基。

不希望受任何特定理論的約束，本發(fā)明人認(rèn)為納米粒子在微粒內(nèi)的包封率和/或納米粒子從微粒中釋放的速率或程度，例如，在使用中，可由于納米粒子冠和聚合物基質(zhì)之間的相互作用而受到影響(增加或減少)，例如通過選擇結(jié)合至存在于構(gòu)成所述納米粒子冠的一個(gè)或多個(gè)配體上的官能團(tuán)的聚合物端基而受到影響(增加或減少)。本文中考慮的這樣的一個(gè)實(shí)施例是如下的微粒，其中所述至少一種生物相容性聚合物包括具有羧基端基的乳酸和乙醇酸的共聚物(“plga”)，且所述納米粒子冠包括至少一個(gè)胺基。具體地，納米粒子可包括peg胺配體的冠和α-半乳糖配體的冠，所述peg胺配體諸如1-氨基-17-巰基-3,6,9,12,15,-五氧雜-十七烷醇，所述α-半乳糖配體諸如2-硫代-乙基-α-d-半乳糖苷。因此，在本發(fā)明的某些情況下，所述聚合物或共聚物包括至少一個(gè)端基或末端官能團(tuán)，其與所述納米粒子的冠上存在的官能團(tuán)結(jié)合。

在某些情況下，根據(jù)本發(fā)明，所述至少一種生物相容性聚合物可具有在1:1至1:0的范圍內(nèi)的丙交酯與乙交酯的比例(“l(fā)/g比例”)，任選地具有在70:30至90:10的范圍內(nèi)的丙交酯與乙交酯的比例。l/g比例被認(rèn)為影響體內(nèi)微粒分解的速率，并因此影響納米粒子和/或活性物從微粒釋放的持續(xù)時(shí)間。

在某些情況下，所述納米粒子基本上均勻分布于整個(gè)微粒。例如，在某些情況下，依據(jù)每單位體積微粒的納米粒子的數(shù)量測量的納米粒子的密度的變化不超過平均值的50％、不超過20％或不超過10％。納米粒子在所述微粒內(nèi)的分布，例如，可由電子顯微鏡測定。納米粒子可為可見的和可計(jì)數(shù)的，并且如果需要，可應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析來計(jì)算納米粒子分布均勻性的量度。

在某些情況下，所述納米粒子在所述微粒內(nèi)的分布偏向所述微粒的表面。例如，超過50％、超過80％或超過90％的所述納米粒子相比所述微粒的中心更接近位于所述微粒的表面。如上所述，納米粒子在所述微粒內(nèi)的分布，例如，可由電子顯微鏡測定。納米粒子可為可見的和可計(jì)數(shù)的，并且如果有必要，可應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析來計(jì)算納米粒子分布不均勻性的量度。

在某些情況下，以每重量微粒聚合物中的納米粒子的重量％(w/w)表示的納米粒子的平均濃度在0.01％至25％w/w的范圍內(nèi)，任選地在0.05％至10％w/w的范圍內(nèi)。

在某些情況下，當(dāng)存在生物活性劑時(shí)，以每重量的微粒聚合物中的生物活性劑的重量％表示的生物活性劑的平均濃度在0.005％至20％w/w，例如，0.01％至10％w/w的范圍內(nèi)。

如本文所述，本發(fā)明的微粒有利地提供臨床使用中的緩釋。在某些情況下，在哺乳動物受試者中積存注射微粒之后，所述微粒的體內(nèi)釋放行為(profile)(即，納米粒子，特別是具有藥物的有效載荷的納米粒子從微粒的釋放)在1周至6個(gè)月的范圍內(nèi)，任選地在3周至3個(gè)月的范圍內(nèi)。釋放行為可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(例如動物模型)和/或可以使用藥物釋放的一種或多種體外測定進(jìn)行建模來確定。優(yōu)選地，釋放行為使得納米粒子釋放到體內(nèi)(例如細(xì)胞或細(xì)胞外空間)的速率基本上比在不存在包封(例如直接注射的納米粒子的懸浮液)的情況下納米粒子的釋放速率更慢。在優(yōu)選的情況下，在本文中基本上更慢是指慢至少10倍、20倍、50倍或100倍。

在第二方面，本發(fā)明提供藥物組合物，所述藥物組合物包含多個(gè)本發(fā)明第一方面的微粒和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。

在一些情況下，所述藥物組合物包含抗凝結(jié)劑。所述抗凝結(jié)劑可采用施加到微粒的涂層的形式，例如，甘露醇。

在一些情況下，載體是含水的或有機(jī)的液體，諸如生物相容性油。在一些情況下，在一些情況下，藥物組合物采用適于例如在使用前重構(gòu)的微粒的凍干粉末形式。

在某些情況下，藥物組合物可以被配制成用于通過可注射途徑遞送，諸如皮下或肌內(nèi)積存注射，或者被配制成用于在外科手術(shù)過程中植入。

在第三方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的第一方面的微?；虮景l(fā)明的第二方面的藥物組合物在醫(yī)藥中的用途。

在第四方面，本發(fā)明提供第一方面的微?；虻诙矫娴乃幬锝M合物在哺乳動物受試者中治療癌癥、內(nèi)分泌病癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)病癥或眼部病癥的方法中的用途。

在一些情況下，所述微粒包含化學(xué)治療劑，且所述微?；蚪M合物用于治療癌癥，所述癌癥選自由以下組成的組：腦癌，諸如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤或星形細(xì)胞瘤；卵巢癌；肝癌和皮膚癌。在一些情況下，所述化學(xué)治療劑選自由以下組成的組：替莫唑胺、伊立替康、氯毒素、卡莫司汀、鉑(iv)、鉑(ii)、喜樹堿、阿霉素、多西他賽、美登素、美登木素生物堿、一甲基澳瑞他汀e(mmae)和組蛋白脫乙?；?hdac)抑制劑，諸如帕比司他、伏立諾他、羅醚酯肽和西達(dá)本胺。

在第五方面，本發(fā)明提供在哺乳動物受試者中治療癌癥、內(nèi)分泌病癥或中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)病癥或眼部病癥的方法，包括向需要所述治療的受試者施用治療有效量的本發(fā)明的第一方面的微粒或本發(fā)明的第二方面的藥物組合物。

在一些情況下，所述方法是治療癌癥的方法，所述癌癥選自由以下組成的組：腦癌，任選地成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤或星形細(xì)胞瘤；卵巢癌；肝癌和皮膚癌。在一些情況下，所述化學(xué)治療劑選自由以下組成的組：替莫唑胺、伊立替康、氯毒素、卡莫司汀、鉑(iv)、鉑(ii)、喜樹堿、阿霉素、多西他賽、美登素、美登木素生物堿、一甲基澳瑞他汀e(mmae)和組蛋白脫乙?；?hdac)抑制劑，諸如帕比司他、伏立諾他、羅醚酯肽和西達(dá)本胺。

根據(jù)微?；蛩幬锝M合物在本發(fā)明的第四方面的用途或本發(fā)明的第五方面的方法，劑量的施用之間的時(shí)間間隔可為至少一周，諸如至少2周、至少3周或至少4周，并且優(yōu)選地至少1月、2月、3月、4月、5月或6月。

在第六方面，本發(fā)明提供制品，其包括：

本發(fā)明的第一方面的微?；虮景l(fā)明的第二方面的藥物組合物；

用于容納所述微?；蛩幬锝M合物的容器；和

插入物和/或標(biāo)簽。

在某些情況下，所述插入物和/或標(biāo)簽提供說明、劑量和/或施用信息，所述說明、劑量和/或施用信息是關(guān)于在哺乳動物受試者中所述微?；蛩幬锝M合物在癌癥、內(nèi)分泌病癥或中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)病癥或眼部病癥中的使用。

在第七方面，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)本發(fā)明的第一方面的微粒的方法，所述方法包括：

提供第一液體，所述第一液體包含溶質(zhì)、溶劑和旨在被包封在所述微粒內(nèi)的多個(gè)納米粒子，所述溶質(zhì)包含聚合物，在所述第一液體中的聚合物的濃度為至少10％w/v，“w”為所述聚合物的重量，且“v”為所述溶劑的體積，所述納米粒子包括：(i)核，其包括金屬和/或半導(dǎo)體；和(ii)冠，其包括共價(jià)連接至所述核的多個(gè)配體，其中所述配體包括至少一種碳水化合物和/或谷胱甘肽；

提供液滴發(fā)生器，其包括可操作以產(chǎn)生液滴的壓電元件，

引起所述液滴發(fā)生器形成所述第一液體的液滴；

使所述液滴通過氣體，

使所述液滴與第二液體接觸，以使所述溶劑離開所述液滴，從而形成固體微粒；

在所述第二液體中的所述溶劑的溶解度為至少5g溶劑/100ml第二液體，所述溶劑與第二液體是基本上可混溶的，

其中所述第二液體作為流提供，并且所述方法包括將所述液滴與第二液體流接觸。

在某些情況下，所述納米粒子提供在有機(jī)溶劑:水混合相中，任選地為dmso:水混合相，且進(jìn)一步任選地為dmso:水比例在80:20至95:5的范圍內(nèi)的dmso:水混合相中。如本文所述的生物相容性納米粒子通常以水性懸浮液的形式提供。本發(fā)明人已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)在dmso混合水相(例如90:10的dmso:水)中制備納米粒子(諸如金核谷胱甘肽或糖化的納米粒子)是可能的。dmso:水混合相提供了與微粒生產(chǎn)方法(例如如在wo2012/042274中所述)的一定的有利的相容性。具體地，這解決了諸如plga的聚合物不溶于水的問題。因此，使用在混合相中提供的高濃度納米粒子特別適用于本發(fā)明的該方面的方法中。

在某些情況下，所述第一液體包括dmso、聚-丙交酯-共-乙交酯共聚物(“plga”)和納米粒子，所述納米粒子如與本發(fā)明的第一方面有關(guān)所定義的。

在某些情況下，所述第二液體可如wo2012/042274(其內(nèi)容通過引用明確地并入本文-參見，例如，其第13頁至第15頁)中所定義的。在某些情況下，所述第二液體包括水。所述第二液體可包括水-醇混合物(例如，具有在95:5至75:25的范圍內(nèi)的水:醇比例)。在特定情況下，所述第二液體可包括水和叔-丁醇的混合物(例如85:15的水:叔-丁醇)。

根據(jù)本發(fā)明的這一方面，所述第二液體可具有如wo2012/042274(其內(nèi)容通過引用明確地并入本文)中所述的溫度。在某些情況下，所述第二液體的溫度可在1℃至10℃，諸如4℃至8℃的范圍內(nèi)。

在一些情況下，在所述第一液體中的聚合物的濃度可為至少20％w/v、至少30％w/v或至少40％w/v。

在一些情況下，本發(fā)明的這一方面的方法采用如wo2012/042274(其內(nèi)容通過引用明確地并入本文-參見，例如，其第17頁至第23頁)中所述的設(shè)備。在一些情況下，本發(fā)明的這一方面的方法采用如wo2012/042273(其內(nèi)容通過引用明確地并入本文-參見，例如，其權(quán)利要求1至權(quán)利要求47)中所述的設(shè)備。

在一些情況下，所述方法進(jìn)一步包括任選在真空下，通過將所述固體微粒與第二液體分離來收集所述固體微粒。在某些情況下，收集所述微粒的步驟采用如wo2013/014466(其內(nèi)容通過引用明確地并入本文-參見，例如，其權(quán)利要求1至權(quán)利要求30)中所述的珠粒收集設(shè)備。分離所述固體微粒的方法可如wo2013/014466(其內(nèi)容通過引用明確地并入本文-參見，例如，其權(quán)利要求32至權(quán)利要求35)中所述。

在一些情況下，所述方法進(jìn)一步包括收集所述固體微粒并將所述微粒配制或包裝入藥物組合物或遞送形式。在某些情況下，該方式包括冷凍干燥所述微粒和/或使所述微粒經(jīng)受滅菌步驟。在一些情況下，所述微?？杀慌渲瞥捎糜谕ㄟ^積存注射遞送的液體。

在一些情況下，本發(fā)明的這一方面的方法進(jìn)一步包括其中生產(chǎn)納米粒子的先前階段，所述先前階段包括：

將包含谷胱甘肽和/或硫衍生化的碳水化合物(例如，連接到糖基(諸如單糖、二糖或多糖)的硫代烷基或硫代二醇連接體)的溶液與包含核形成材料(例如金鹽)的溶液以及還原劑(例如硼氫化鈉)合并，從而引起所述納米粒子自組裝。

在某些情況下，生產(chǎn)納米粒子的所述先前階段進(jìn)一步包括將所述生物活性劑綴合或結(jié)合至所述納米粒子。當(dāng)綴合涉及將活性物與納米粒子綴合的共價(jià)連接的連接體時(shí)，這有利地在自組裝工藝過程中實(shí)現(xiàn)。具體地，生產(chǎn)納米粒子的先前階段可包括提供共價(jià)連接到活性劑的硫衍生化的連接體(例如硫代烷基、硫代二醇或硫代烷基聚二醇)，并合并：

包含共價(jià)連接到所述活性劑的硫衍生化的連接體的溶液；

包含谷胱甘肽和/或硫衍生化的碳水化合物的溶液；

包含核形成材料的溶液；和

還原劑。所述硫衍生化的化合物通常以氧化形式作為二硫化物被提供，其允許一旦添加還原劑就進(jìn)行自組裝過程。

在一些情況下，共價(jià)連接到所述活性劑的所述硫衍生化的連接體包括共價(jià)連接至所述活性劑的硫代烷基連接體和/或硫代二醇連接體。

在一些情況下，尤其當(dāng)生物活性劑包括肽或多肽時(shí)，納米粒子可以首先產(chǎn)生，并與包含肽或多肽的溶液以及允許非共價(jià)結(jié)合至所述納米粒子冠的肽或多肽接觸。

根據(jù)本發(fā)明的所有方面，所述微粒以及用于其生產(chǎn)的方法可以是無菌的。另外或可替代地，所述納米粒子以及用于其生產(chǎn)的方法可以是無菌的。然而，本文特別考慮到所述納米粒子的生產(chǎn)和/或所述微粒的生產(chǎn)包括一個(gè)或多個(gè)滅菌步驟。

在第八方面，本發(fā)明提供了當(dāng)向哺乳動物受試者施用時(shí)，用于延長生物活性劑的體內(nèi)半衰期的方法，所述方法包括：

提供至少一種具有與其結(jié)合或綴合的活性劑的納米粒子，所述納米粒子包括：(i)核，其包括金屬和/或半導(dǎo)體；和(ii)冠，其包括共價(jià)連接至所述核的多個(gè)配體，其中所述配體包括至少一種碳水化合物和/或谷胱甘肽；和

將所述至少一種納米粒子包封在生物相容性聚合物微粒中。在一些情況下，所述納米粒子可如本發(fā)明的第一方面有關(guān)所定義的。在一些情況下，所述微粒可如根據(jù)本發(fā)明的第一方面所定義的。

根據(jù)本發(fā)明，尤其第四方面和第五方面，受試者可以是人、伴侶動物(例如狗或貓)、實(shí)驗(yàn)動物(例如小鼠、大鼠、兔、豬或非人類靈長類動物)、家畜或農(nóng)畜(例如豬、牛、馬或羊)。優(yōu)選地，受試者是人。

本發(fā)明包括所描述的方面和優(yōu)選的特征的組合，除了這種組合是明顯不允許的或者被規(guī)定明確避免的。本發(fā)明的這些方面和進(jìn)一步的方面和實(shí)施方案在下面進(jìn)一步詳細(xì)描述，并且參考所附的實(shí)施例和附圖。

附圖簡述

圖1顯示納米粒子的示意圖，所述納米粒子具有比例為1:1的α-半乳糖:peg胺的多個(gè)配體和金核。

圖2顯示球形微粒的電子顯微鏡圖像。顯示的是50μm比例尺。

圖3顯示本發(fā)明微粒的“剖面(cut-away)”示意圖。顯示了包封在微粒中的納米粒子(不按比例)。

圖4顯示如實(shí)施例3的試驗(yàn)1中所述產(chǎn)生的微粒的電子顯微照片。比例尺顯示為50μm。

圖5顯示382nm處的吸光度對金濃度(μg/ml)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

發(fā)明詳述

在描述本發(fā)明時(shí)，將采用下述術(shù)語，并且這些術(shù)語旨在如下所示進(jìn)行定義。

納米粒子

如本文所用，“納米粒子”是指具有納米尺度的粒子，并且不旨在表示任何特別的形狀限制。尤其是，“納米粒子”包括納米球、納米管、納米盒、納米簇、納米棒等。在某些實(shí)施方案中，本文考慮的納米粒子和/或納米粒子核具有總的為多面體或球形的幾何形狀。

包含多個(gè)含碳水化合物的配體的納米粒子已在例如wo2002/032404、wo2004/108165、wo2005/116226、wo2006/037979、wo2007/015105、wo2007/122388、wo2005/091704(其各自的全部內(nèi)容通過引用明確地并入本文)中進(jìn)行了描述，并且這種納米粒子可以根據(jù)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)用途。

如本文所用，“冠”是指層或涂層，其可以部分地或完全地覆蓋納米粒子核的暴露表面。冠包括多個(gè)配體，所述配體通常包括至少一個(gè)碳水化合物部分、一個(gè)表面活性劑部分和/或一個(gè)谷胱甘肽部分。因此，冠可被認(rèn)為是圍繞或部分圍繞金屬核的有機(jī)層。在某些實(shí)施方案中，冠提供和/或參與納米粒子的核的鈍化。因此，在某些情況下，冠可以包括充分完整的涂層，以基本上使半導(dǎo)體或含金屬的核穩(wěn)定。然而，本文特別考慮具有核(例如，包括由貴金屬涂覆的含金屬氧化物的內(nèi)核)的某些納米粒子可包括僅部分涂覆核表面的冠。在某些情況下，冠促進(jìn)本發(fā)明的納米粒子的溶解度，諸如水溶解度。

納米粒子為小粒子，例如金屬或半導(dǎo)體原子的簇，其可用作固定配體的基底。

優(yōu)選地，納米粒子具有平均直徑在0.5與50nm之間，更優(yōu)選地在0.5與10nm之間，更優(yōu)選地在0.5與5nm之間，更優(yōu)選地在0.5與3nm之間，還要更優(yōu)選地在0.5與2.5nm之間的核。當(dāng)除了核以外還考慮配體時(shí)，優(yōu)選地，粒子的總平均直徑在2.0與20nm之間，更優(yōu)選地在3與10nm之間，并且最優(yōu)選地在4與5nm之間。可使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)諸如透射電子顯微鏡法來測量平均直徑。

核材料可以為金屬或半導(dǎo)體(所述半導(dǎo)體任選地包括金屬原子或?yàn)橛袡C(jī)半導(dǎo)體)并且可由超過一種類型的原子形成。優(yōu)選地，核材料為選自au、fe或cu的金屬。納米粒子核也可由包括au/fe、au/cu、au/gd、au/fe/cu、au/fe/gd和au/fe/cu/gd的合金形成，并可用于本發(fā)明。優(yōu)選的核材料為au和fe，最優(yōu)選的材料為au。納米粒子的核優(yōu)選地包括約100與500個(gè)之間的原子(例如金原子)以提供納米范圍內(nèi)的核直徑。其它特別有用的核材料摻雜有一種或多種具有nmr活性的原子，允許使用nmr在體外和體內(nèi)檢測納米粒子。nmr活性原子的實(shí)施例包括mn⁺²、gd⁺³、eu⁺²、cu⁺²、v⁺²、co⁺²、ni⁺²、fe⁺²、fe⁺³和鑭系元素⁺³，或在本申請其它地方描述的量子點(diǎn)。

包括可作為納米尺度半導(dǎo)體晶體而檢測的半導(dǎo)體化合物的納米粒子核能夠充當(dāng)量子點(diǎn)，即它們可吸收光從而將材料中的電子激發(fā)至更高的能級，隨后在該材料特有的頻率下釋放光子。半導(dǎo)體核材料的實(shí)例為硒化鎘、硫化鎘、碲化鎘。也包括鋅化合物，諸如硫化鋅。

在一些實(shí)施方案中，納米粒子或其配體包括可檢測的標(biāo)記物。標(biāo)記物可以為納米粒子的核或配體的元素。由于納米粒子的該元素的固有性質(zhì)，或通過與可檢測的另外部分連接、綴合或締合，該標(biāo)記物可被檢測。標(biāo)記物的優(yōu)選的實(shí)例包括為熒光基團(tuán)、放射性核素、磁性標(biāo)記物或染料的標(biāo)記物。熒光基團(tuán)包括熒光素、若丹明或四甲基若丹明、德克薩斯紅(texas-red)、cy3、cy5等，并且可以通過激發(fā)熒光標(biāo)記物并用拉曼散射光譜(ramanscatteringspectroscopy)檢測發(fā)出的光而檢測(y.c.cao,r.jin,c.a.mirkin,science2002,297:1536-1539)。在一些情況下，可檢測的標(biāo)記物可包括異硫氰酸熒光素(fitc)。在某些情況下，可檢測的標(biāo)記物(例如fitc)可被共價(jià)連接至納米粒子的核，例如通過連接體。

在一些實(shí)施方案中，納米粒子可包括放射性核素，其用于使用由放射性核素發(fā)出的放射性來檢測納米粒子(例如，通過使用pet、spect)或用于治療(即，用于殺傷靶細(xì)胞)。本領(lǐng)域常用的能夠容易地加以修改而用于本發(fā)明的放射性核素的實(shí)例包括^99mtc，其以多種氧化態(tài)存在，但最穩(wěn)定的是tco^4-；³²p或³³p；⁵⁷co；⁵⁹fe；⁶⁷cu，其通常作為cu²⁺鹽使用；⁶⁷ga，其通常作為ga³⁺鹽使用，例如檸檬酸鎵；⁶⁸ge；⁸²sr；⁹⁹mo；¹⁰³pd；¹¹¹in，其通常作為in³⁺鹽使用；¹²⁵i或¹³¹i，其通常作為碘化鈉使用；¹³⁷cs；¹⁵³gd；¹⁵³sm；¹⁵⁸au；¹⁸⁶re；²⁰¹tl，其通常作為tl⁺鹽使用，諸如氯化鉈；³⁹y³⁺；⁷¹lu³⁺和²⁴cr²⁺。放射性核素作為標(biāo)記物和示蹤劑的一般使用是本領(lǐng)域熟知的并且可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地修改而用于本發(fā)明的多個(gè)方面。放射性核素可通過以下方式最容易地使用：摻雜納米粒子的核或包括它們而作為固定在納米粒子上的配體的一部分而存在的標(biāo)記物。

活性物

如本文所用，術(shù)語“生物活性劑”是指包括對生物系統(tǒng)施加作用，優(yōu)選地治療作用的藥物和前體藥物。本文考慮的活性劑的分類包括小分子有機(jī)化合物、肽、多肽和核酸。具體的實(shí)例包括：化學(xué)治療劑(例如替莫唑胺、伊立替康、氯毒素、卡莫司汀、鉑(iv)、鉑(ii)、喜樹堿、阿霉素、多西他賽、美登素、美登木素生物堿、一甲基澳瑞他汀e(mmae)和/或組蛋白脫乙?；?hdac)抑制劑諸如帕比司他、伏立諾他、羅醚酯肽和西達(dá)本胺)；肽或多肽(例如胰島素、glp-1、淀粉不溶素、艾塞那肽、奧曲肽、特立帕肽、胰高血糖素、細(xì)胞因子和/或抗體)；dna或rna(包括例如sirna)。

微粒

根據(jù)本發(fā)明的微?？梢詾楣腆w珠粒的形式。如本文所用，關(guān)于微?；蛑榱?，固體旨在包括凝膠。如本文所用的微粒特別包括微米尺度(通常直徑高達(dá)999μm)的任何聚合物粒子或珠粒。本文考慮的微粒有利地包括通過wo2012/042274(其全部內(nèi)容通過引用明確地并入本文-參見，例如，其權(quán)利要求1至權(quán)利要求44)中描述的方法可獲得的單分散聚合物珠粒。

納米粒子包封在微粒中的方法

在某些情況下，微粒通過如wo2012/042274(其全部內(nèi)容通過引用明確地并入本文-參見，例如，其權(quán)利要求1至44)中描述的q方法產(chǎn)生。

施用和治療

可將本發(fā)明的微粒和組合物通過多種不同的途徑(包括腸內(nèi)或腸胃外途徑)施用給患者。腸胃外施用包括通過以下途徑施用：靜脈內(nèi)、皮膚或皮下、鼻腔、肌內(nèi)、眼內(nèi)、經(jīng)上皮、腹膜內(nèi)和局部(包括皮膚、眼、直腸、鼻腔、吸入和氣溶膠)以及直腸系統(tǒng)途徑。

施用通過例如注射、尤其是積存注射進(jìn)行。

本發(fā)明的微?？杀慌渲瞥煽梢猿使腆w或液體組合物的形式的藥物組合物。這種組合物將通常包括某種載體，例如固體載體或液體載體，諸如水、石油、動物或植物油、礦物油或合成油。也可包括生理鹽水溶液或二醇類，諸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。這種組合物和制劑通常含有至少0.1wt％的化合物。

對于靜脈內(nèi)、皮膚或皮下注射，或在病灶部位的注射，活性成分將呈腸胃外可接受的無熱源且具有合適ph、等滲性和穩(wěn)定性的水溶液或液體的形式。本領(lǐng)域的相關(guān)技術(shù)人員完全能夠使用例如化合物或其衍生物例如在生理鹽水中的溶液，用甘油、液體聚乙二醇或油制備的分散體來制備合適的溶液。

除了任選地與其它活性成分組合的一種或多種化合物外，組合物可包含一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑、等滲劑(isotonicisingagent)、防腐劑或抗氧化劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它材料。這類材料應(yīng)為無毒的并且不應(yīng)影響活性成分的功效。載體或其它材料的確切性質(zhì)可取決于施用途徑，例如肌內(nèi)注射。

優(yōu)選地，藥物組合物以預(yù)防有效量或治療有效量(根據(jù)具體情況，預(yù)防也可被認(rèn)為是治療)給予個(gè)體，該量足以顯示出對個(gè)體的益處。通常，這將產(chǎn)生治療上有用的活性，從而向個(gè)體提供益處。施用的化合物的實(shí)際量以及施用的速率和時(shí)間進(jìn)程將取決于所治療的病狀的性質(zhì)和嚴(yán)重程度。治療處方(例如劑量決定等)在全科醫(yī)生和其它醫(yī)生的責(zé)任范圍內(nèi)并通?？紤]到待治療的病癥、個(gè)體患者的病狀、遞送部位、施用方法和執(zhí)業(yè)醫(yī)師已知的其它因素。上文提到的技術(shù)和方案的實(shí)施例可見于handbookofpharmaceuticaladditives,第2版(m.ash和i.ash編)，2001(synapseinformationresources,inc.,endicott,newyork,usa)；remington’spharmaceuticalsciences,第20版,2000年出版.lippincott,williams&wilkins；和handbookofpharmaceuticalexcipients,第2版,1994。舉例來說，組合物優(yōu)選地以每kg體重約0.01至100mg之間的活性化合物的劑量，并且更優(yōu)選地以每kg體重約0.5至10mg之間的劑量施用給患者。

下文通過實(shí)施例的方式來展示，并且不應(yīng)被解釋為是對權(quán)利要求范圍的限制。

實(shí)施例

實(shí)施例1–納米粒子的合成

基本上如以前所述(wo2011/154711；和lund等,2011,biomaterialsvol.32pp.9776-9784，其全部內(nèi)容通過引用明確地并入本文)合成具有碳水化合物配體或谷胱甘肽配體的冠的金納米粒子。

al/α-galnp

2-硫代-乙基-α-d-半乳糖苷(α-半乳糖c2sh)的制備

向半乳糖(3g，16.65mmol)在2-溴乙醇(30ml)中的懸浮液中加入酸性樹脂安伯來特(amberlite)120-h達(dá)到ph2。在50-60℃攪拌反應(yīng)16小時(shí)。過濾反應(yīng)混合物并用meoh洗滌。添加三乙胺達(dá)到ph8。濃縮反應(yīng)的粗品，并用甲苯共蒸發(fā)3次。反應(yīng)混合物溶解在吡啶(75ml)和ac2o(35ml)中，并在0℃添加催化量的dmap并在室溫下攪拌3h?；旌衔镉胊coet稀釋并用1.h2o；2.hcl(10％)3.nahco3dis4.h2o稀釋。收集有機(jī)層并在無水na2so4上干燥。tlc(己烷:acoet3:1，2次洗脫)顯示主要產(chǎn)物(所需)和較低rf少數(shù)。產(chǎn)物利用己烷:乙酸乙酯為6:1的混合物作為洗脫液通過快速色譜純化，并得到2-溴乙基-α-半乳糖苷(2)。

將之前反應(yīng)的產(chǎn)物2溶解在27ml的2-丁酮中。向該溶液添加催化量的四丁基碘化銨和4當(dāng)量的硫代乙酸鉀。在室溫條件下攪拌產(chǎn)生的懸浮液2h。在整個(gè)該過程中，反應(yīng)通過tlc(己烷-acoet2:1，2次洗脫)檢測起始材料的消失?；旌衔镉?0ml的acoet稀釋并用飽和的nacl溶液洗滌。有機(jī)相被干燥、過濾和在真空下蒸發(fā)。產(chǎn)物在2:1→1:1的己烷/acoet中純化，以獲得乙?；虼?α-半乳糖苷3。

將反應(yīng)的新產(chǎn)物3溶解在2:1的二氯甲烷-甲醇混合物中。向該混合物添加1n甲醇鈉(1當(dāng)量)溶液并在室溫下攪拌1小時(shí)。添加安伯來特ir-120h樹脂以達(dá)到ph5-6。然后過濾并濃縮產(chǎn)生的混合物至干以獲得最終產(chǎn)物(α-半乳糖c2sh)。

氨基-硫醇連接體的制備。

向pph3(3g，11.4mmol)在20ml無水thf中的溶液中添加diac(2.3g，11.4mmol)。允許在0℃攪拌混合物15min直到出現(xiàn)白色產(chǎn)物。向該混合物逐滴添加(添加漏斗)六甘醇(1.45ml，5.7mmol)和hsac(610μl，8.55mmol)在無水thf(20ml)中的溶液。15min后產(chǎn)物開始出現(xiàn)，在tlc上rf0.2。在蒸發(fā)器中濃縮溶液。反應(yīng)的粗品溶解在50ml的二氯甲烷中，并用10％的k2co3溶液洗滌。有機(jī)相在無水na2so4之上干燥、過濾和真空濃縮。使用1:1的acoet:己烷、acoet和最后以4:1的dcm:meoh作為洗脫液(eluyent)對粗品進(jìn)行快速色譜，得到乙?；?硫代-六甘醇衍生物。

將反應(yīng)產(chǎn)物溶解在5ml的dmf和pph3(2.25g，8.55mmol)中，添加nan3(0.741g，11.4mmol)和brcl3c(0.845ml，8.55mmol)，并隨后在室溫下攪拌溶液40min。當(dāng)進(jìn)行tlc(dcm:meoh25:1)時(shí)，產(chǎn)生的產(chǎn)物較起始產(chǎn)物具有較高的rf。反應(yīng)混合物用100ml的二乙醚稀釋并用h2o洗滌三次。有機(jī)相在無水na2so4之上干燥、過濾和真空蒸發(fā)。使用洗脫液dmc/meoh200:1和dcm/meoh40:1的混合物通過快速色譜純化產(chǎn)物以獲得疊氮基-乙酰基硫代-六甘醇衍生物。

為了除去三苯基氧化膦，將反應(yīng)產(chǎn)物溶解在10ml的thf中，并向該溶液添加0.5g的mgcl2。在80℃攪拌反應(yīng)2h，直到出現(xiàn)白色沉淀，然后通過硅藻土過濾。將產(chǎn)物溶解在3:1的乙醇:水的混合物中，并添加zn粉(0.45g，6.84mmol)和nh4cl(0.6g，11.4mmol)。反應(yīng)在回流下攪拌1h直到存在的起始材料不再可通過tlc(dcm/meoh25:1)檢測到。通過硅藻土過濾反應(yīng)并蒸發(fā)溶劑。反應(yīng)的粗品用acoet稀釋并用5ml水萃取。將水相蒸發(fā)至干以獲得氨基-硫醇-六甘醇(hexaethylenglycol)產(chǎn)物。

α-半乳糖c2衍生物3和六甘醇胺連接體6取自midatechbiogune原料。n-(3-二甲基氨基丙基)-n’-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)、haucl4、nabh4從sigma-aldrich化學(xué)公司購買。咪唑-4-乙酸單鹽酸鹽從alfaaesar購買。所有實(shí)驗(yàn)和溶液都使用公司高質(zhì)量的meoh和nanopure水(18.1mω)。

α-galc2(α)

2′-硫代乙基-α-d-吡喃半乳糖苷(α)

eg6nh2

1-氨基-17-巰基-3,6,9,12,15,-五氧雜-十七烷醇或

1-氨基-6-巰基-六甘醇(俗名)

al/α-galnp的制備：向1:1比例的胺-巰基六甘醇連接體6和α-半乳糖配體3在meoh(49ml)中的混合物(0.58mmol，3當(dāng)量)添加金鹽的水溶液(7.86ml，0.19mmol，0.025m)。攪拌反應(yīng)30秒，且然后以若干份添加nabh4(1n)的水溶液(4.32ml,4.32mmol)。在900rpm下震蕩反應(yīng)100分鐘。此后，在14000rpm下離心懸浮液1分鐘。移除上清液，并將沉淀溶解在2ml的水中。然后，將2ml的懸浮液引入兩個(gè)過濾器(amicon，10kda，4ml)中，并在4500g下離心5分鐘。過濾器中的殘?jiān)盟傧礈靸纱?。將最終的殘?jiān)芙庠?0ml的水中。

對于金np的制備，在層流櫥內(nèi)制造。所有的玻璃和塑料材料(諸如eppendorfs、小瓶和瓶子)和溶劑(水、hac)首先在高壓釜內(nèi)滅菌。所有的其他一次性用品(諸如刀片和過濾器)都提前經(jīng)過滅菌。

gshnp

在9:1甲醇:水中溶解氧化的配體，谷胱甘肽(fluka49741)并添加氯化金iii(sigma-aldrich,poole,uk)。使用相對于金四倍摩爾過量的有機(jī)配體。然后在平板振動器上將溶液溫和混合5分鐘。在劇烈渦旋下在快速添加相對于金20倍摩爾過量的新制的1m硼氫化鈉(sigma-aldrich,poole,uk)后通過還原制得納米粒子。將樣品渦旋總共30秒，然后在平板振動器上再溫和混合1小時(shí)。由于納米粒子在甲醇/水溶劑中不溶，因此通過臺式離心、移除上清液并將納米粒子小球分散在水中而進(jìn)行初步純化。通過在10kdavivaspin離心設(shè)備(gehealthcare)中進(jìn)行4次水洗而實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的純化。通過簡單的比色測定確定所有納米粒子制劑的金濃度。簡而言之，將10μl納米粒子樣品或12mg/ml金標(biāo)準(zhǔn)品(fluka(sigma-aldrich,poole,uk))和空白在elisa板中用30μl的50:50的水:王水消化1分鐘，這之后添加150μl的2mnabr，然后立即測量405nm吸光度，該測定在0-10μg范圍內(nèi)具有優(yōu)異的線性。

膠體金納米粒子

膠體金納米粒子使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在內(nèi)部制備。

實(shí)施例2-納米粒子在聚合物微粒中的包封

使用以下三種gnp溶液進(jìn)行金納米粒子(gnp)在plga微粒(固體珠粒)中的包封：

·溶解在90:10dmso/水的混合物中的np-peg胺/αgal(即具有大約50:50比例的peg胺配體(1-氨基-17-巰基-3,6,9,12,15,-五氧雜-十七烷醇)與c2-α-半乳糖配體(2-硫代-乙基-α-d-半乳糖苷)的冠的gnp)(1mg/ml)[“np1”]。

·溶解在90:10dmso/水的混合物中的np-谷胱甘肽(即具有谷胱甘肽配體的冠的gnp)(1mg/ml)[“np2”]。

·在90:10dmso/水的混合物中的膠體金(0.18mg/ml)[“np3”]。

由于plga在水中是不溶的，因此難以產(chǎn)生穩(wěn)定的plga、dmso和水的溶液。作為最大限度，可產(chǎn)生含有高達(dá)～10％水的混合物。

本發(fā)明人因此努力獲得在dmso-水混合相中制備的金納米粒子(gnp)。本文考慮使用高度濃縮的gnp的溶液。

為制備plga和gnp的溶液，首先制備plga在dmso中的高度濃縮的溶液(60-80％w/v)。這是線性plga(l/g75:25)，具有羧酸末端，分子量～10kda。然后用上述gnp溶液之一將該溶液稀釋33％-50％，得到40％w/v的最終的聚合物濃度。

產(chǎn)生抗溶劑(85:15水/叔-丁醇)的溶液并冷卻至～4℃。然后將該溶液放置在壓電式液滴發(fā)生器設(shè)備(參見wo2012/042273)中，并產(chǎn)生穩(wěn)定的液滴流。液滴被允許下落到上述抗溶劑溶液中并在5-8℃之間的溫度下與之反應(yīng)。發(fā)生快速的萃取反應(yīng)，產(chǎn)生直徑～53μm的固體微粒。

固體微球使用beadharvester設(shè)備真空干燥(參見wo2013/014466)并儲存在4℃。

包封納米粒子的微粒的表征

為了量化包封率，使用np3(其在～520nm具有可見的吸收)進(jìn)行分光光度法測定。在乙腈中制備連續(xù)稀釋液。然后將準(zhǔn)確質(zhì)量的含gnp的微球溶解在乙腈中，并量化了溶液的吸收。使用這種方法，我們確定np3成功包封，具有～96％的包封率。

使用紫外-可見分光光度計(jì)，我們也確定了在該過程期間np1和np2的包封的樣品沒有團(tuán)聚，即微球在乙腈中溶解后沒有檢測到紫外-可見吸收帶。本發(fā)明人考慮使用電感耦合等離子體質(zhì)譜分析(icpms)技術(shù)進(jìn)行裝載&釋放研究的量化。

用200μl50％的王水處理一定量(3.5mg)的包封np2(即谷胱甘肽納米粒子)的plga微粒，并且微粒在視覺上溶解至>50％(仍可看到一些粒子)。將該材料離心，并使用內(nèi)部比色法測定上清液中的金含量。

30μl上清液得到0.21μg的au，其相當(dāng)于1.4μgau/3.5mgplga-np微粒。如果包封率為100％，則基于np2的1.94μg金的理論最大值，這些結(jié)果表示72％的回收率。本發(fā)明人得出結(jié)論，證明了高水平的納米粒子摻入plga微球。

實(shí)施例3-金納米粒子在plga微球中的包封

納米粒子已經(jīng)被包封并且被表征的進(jìn)一步的實(shí)施例基本上如實(shí)施例2中所描述。

實(shí)驗(yàn)1

使用壓電式液滴生成器設(shè)備，在dmso中的40％w/vrg752h(rg752h，聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)酸末端，丙交酯:乙交酯75:25，mw4,000-15,000)與0.25mg/mlc2-葡萄糖gnp(9:1的dmso:水)一起成功產(chǎn)生微球。抗溶劑為在室溫下的15％v/v叔丁醇。在圖4中可看到顯示微粒的電子顯微照片。

微粒的平均直徑為53.49μm；標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.34μm；cv為8.12％。

實(shí)驗(yàn)2

使用壓電式液滴生成器設(shè)備，在dmso中的40％w/vrg752h與0.5mg/mlc2-葡萄糖gnp(9:1dmso:水)一起成功產(chǎn)生微球。抗溶劑——室溫下15％v/v叔丁醇。

平均直徑-46.67μm，標(biāo)準(zhǔn)偏差–2.11μm，cv–4.53％。

實(shí)驗(yàn)3

使用壓電式液滴生成器設(shè)備，在dmso中的40％w/vrg752h與0.18mg/ml膠體金(9:1dmso:水)一起成功產(chǎn)生微球?？谷軇覝叵碌?5％v/v叔丁醇。

平均直徑-44.82μm，標(biāo)準(zhǔn)偏差–3.35μm，cv–7.47％。

由于膠體金可通過紫外分光光度計(jì)在520nm處檢測到，因此分析了微球內(nèi)的濃度。它產(chǎn)生0.174mg/ml的負(fù)荷，其包封率為96.4％。

實(shí)驗(yàn)4

fitc-綴合的gnp的包封

將fitc-peg-sh-1kdagnpc(au)0.587g/l離心，并重懸浮于250μldmso中。轉(zhuǎn)移至33％w/v的在dmso中的rg752h制劑中。使用15％v/v叔丁醇作為抗溶劑，用壓電式液滴發(fā)生器成功制造。

平均直徑-59.4μm標(biāo)準(zhǔn)偏差–3μmcv–5.1％。

在1mg的gnp微球中檢測到有2.18μg/ml的fitc-peg-sh-1kda。

偶聯(lián)到可檢測標(biāo)記物的納米粒子的成功包封說明提供了根據(jù)本發(fā)明的包封的有效載荷偶聯(lián)的納米粒子。

實(shí)驗(yàn)5

谷胱甘肽綴合的gnp的包封

將谷胱甘肽-綴合的gnpc(au)6.52mg/ml在超過濾器(amicon)中離心30分鐘，以移除大多數(shù)的水，然后將gnp重懸浮于200μl的dmso中。然后將200μl添加至在dmso中的30％w/vrg752h制劑。其然后使用壓電式液滴生成器用于制造微球。使用15％v/v叔丁醇作為抗溶劑。

平均直徑-49.36μm標(biāo)準(zhǔn)偏差–4.48μmcv–9.07％。

將納米粒子溶解于王水中，并使用比色測定法測量金濃度。該測定使用金aas標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于產(chǎn)生在382nm讀出的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在600μg/ml的hlq和10μg/ml的llq之間顯示線性趨勢(參見圖5)。

微球產(chǎn)生0.8279mg/ml的金濃度。制劑理論最大值-1.304mg/ml的金濃度，其給出63.49％的包封率。

本文引用的所有文獻(xiàn)通過引用以其整體并入本文，并且對于所有目的，達(dá)到如同每個(gè)單個(gè)出版物或?qū)＠驅(qū)＠暾埍痪唧w地和單獨(dú)地指出通過引用以其整體并入的相同程度。

本文的具體的實(shí)施方案通過實(shí)施例的方式，而不是通過限制的方式提供。本文包括的任何副標(biāo)題僅僅為了方便起見，并且不被解釋為以任何方式限制公開。