參見相關(guān)的專利申請

本申請涉及并要求2014年11月26日提交的題為“微創(chuàng)精準(zhǔn)個體化腫瘤內(nèi)化學(xué)誘導(dǎo)免疫治療方法半抗原增強的化學(xué)免疫治療”的美國臨時申請no.62/085235的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容在此全文引用參考。

技術(shù)背景

本發(fā)明涉及用于治療哺乳動物，尤其是人類腫瘤的方法。更具體地提供了通過腫瘤內(nèi)聯(lián)合半抗原增強的化學(xué)免疫療法給藥治療腫瘤的方法。

相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域說明

胰腺癌只有6％的5年生存率，中位生存期為6-9個月，仍然是惡性和侵襲性最強的癌癥之一。它是美國第十大最常診斷和第四大導(dǎo)致死亡的癌癥。在2013年，約有45,220人被診斷患有這種惡性腫瘤，在此期間其中全球死亡人數(shù)為38,460人(癌癥事實與數(shù)據(jù)2013，美國癌癥協(xié)會)。由于預(yù)防缺乏進展，這種疾病的早期檢測和診斷使得許多患者在診斷時就已經(jīng)處于晚期階段，只有約15-20％的胰腺癌患者具有切緣可切除腫瘤。因為大多數(shù)患者是不可手術(shù)切除的，剩下唯一的治療方案通常是常規(guī)的化學(xué)療法，放射療法和靶向治療的單獨治療或聯(lián)合治療。吉西他濱是目前用于晚期胰腺癌患者的標(biāo)準(zhǔn)化療方案。它已經(jīng)在ii期的臨床試驗中顯示有療效(casper等人，investnewdrugs(1994)12：29-34)，然而，探索基于聯(lián)合吉西他濱的iii期臨床試驗中，總體生存期(os)未得到改善(moore等人，jclinoncol(2007)25：1960-66)。因此，晚期胰腺癌對最佳治療方案的需求仍然很高。

肺癌仍然是癌癥相關(guān)死亡的主要原因，在美國，2013年肺癌患者總數(shù)占所有癌癥患者總數(shù)的約14％(228,190例)和肺癌患者死亡數(shù)約占癌癥患者死亡數(shù)的27％(159,480例死亡)(jemal等人，ca：cancerjclin.(2011)61：60-90；cancerfacts&figure2013。美國癌癥協(xié)會)。常規(guī)臨床治療包括手術(shù)，放射治療和化療。但合并所有階段的5年生存率僅僅只有16％(jemal等人，ca：cancerjclin.(2011)61：60-90)。目前，化療作為一線治療方法，臨床批準(zhǔn)用于肺癌靶向治療有持續(xù)的進展的幾種藥物例如貝伐珠單抗(avaslin)(mizuki等人，cancerimaging(2012)12：225-36)和埃羅替尼(tarceva)，以及第二代藥物阿法替尼(bibw2992)(kim等人，cancerdiscov(2011)1：43-51；valerie等人，oncotargetsandtherapy(2013)6：135-43)和克里唑蒂尼(xalkori)(ou等人，oncologist(2012)17：1351-75)。但是，由于肺癌的分子和組織學(xué)特征的差異，它們顯示有毒性并具有局限性(larsen等人，cancerj.(2011)17：512-27)。

肝細胞癌(hcc)是一種侵襲性癌癥，其全球發(fā)病率第五高，死亡率第三高(jemal等人，ca：cancerjclin.(2011)61：60-90；ferlay等人，lyon；國際癌癥研究機構(gòu)(2010年))。2013年美國將會發(fā)生30,640例新病例和21,670例癌癥死亡(“2013癌癥事實與數(shù)據(jù)”，美國癌癥協(xié)會)。在這些患者中，用化療，免疫治療或激素治療的全身治療導(dǎo)致低的應(yīng)答率和最小限度的生存獲益(rossi等人，worldjgastrointestoncol(2010)2：348-359)。目前用于晚期肝細胞癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，包括經(jīng)肝動脈栓塞化療(tace)(liovet等人，hepatology(2003)37：429-42)，過繼免疫治療(takayama等人，lancet(2000)356(9232)；802-807)，干擾素治療(lo等人，annsurg(2007)245：831-42)，經(jīng)皮乙醇注射和分子靶向藥物索拉非尼(rampone等人，worldjgastroenterol(2009)15(26)：3210-3216)顯示對生存率的作用是有限的(lopez等人，alimentpharma-colther(2006)23(11)：1535-1547)。目前的治療方法也不能有效預(yù)防腫瘤多次復(fù)發(fā)，這有助于疾病的預(yù)后不良。

內(nèi)容

本發(fā)明的實施例為治療哺乳動物腫瘤提供方法，包括瘤內(nèi)給藥一有效量的包含半抗原和氧化還原劑的藥物組合，從而達到治療腫瘤的目的。

在一些實施例中，該半抗原是從包括2，4-二硝基酚(dnp)、芐青霉素、鹽酸普魯卡因胺、鹽酸肼屈嗪、奎尼丁、鹽酸左旋咪唑、異丙肌苷、氫氧化鋁、苦味酸(tnp)、n-碘代乙?；?n’-(5-磺酸1-萘)乙烯胺(aed)和二硝基氟苯(dnfb)的半抗原庫中選擇。在一些實施例中，氧化還原劑是從包括過氧化氫(h2o2)、氯化亞錫(sncl2)、硫酸亞錫(snso3)、氧化錫(sno)、二氧化錫(sno2)、錫酸鈉(na2sno3)、亞錫酸鈉(na2sno2)、氯化亞錫(sncl2)、氯化錫(sncl4)、全硫錫酸鹽(sns3)和硫化錫(sns)、過氧化脲的氧化還原劑庫中選擇。在一些實施例中，所述方法包括多次治療方法。在一些實施例中，使用復(fù)合半抗原。在一些實施例中，每次治療包括腫瘤內(nèi)給予一有效量的包含氧化還原劑和不同半抗原的藥物組合。在一些實施例中，多次治療的時間間隔為每周一次。在一些實施例中，多次治療的時間間隔為每兩周一次。在一些實施例中，多次治療的時間間隔為每月一次。在一些實施例中，至少進行2、3、4、6或8次治療。在一些實施例中，半抗原和氧化還原劑被配制成單一的組分。在一些實施例中，所述方法進一步包括腫瘤內(nèi)給予至少兩種化療藥物。在一些實施例中，所述方法包括藥物組合物在腫瘤中的強行分布。在一些實施例中，藥物組合物在約4amp約至6amp的壓力下腫瘤內(nèi)給藥。在一些實施例中，藥物組合物在約5amp至約6amp的壓力下腫瘤內(nèi)給藥。在一些實施例中，藥物的組分分布遍及在整個腫瘤基質(zhì)中。在一些實施例中，多次治療患者的生存率比單次治療患者的生存率有改進。在一些實施例中，多次治療患者的平均生存率比單次治療患者的平均生存率有改進。在一些實施例中，選擇用于治療腫瘤為腎上腺、肛門、膽管、膀胱、骨骼、乳腺、宮頸、結(jié)腸、頰、耳、子宮內(nèi)膜、食道、眼瞼、輸卵管、胃腸道、頭頸、心、腎、喉、肝、肺、下頜骨、上頜骨、下頜骨髁狀突、口、鼻咽、鼻子、口腔、卵巢、胰腺、腮腺、陰莖、耳廓、垂體、前列腺、直腸、視網(wǎng)膜、唾液腺、皮膚、小腸、胃、睪丸、甲狀腺、扁桃體尿道、子宮、陰道、外陰的癌癥。在一些實施例中，治療的腫瘤是實體腫瘤。在一些實施例中，實體瘤的大小大于10⁸個細胞。在一些實施例中，腫瘤的大小約5×10⁹至約10¹¹個細胞。在一些實施例中，腫瘤被誘導(dǎo)為壞死和/或誘導(dǎo)為纖維化。在一些實施例中，腫瘤被誘導(dǎo)為纖維化。在一些實施例中，所述的方法包括腫瘤內(nèi)給予免疫反應(yīng)增強劑，在一些實施例中，免疫反應(yīng)增強劑從包括卡介苗(bcg)、厭氧短棒桿菌、流產(chǎn)布魯氏菌提取物、葡聚糖、左旋咪唑、替洛隆中選擇；酶從包括霍亂弧菌神經(jīng)醇胺酶(vcn)、木瓜蛋白酶、β-半乳糖苷酶和刀豆球蛋白a、無致病力的紐卡斯?fàn)柌《局羞x擇；和多糖從包括西佐糖(spg)、裂褶菌多糖、甘露聚糖、香菇多糖、蘇多糖(su-ps)和mannozym中選擇。在一些實施例中，產(chǎn)生一針對腫瘤的免疫應(yīng)答。在一些實施例中，免疫應(yīng)答包含體液和/或細胞免疫應(yīng)答。

附圖簡要說明

圖1顯示的是umipic療法程序的一個示例性實施例說明：⑴在ct的引導(dǎo)下，針頭插入腫瘤并和充氣筒連接，并用最優(yōu)路線和角度進行瘤內(nèi)注射；(2)治療藥物被緩慢輸入進腫瘤；(3)充氣筒提供高壓使得溶液可滲透到腫瘤細胞外基質(zhì)，促進藥物在腫瘤強制擴散。

圖2顯示了胰腺癌患者umipic治療后的ct結(jié)果。a:在umipic治療期間和隨訪(6個月和2年)期間的ct成像圖。a-1：手術(shù)期間，ct成像顯示針頭在腫瘤里。a-2：治療后六個月，ct成像顯示在腫瘤區(qū)ct密度值有變化，并且顯示部分緩解。a-3：治療后兩年，ct成像顯示完全緩解。這是一例58歲的病人，姓fan，女士，2006年12月診斷患有胰腺癌，并且腹腔造口術(shù)檢查有胰腺腫瘤，不可切除性為零，因為腫瘤侵襲了周圍組織。開展的活檢和病理學(xué)檢查證實為胰腺癌。在同一個月，病人來我們醫(yī)院并用umipic療法瘤內(nèi)注射5個周期。經(jīng)2009和2014復(fù)查后，患者已被證明腫瘤體完全消退，身體處在穩(wěn)定狀態(tài)。目前仍然存活(超過8年的生存時間)。b：在umipic治療期間ct成像顯示針頭尖端定位和藥物分布。b-1；ct成像定位注射腫瘤中針尖端位置。b-2：ct成像顯示在umipic治療后藥物在胰腺癌組織內(nèi)的分布情況。該ct成像顯示ct通過顯示針尖引導(dǎo)治療，并且通過測量在一個點或區(qū)域腫瘤的ct值的變化顯示藥物在腫瘤中的分布，結(jié)果表明，組合溶液可以到達腫瘤的邊緣。c；umipic治療一個周期后，出現(xiàn)pr和重復(fù)的三多次的治療來維持病人的腫瘤處于pr。c-1：第一次umipic治療，ct(c-1-1)成像顯示了在治療過程腫瘤中針的尖端；治療后，ct(c-l-2)成像顯示腫瘤中密度值的變化，并提示腫瘤中的藥物分布。c-2：第一周期umipic治療三個月后，給予了更多次的治療。ct(c-2-l)顯示了腫瘤中的針尖和ct(c-2-2)顯示在注射后腫瘤中ct值密度的變化，提示腫瘤保持在部分緩解狀態(tài)。c-3：首次治療的九個月后，腫瘤仍處在部分緩解，又給予了一次治療，ct(c-3-1和c-3-2)顯示在治療期間針尖在腫瘤里，ct(c-3-3)顯示注射后腫瘤中ct值密度的變化，并提示腫瘤保持在部分緩解狀態(tài)。c-4：第一次治療十三個月后，腫瘤仍為部分緩解，又給予了一次治療，ct(c-4-1)顯示在治療期間針尖在腫瘤里，ct(c-4-2)顯示注射后腫瘤中ct值密度的變化，腫瘤保持在部分緩解，并且由于腫瘤強纖維化，使得腫瘤變得堅硬如石，該患者無需再次更多的治療，現(xiàn)在該患者身體狀態(tài)良好，她的腫瘤保持部分緩解。有一個47歲的患者，男性，2012年7月通過pet/ct診斷為胰癌，細胞活檢證實為胰腺癌，ca199：67.62ku/l，他從2012年7月20日至2012年10月9日接受第一周期的umipic治療，回到醫(yī)院，并接受九次umipic治療，隨訪他兩年，他的腫瘤部分緩解，生活正常。

圖3顯示了umipic治療和itct治療的生存率比較。

圖4顯示了umipic治療和itct治療之間的的腫瘤纖維化發(fā)生的比較。a：在itct對照組，治療后7天，切除腫瘤以獲得特定的病理切片用于專門的染色包括彈力纖維染色(a1)，網(wǎng)狀纖維染色(a2)和膠原染色(a3)，單細胞毒藥物阿糖胞苷誘導(dǎo)這三種纖維化在腫瘤中發(fā)生更少；b：在umipic治療的試驗組，經(jīng)過7天的治療，切除腫瘤以獲得特定的病理切片用于專門的染色包括彈力纖維染色(b1)，網(wǎng)狀纖維染色(b2)和膠原染色(b3)，有半抗原的細胞毒藥物阿糖胞苷誘導(dǎo)這三種纖維化在腫瘤中發(fā)生更高，半抗原可限制腫瘤生長或破壞腫瘤細胞生長的環(huán)境。a1和b1代表在腫瘤組織中的彈性纖維染色(x200)；a2和b2代表腫瘤組織中的網(wǎng)狀纖維染色(x200)；a3和b3代表腫瘤組織中的的膠原纖維染色(x200)。

圖5顯示的是umipic治療的生存曲線。圖5-1生存曲線(kaplan-meier)，umipic與itct治療組之間的總生存曲線和總生存期(os)比較(p＝0.0028)。圖5-2：umipic與itct治療組治療兩周期患者的生存曲線(kaplan-meier)。圖5-3umipic與itct治療組無佐劑治療的患者生存曲線(kaplanmeier)。

圖6顯示umipic療法在肺癌患者治療中的臨床應(yīng)答。圖6.1：umipic治療對肺癌的應(yīng)答。患者為一位49歲被診斷為肺癌，位于右葉的腺癌的女性。她總共接受8次umipic注射治療。(a)治療前一個直徑64厘米的腫瘤和(b)治療后最主要的腫瘤體基本退化到完全緩解(cr)。圖6.2：umipic治療對肺癌治療的臨床應(yīng)答。患者為一位79歲的男性，診斷時為不能切除的晚期鱗狀肺癌。他一共接受了四次有放射治療輔助的umipic治療。(a)治療前腫瘤大小為6.7×8.1厘米，(b)：治療后腫瘤退化為部分緩解(pr)。圖6.3：umipic治療中央型肺癌的臨床應(yīng)答?；颊呤且晃?9歲女性，她被診斷為患有中央型肺癌，腺癌，不可切除。她總共接受了3次umipic注射治療，(a)治療前腫瘤直徑為64厘米和(b)治療后腫瘤基本退化到完全緩解(cr)，在中央肺癌的主要部位有纖維腔。

圖7顯示特異染色(em)下觀察纖維化的發(fā)生。a：在itct對照組，經(jīng)過7天的治療，切除腫瘤以獲得用于特定染色的病理切片包括彈力纖維染色(a1)，網(wǎng)狀纖維染色(a2)和膠原染色(a3)；單細胞毒藥物阿糖胞苷誘導(dǎo)這三種纖維化在腫瘤中發(fā)生更少b：在umipic試驗組，7天治療后，切除腫瘤以獲得特定染色的病理切片包括彈力纖維染色(b1)，網(wǎng)狀纖維染色(b2)和膠原染色(b3)；有半抗原的細胞毒藥物阿糖胞苷誘導(dǎo)這三種纖維化在腫瘤中發(fā)生更高，半抗原可限制腫瘤生長或破壞腫瘤細胞生長的環(huán)境。a1和b1代表在腫瘤組織中的彈性纖維染色(x200)；a2和b2代表腫瘤組織中的網(wǎng)狀纖維染色(x200)；a3和b3代表腫瘤組織中的的膠原纖維染色(x200)。

圖8顯示有和無瘤內(nèi)注射氧化劑的阿糖胞苷保留率的比較。在有細胞毒性氧化劑阿糖胞苷(a組)和阿糖胞苷單用(b組)注射后十五分鐘，a、b兩組的阿糖胞苷保留率為100％。注射后4小時，細胞毒性氧化劑與阿糖胞苷組(a)和阿糖胞苷單用組(b)的阿糖胞苷保留率分別為80％(a)和16％(b)，注射后24小時，細胞毒性氧化劑與阿糖胞苷組(a)和阿糖胞苷單用組(b)的阿糖胞苷保留率分別為60％(a)和0％(b)。這是一項用核相機在有兩塊腫瘤塊的肝癌患者上的臨床藥理研究；測得99tcm標(biāo)記的阿糖胞苷的標(biāo)記成功率為99.9％；劑量為0.5mci的99tcm-ara-c溶解于細胞毒性氧化劑中(a)和同樣劑量的99tcm-ara-c溶解于生理鹽水中(b)注射到同一肝臟的兩個腫瘤里，用spectgestarcom400于不同時間點觀察99tcm的同位素活性。

圖9a顯示生存概率(kaplan-meier)?？鼓[瘤化學(xué)免疫治療(tcit)與瘤內(nèi)化療(itct)組患者的總體生存(os)曲線。p＝0.000。

圖9b顯示生存概率(kaplan-meier)，多次治療和單次治療的患者總體生存(os)曲線(p＝0.000)。

圖10-1顯示tcit治療肝細胞癌(hcc)患者的遠端效應(yīng)。在有雙側(cè)肺轉(zhuǎn)移瘤的肝細胞癌患者接受11次tcit治療后出現(xiàn)免疫治療的“遠端效應(yīng)”。(a1)：治療前直徑13.5厘米的原發(fā)性肝癌腫瘤。(a2)：治療后原發(fā)性肝癌腫瘤的直徑5.2厘米。(b1)：治療前的雙側(cè)肺轉(zhuǎn)移瘤。(b2)：11次tcit治療后雙邊肺轉(zhuǎn)移瘤縮小。

圖10-2顯示tcit治療在一名肝細胞肝癌患者的局部效應(yīng)。

圖11a和圖11b顯示治療前和治療后pet/ct的結(jié)果比較。三次tcit治療后，患者的pet/ct顯示肝細胞癌已經(jīng)壞死，與tcit治療前pec/ct比較f18具有更多的活性周期。這意味tcit誘導(dǎo)了腫瘤死亡和炎癥。

優(yōu)選實施例的詳細描述

umipic是腫瘤內(nèi)給藥到實體瘤的治療方案的組合療法。它包含一種氧化劑、細胞毒性藥物和半抗原，并且在診所對基于腫瘤大小和自體腫瘤相關(guān)抗原作為特異性腫瘤的自身接種的個性化值進行探索。美國專利號6,811,788和8,501,243中描述了用于腫瘤治療的組合方案，其中的內(nèi)容通過全面地參考整合于此，umipic整合了凝固或化療同時經(jīng)皮途徑與免疫治療協(xié)同作用。一般來說，在這個臨床研究中，umipic瘤內(nèi)注射可以克服全身化療的缺點，并且可以延長患者的生存時間，主要依據(jù)以下三個原則。它還能消除一些較早的抗腫瘤方案中使用的腫瘤靶向劑的需要。

雖然不希望受本公開所述的任何理論或機制的約束，但目前的理解是，以下靶向化療可有效治療腫瘤，并且可以使用靶向化合物來遞送半抗原和化學(xué)治療藥物同時進入組織部位同時誘導(dǎo)一些免疫作用，大大增強了化療誘導(dǎo)的免疫治療，并且對腫瘤贅生物、腫瘤和癌癥的治療有更積極的貢獻。首先，由化學(xué)載體介導(dǎo)的治療意味著在目標(biāo)腫瘤中至少在一些情況下能殺死超過50％的腫瘤細胞。一般來說，腫瘤體負荷減少會降低腫瘤的大小，有利于接下來的免疫治療。此外，化療還導(dǎo)致細胞表面，細胞外基質(zhì)和細胞裂解碎片的結(jié)構(gòu)變化以釋放腫瘤細胞內(nèi)容物，即局部炎癥。這種炎癥作用與加入的半抗原相結(jié)合，由于通過局部化學(xué)藥物引起的腫瘤細胞裂解物生成的腫瘤特異性抗原與半抗原結(jié)合，進一步產(chǎn)生更復(fù)雜的免疫原性。該炎癥區(qū)吸引各種淋巴細胞，如腫瘤抗原呈遞細胞(apc)、巨噬細胞、樹突狀細胞(dc)和活化的b細胞到該區(qū)域并與腫瘤抗原相互作用，例如復(fù)合腫瘤抗原、dnas、rnas和其他從細胞裂解物中釋放的內(nèi)容物。這些相互作用誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫反應(yīng)，包括體液、細胞和補體介導(dǎo)的反應(yīng)。這種局部腫瘤特異性免疫應(yīng)答進一步被鄰近的最初沒有被局部化學(xué)物質(zhì)殺死的活腫瘤細胞的存在增強了。隨后的腫瘤特異性反應(yīng)以這種方式增加了化學(xué)治療(原位接種)的作用，并且延伸至可以阻止腫瘤細胞復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移性腫瘤部位。

本發(fā)明的組合和方法還可以通過載體到達組織區(qū)域(包括腫瘤組織區(qū)域)在細胞外基質(zhì)(em)的作用發(fā)揮治療效果。這種組合可以增加細胞外基質(zhì)的差異。在體內(nèi)，腫瘤細胞被細胞外基質(zhì)如膠原、纖連蛋白、蛋白多糖(蛋白質(zhì)/碳水化合物)、透明質(zhì)酸和其他高分子量物質(zhì)所包圍，也可能起抗癌作用。已經(jīng)表明，腫瘤的細胞外基質(zhì)與正常組織的細胞外基質(zhì)有顯著性的差異。

a.定義

除非另有定義，本文使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。本文所提及的來自genbank和其他數(shù)據(jù)庫的所有專利，申請，已公布的申請和其他出版物和序列均全部引入作為參考。如果本節(jié)中提出的定義與本文中引入作為參考的來自genbank和其他數(shù)據(jù)庫的申請，已公布的申請和其他出版物和序列中所闡述的定義相違背或不一致，本節(jié)所定義的定義優(yōu)于引入作為參考的定義。

本發(fā)明所使用的“a”或“an”表示“至少一個”或“一個或多個”。

本發(fā)明所使用的氧化還原反應(yīng)是指電子從供體轉(zhuǎn)移到受體分子的反應(yīng)。

本發(fā)明所使用的氧化劑(或氧化劑)是指在氧化還原反應(yīng)中接受電子方。

本發(fā)明所使用的還原劑(或還原劑)是指在氧化還原反應(yīng)中提供電子方。

本發(fā)明所使用的半抗原是指不能誘導(dǎo)抗體形成的抗體特異性物質(zhì)，除非與載體或分子結(jié)合。一旦半抗原與載體/分子綴合，使用綴合物產(chǎn)生的抗體可以識別半抗原和/或載體/片段。半抗原-載體/分子的綴合物也可以產(chǎn)生特異性細胞免疫應(yīng)答。

本發(fā)明所使用的抗腫瘤治療是指通過減輕或改善其癥狀來設(shè)計治療腫瘤贅生物、腫瘤或癌癥。防止腫瘤贅生物、腫瘤或癌癥的發(fā)生或減輕其嚴(yán)重性的治療也要考慮。

本發(fā)明所使用的腫瘤贅生物(瘤形成)是指異常的新生長，因此意味著與腫瘤相同，其可能是良性或惡性的。與增生不同，即使沒有原始刺激，腫瘤增殖仍然存在。

本發(fā)明所使用的癌癥是指由任何類型的惡性腫瘤引起的疾病的一般術(shù)語。

本發(fā)明所使用的惡性腫瘤，適用于腫瘤，是指具有轉(zhuǎn)移能力的原發(fā)性腫瘤，同時喪失生長控制和位置控制。

本發(fā)明所使用的抗腫瘤劑(與抗腫瘤贅生物劑，抗腫瘤劑或抗癌劑互換使用)是指用于抗腫瘤治療的任何藥劑。這些藥物包括當(dāng)單獨使用或與其它化合物組合使用時可以緩解、減輕、改善、預(yù)防或處于或維持腫瘤贅合物，腫瘤或癌癥相關(guān)的臨床癥狀或診斷標(biāo)志物緩解的狀態(tài)，并且可以用于這里提供的方法、組合和組合物中的任何藥物。抗腫瘤藥物包括但不限于抗血管生成劑、烷基化劑、抗代謝劑、某些天然產(chǎn)物、鉑配位絡(luò)合物、蒽二酮、取代脲、甲基肼衍生物、腎上腺皮質(zhì)抑制劑、某些激素和拮抗劑、抗癌多糖和某些植物藥物提取物如中草藥提取物。

本發(fā)明所使用的抗腫瘤劑(或抗腫瘤或抗癌劑)或抗腫瘤療法不包括含有氧化劑或還原劑、蛋白質(zhì)變性劑和半抗原的組合或用它治療，但包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有藥物和治療方式，以某種方式改善腫瘤贅生物，腫瘤或癌癥的癥狀的藥物。

本發(fā)明所使用的“血管生成”是指從母體微血管產(chǎn)生新的血管。血管生成受血管生成刺激物和抑制劑系統(tǒng)的高度調(diào)節(jié)。病理性血管生成是由血管生成刺激劑和抑制劑之間的凈平衡的變化引起的，例如由于產(chǎn)生正?；虍惓Ｐ问降难苌烧{(diào)節(jié)劑過量生成的原因，或由于該過程抑制劑的相對缺乏。

本發(fā)明所使用的“非期望的和/或不受控制的血管生成”是指病理性血管生成，血管生成促進劑的影響超過血管生成抑制劑的影響。

本發(fā)明所使用的“抗血管生成治療劑或藥物”是指任何治療方案和化合物，當(dāng)單獨使用或與其它療法或化合物聯(lián)合使用時可以減輕、縮小、改善、預(yù)防或處于或維持非期望的和/或不受控制的血管發(fā)生相關(guān)的臨床癥狀或診斷標(biāo)志物的緩解狀態(tài)。如本文所用，“內(nèi)皮素酶的抑制劑”不認為是“抗血管生成療法或藥物”。

本發(fā)明所使用的“反義多核苷酸”是指與mrna或雙鏈dna的有義鏈互補的核苷酸堿基的合成序列。在適當(dāng)條件下，正義和反義多核苷酸的摻合導(dǎo)致兩個分子的結(jié)合或雜交。當(dāng)這些多核苷酸結(jié)合(雜交)mrna時，發(fā)生蛋白質(zhì)合成(翻譯)的抑制。當(dāng)這些多核苷酸結(jié)合雙鏈dna時，發(fā)生rna合成(轉(zhuǎn)錄)的抑制。翻譯和/或轉(zhuǎn)錄的抑制結(jié)果導(dǎo)致了由有義鏈編碼的蛋白質(zhì)合成的抑制。

本發(fā)明所使用的抗體包括抗體片段，例如fab片段，其由輕鏈和重鏈的可變區(qū)組成。

本發(fā)明所使用的人源化抗體是指被修飾的抗體，包括人源的氨基酸序列的抗體，使得施用于人不發(fā)生免疫應(yīng)答。用于制備這種抗體的方法是已知的。例如，表達單克隆抗體的雜種細胞瘤可以通過重組dna技術(shù)改變，以表達基于人抗體的“非”可變區(qū)的氨基酸組成的抗體，已經(jīng)設(shè)計了計算機程序來鑒定這些區(qū)域。

本發(fā)明所使用的促進半抗原和腫瘤抗原之間綴合的促進劑“是指將半抗原連接到腫瘤抗原或促進這種連接的任何試劑。半抗原和腫瘤抗原之間的連接可以是共價的或非共價的，并且可以通過疏水、極性、離子、靜電或其他相互作用介導(dǎo)。

本發(fā)明所使用的“免疫應(yīng)答”是指針對抗原相關(guān)的組織免疫系統(tǒng)中反應(yīng)性的變化，在脊椎動物中，這可能涉及抗體產(chǎn)生、細胞調(diào)節(jié)的免疫的誘導(dǎo)、補體激活或免疫學(xué)耐受發(fā)展。

本發(fā)明所使用的“免疫應(yīng)答增強劑”是指在引發(fā)免疫應(yīng)答中能增強抗原效應(yīng)的物質(zhì)。

本發(fā)明所使用的“凝固”是指使細胞，細胞內(nèi)容物和細胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)化為軟的半固體或固體物質(zhì)的過程。

本發(fā)明所使用的“凝固裂解劑”是指使血凝塊松動或溶解的試劑。

本發(fā)明所使用的“腫瘤凝固”是指引起腫瘤細胞，細胞內(nèi)容物和細胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)檐浀陌牍腆w或固體物質(zhì)的過程，該轉(zhuǎn)化導(dǎo)致凝固的腫瘤細胞死亡，增強凝固的腫瘤細胞對施用于腫瘤的藥物的保留。

本發(fā)明所使用的術(shù)語“治療藥物”、“治療方案”、“輻射防護劑”、“化學(xué)治療”是指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)藥物和藥物療法，包括疫苗?！拜椛浞雷o劑”是本領(lǐng)域眾所周知的。

本發(fā)明所使用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”意思是說包括與施用藥物相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、等滲劑和吸收延遲劑等等。在藥物學(xué)活性物質(zhì)中使用這些介質(zhì)和藥劑在本技術(shù)領(lǐng)域是眾所周知的，例如remington，thescienceandpracticeofpharmacy，20^thed。(lippincott，williams&wilkins2003)。除了因為任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性化合物不相容的程度之外，組分藥物中這種使用需要考慮。

“藥學(xué)上可接受的鹽”意思是說本文所示化合物的游離酸或堿的復(fù)合鹽，其是無毒的，生物學(xué)上可耐受的或以其他方式生物學(xué)上適合于施用于受試者，一般來說，參見berge等人的j.pharm,sci.,1977,66,1-19.首選的藥學(xué)上可接受的鹽是具有藥理學(xué)有效性且適合于與受試者的組織接觸而沒有過大的毒性、刺激或過敏反應(yīng)的那些化合物。本文所描述的化合物可以具有足夠酸性的基團、足夠堿性的基團、兩種類型的官能團或者超過每種類型中的一種以上，以形成一藥學(xué)可接受的鹽。

藥學(xué)上可接受的鹽的實例包括硫酸鹽、焦硫酸鹽、硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、磷酸鹽、磷酸一氫鹽、磷酸二氫鹽、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸鹽、丙酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、丙烯酸鹽、甲酸鹽、異丁酸鹽、己酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、丙二酸鹽、琥珀酸鹽、辛二酸鹽、癸二酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、丁炔-1，4-二酸鹽、己炔-1,6-二酸鹽、苯甲酸鹽、氯苯甲酸鹽、甲基二硝酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、羥基苯甲酸鹽、甲氧基苯甲酸鹽、磺酸鹽、甲基磺酸鹽、丙磺酸鹽、苯甲酸鹽、二甲苯磺酸鹽、萘-1-磺酸鹽、萘-2-磺酸鹽、苯乙酸鹽、苯基丙酸鹽、苯基丁酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、羥基丁酸鹽、乙酸酯鹽、酒石酸鹽和扁桃酸鹽。

本發(fā)明所使用的術(shù)語“治療有效量”或者“有效量”是指一種治療藥物的量，當(dāng)單獨給藥或與其它治療藥物聯(lián)合施用于細胞、組織或受試者時，可有效預(yù)防或改善腫瘤或腫瘤進展或與腫瘤相關(guān)的相關(guān)疾病。治療有效劑量更多是指足以導(dǎo)致癥狀改善的治療藥物的量，例如相關(guān)醫(yī)學(xué)狀態(tài)的治療，治愈、預(yù)防或改善、或這些病狀的治療率、治愈率、預(yù)防率、改善率提高。當(dāng)單獨施用的單一的活性成分時，治療有效劑量是指單獨的成分。當(dāng)使用于組合時，治療有效劑量是指出現(xiàn)治療效果的活性成分的組合量，無論是連續(xù)還是同時組合。特別地，有效劑量是可以殺死癌細胞和/或抑制或減少腫瘤進展藥物量。

術(shù)語“組合”是指要么以一劑量單位形式的固定組合要么聯(lián)合給藥的成套組合，其中一化合物和一聯(lián)合治療(例如，下面解釋的另一種藥物也稱為“治療藥物”或“共同抗癌藥”)可以在相同時間或分開的時間間隔內(nèi)獨立施用，特別是在這些時間使用期間允許聯(lián)合者顯示共同作用，例如協(xié)同效應(yīng)。術(shù)語“共同施用”或“聯(lián)合施用”等在本文中的意思包括所選擇的聯(lián)合治療施于有需要的單個受試者(例如，患者)，并且有意包括治療方案，方案規(guī)定藥物不一定通過相同的給藥途徑或相同的時間施用。本文所用的術(shù)語“藥物組合”是指由多于一種活性成分的混合或聯(lián)合產(chǎn)生的產(chǎn)品，既包括活性成分的固定聯(lián)合又包括活性成分的非固定聯(lián)合。術(shù)語“固定聯(lián)合”是指活性成分，如一個藥物和一聯(lián)合治療均以單一實體或劑量的形式同時施用于患者。術(shù)語“非固定的聯(lián)合”意思是指活性成分，例如化合物和聯(lián)合治療，作為單獨的實體或者同時或沒有特定的時間限制的順序給予患者，其中這種給藥在患者體內(nèi)提供兩種化合物的治療有效水平。后者也適用于雞尾酒療法，例如給予三種或更多種活性成分。

“治療”或“治療”或“緩解”在本文是指如果不能治愈靶向病理狀況或障礙或預(yù)防病癥復(fù)發(fā)的目的是減緩(減輕)的治療性治療。如果在接受治療劑量的治療藥物后，受試者被成功地“治療”，則受試者顯示可觀察到特定疾病的一種或多種體征和癥狀的可測量的減少或缺失。疾病體征或癥狀減少患者也可能感覺到。如果患者經(jīng)歷了穩(wěn)定的疾病，也會考慮患者治愈。在一些實施例中，治療藥物的治療有效地導(dǎo)致患者在治療后3個月不患病，優(yōu)選治療后6個月，更優(yōu)選為一年，甚至更優(yōu)選為兩年或更多年。用于評估成功治療和改善疾病的這些參數(shù)可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的常規(guī)程序容易地測量。

本發(fā)明所使用的通過給予特定藥物成分使得特定病癥癥狀的緩解是指任何減輕，不管是永久性的還是暫時的，持久的或短暫的，都可歸因于或與物成分給藥相關(guān)的。

b.治療方法

本發(fā)明公開的實施例提供了治療哺乳動物腫瘤的方法，包括腫瘤內(nèi)給予腫瘤有效量的由半抗原和氧化還原劑組成的藥物組合物，從而治療腫瘤。

腫瘤相關(guān)抗原，特別是用半抗原修飾的抗原(由腫瘤細胞裂解產(chǎn)生)引起腫瘤特異性免疫應(yīng)答，其可以包括激素、細胞和補體介導(dǎo)的應(yīng)答。在一些實施例中，半抗原可以從包含2,4-二硝基苯酚(dnp)、芐青霉素、鹽酸普拉卡酰胺、鹽酸肼屈嗪、奎尼丁、鹽酸左旋咪唑、異丙肌苷、氫氧化鋁、三硝基苯酚(tnp)、n-碘乙酰-n’-(5-磺酸1-萘)二烯二胺(aed)和二硝基氟苯(dnfb)的半抗原組中選擇。

在一些實施例中，半抗原還可以從包含任何可用于治療癌癥的藥物順鉑、卡鉑、葉醛酸鈣、長春新堿、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺、表柔比星、多柔比星(快速溶解)、絲裂霉素、依托泊苷、博來霉素a5等化學(xué)藥物組中選擇。

在優(yōu)選的實施例中，本文公開的方法包括以特定間隔開展的多次治療，例如每周一次、兩周一次、每月一次等。對于相同的患者，治療間隔可能有差異。例如，治療間隔可以根據(jù)病人的反應(yīng)情況或缺乏調(diào)整至治療前的臨床反應(yīng)。治療次數(shù)考慮為至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少8次或更多次。

對于多次治療，可以使用多個半抗原。在一些實施例中，每次治療使用不同的半抗原。在一些其它實施例中，相同的半抗原可用于多于一種治療。因此，可以在同一患者上使用總共2、3、4、5、6、7、8或更多種半抗原。半抗原的選擇可能取決于對先前治療患者中的反應(yīng)或缺失。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解，半抗原的各種組合可用于治療患者。例如，在一些實施例中，4種不同的半抗原可用于患者的四種治療。在一些實施例中，2,4-二硝基苯酚(dnp)，化學(xué)藥物作為半抗原，芐青霉素、普拉卡酰胺鹽酸鹽、鹽酸肼屈嗪可以用于患者的四次治療?！霸谝恍嵤┓桨钢?，奎尼丁、鹽酸左旋咪唑、異丙肌苷、氫氧化鋁用于患者的四次治療等。

任何可生物耐受的氧化劑可以聯(lián)合使用。在一優(yōu)選的實施例中，所用的氧化劑是過氧化氫(h2o2)、過硫酸鉀(oxone)(wozniak等人，bioorg.med.chem.lett.，8(19)：2641-6(1998))、d，l-s-甲基硫辛酸甲酯(pan和jordan，biochemistry，37(5)：1357-64(1998))、叔丁基過氧化氫(tarin等人，mol.hum.reprod.,2(12)：895-901(1996))、甲萘醌(santini等人，freeradic.biol.med.，20(7)：915-24(1996))、二酰胺(bosin和kasper，j.biochem.toxicol.，7(3)：139-45(1992))、碘(saha等人,int.j.rad.appl.instrum.,16(4)：431-3(1989))、n-溴代琥珀酰亞胺(sinn等人，analbiochem.,170(1)：186-92(1988))、奧美拉唑(im等人，j.biol.chem.,260(8)：4591-7(1985))或n-乙基馬來酰亞胺(marzulli等人，boll.soc.intl.biol.sper.,61(1)：121-7(1985))。在該方法和組合中使用的氧化劑和組合物，包括但不限于過氧化氫(h2o2)、過氧化脲、氯化亞錫(sncl2)、硫酸亞錫(snso4)、氧化亞錫(sno)、氧化錫(sno2)、錫酸鈉(na2sno3)、亞錫酸鈉(na2sno2)、氯化亞錫(sncl2)、氯化錫(sncl4)，全硫錫酸鹽(sns3)和硫化亞錫(sns)。

任何生物可耐受的還原劑可以組合使用。在一個優(yōu)選的實施例中，所用的還原劑是蘇木精，一種缺氧還原劑如硝基硝唑或非硝基化合物替拉扎明(sr-4233)(zhang和stevens，melanomares.,8(6)：510-5(1998))。

氧化劑或還原劑和半抗原可以配制成單一藥物組分，或者每種藥物可以配制成單獨的藥物組分。

在一些實施例中，對于多次治療中的每一次治療，除了半抗原和氧化還原劑之外，還可以施用一種或多種化學(xué)治療藥物。在優(yōu)選的實施例中，每一次的治療包括至少兩種、至少三種、至少四種或更多種化學(xué)治療藥物。在一些實施例中，對于每次治療，可以施用不同聯(lián)合的化學(xué)治療藥物。這些化學(xué)治療劑的實例包括但不限于：甲氧基三胺、環(huán)磷酰胺、美法侖(l-肌節(jié)蛋白)、苯丁酸氮芥、六甲基麥角氨酸、噻托帕、白消安、卡莫司汀(bcnu)、洛莫司汀(ccnu)、舒馬西汀(甲基-ccnu)、鏈脲佐菌素(鏈脲霉素)、達卡巴嗪(dtic；二甲基三氯烯基-咪唑-甲酰胺(甲氧胺)、氨甲蝶呤(氨甲蝶呤)、氟尿嘧啶(5-氟尿嘧啶；5-fu)、氟尿苷(氟代-氧尿苷；fudr)、阿糖孢苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷)、巰基嘌呤(6-巰基嘌呤，6-mp)、硫鳥嘌呤(6-硫鳥嘌呤；tg)、噴司他丁(2’-脫氧梭菌霉素)、長春花堿(vlb)、長春新堿、依托泊苷、仙人霉素、放線菌素d、柔紅霉素、多柔比星、博來霉素、普卡(光輝霉素)、絲裂霉素(絲裂霉素c)、l-天冬酰胺酶、干擾素-α、順鉑(cis-ddp)、卡鉑、米托蒽醌、羥基脲、丙卡巴肼、米托坦(o,p’-ddd)、潑尼松、己酸羥孕酮、乙酸甲羥孕酮、醋酸甲地孕酮、二乙基三孕酮、乙炔雌二醇、他莫昔芬、丙酸睪酮、富氧基甲基酮、氟他胺、醋酸亮丙瑞林等。

在另一個優(yōu)選的實施例中，所用的治療藥物是胞嘧啶類似物，例如胞苷阿拉伯糖基腺嘌呤(arac)、道諾霉素、多柔比星、甲氨蝶呤(mtx)；氟化嘧啶如5-氟尿嘧啶(5-fu)；羥基脲；6-巰基嘌呤；植物生物堿如長春新堿(vcr)、vp-16和長春堿(vlb)；烷化劑如環(huán)磷酰胺腫瘤細胞裂解劑、巰乙磺酸鈉、美法侖、卡莫司汀、順鉑、氮芥(hn2)、三乙醇胺(hn3)；非常規(guī)烷基化劑如丙卡巴肼、博萊霉素、絲裂霉素c、放線菌素(dact)；或酶類如l-天冬酰胺酶等。

每種組合用藥的劑量可以憑經(jīng)驗確定，但一般是正常用于治療腫瘤贅生物、腫瘤和癌癥的劑量，以及足以進一步增強其他腫瘤治療的劑量，或足以在單獨使用以減少或改善或以某些方式減少腫瘤的癥狀。這些組合可以打包作為成套組合。

可以治療的腫瘤贅生物、腫瘤和癌癥包括但不限于腎上腺、肛門、聽覺神經(jīng)、膽管、膀胱、骨、腦、乳腺、頰、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、子宮頸、結(jié)腸、耳朵、子宮肌層、食管、眼睛、眼瞼、輸卵管、胃腸道、頭頸部、心臟、腎臟、喉、肝、肺、下顎、下頜髁突、上頜骨、嘴、鼻竇、鼻、口腔、卵巢、胰腺、腮腺、陰莖、耳廓、垂體、前列腺、直腸、視網(wǎng)膜、唾液腺、皮膚、小腸、脊髓、胃、睪丸、甲狀腺、扁桃體、尿道、子宮、陰道、前庭耳蝸神經(jīng)和外陰，各種癌癥的淋巴和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及惡性淋巴瘤。待治療的腫瘤贅生物、腫瘤和癌癥最好是實體腫瘤。這些組合治療對于實體瘤特別有效，包括大于10⁸細胞的實體瘤，例如，從約5×10⁹至約10¹¹個細胞，但不限于任何腫瘤大小的其它種類。

在優(yōu)選的實施例中，半抗原和氧化還原劑通過注射施用于腫瘤。為了使注射溶液更好地在腫瘤中分配，溶液可以用高至6amp的注射器高壓緩慢注射。例如，溶液可以以，約以，大于1amp、2amp、3amp、4amp、5amp、6amp或在以上任何兩值之間的范圍的壓力注射到腫瘤中。在一些實施例中，溶液以約1amp至約3amp的壓力注射到腫瘤中。在一些實施例中，溶液以大于約5amp的壓力注射到腫瘤中。溶液也可以用15-35號針注射。在注射期間，通過轉(zhuǎn)動針的手柄可以轉(zhuǎn)動在腫瘤中針尖。注射劑量和頻率應(yīng)根據(jù)腫瘤的性質(zhì)，大小和位置以及治療進展情況調(diào)節(jié)。在進行實際注射溶液之前，使用脊髓針預(yù)注射入腫瘤，制做注射通道以更好地在腫瘤中分布藥物溶液。注射也可以在ct、mr、超聲等適合成像技術(shù)的指導(dǎo)下進行。在一些實施例中，藥物成分分布遍及在整個腫瘤的基質(zhì)上。

因此，與單次治療的方法相比，本公開發(fā)明的多次治療可以提高治療效果。例如，通過多次治療的方法可提高治療患者的生存期，即無癌生存期、總生存期、6個月生存期、1年生存期、平均生存期等。在一些實施例中，與單次治療患者比較，多次治療的的患者顯示出6個月生存期的改善，即是，大約是，或大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或以上兩數(shù)據(jù)之間的范圍的改善。例如，與單次治療患者比較，多次治療的患者顯示出約20％至約50％、約40％至約80％、超過90％等的患者6個月生存期改善。

在一些實施例中，與單次治療患者比較，多次治療的患者可以顯示一年生存期改善，即是，大約是，或大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或者在上述值中的任意兩個數(shù)值之間的范圍的改善。例如，多次治療的患者顯示1年生存期改善的約20％至約50％、約40％至約80％，超過90％等的患者顯示有改善。

在一些實施例中，與單次治療患者比較，多次治療的患者顯示平均生存期的改善，即是，大約是，或大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或上述值中任意兩個數(shù)值之間的范圍的改善。例如，與單次治療患者比較，多次治療的患者顯示平均生存率的改善，即為約20％至約50％，約40％至約80％，超過90％等的患者顯示有改善。

因此，本發(fā)明的多次使用半抗原治療的方法可以提高單次使用半抗原治療方法的治療效果。例如，多次半抗原治療方法可提高治療患者的生存期，即無癌生存、總生存期、6個月生存期、1年生存期、平均生存期等。在一些實施例中，與單次半抗原治療的患者相比較，多次用半抗原治療的患者顯示6個月生存期的改善，即是，大約是，或大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％的改善。例如，與單次半抗原治療的患者相比較，多次用半抗原治療的患者顯示6個月生存期改善，即約20％至約50％，約40％至約80％，超過90％等。

在一些實施例中，與單次半抗原治療的患者相比較，多次半抗原治療的患者顯示出1年生存期的改善，即是，大約是，或大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％，或者在上述值中的任意兩個數(shù)值之間的范圍的改善。例如，與單次半抗原治療的患者相比較，多次半抗原治療的患者表現(xiàn)出1年生存期的改善，即為約20％至約50％、約40％至約80％、超過90％等。

在一些實施例中，與單次半抗原治療的患者相比較，多次半抗原治療的患者顯示平均生存期的改善，即是，大約是，或大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或上述值中任意兩個數(shù)值之間的范圍的改善。例如，與單次半抗原治療的患者相比較，多次半抗原治療的患者可以顯示出平均生存期的改善，即約20％至約50％、約40％至約80％、超過90％等。

在另一個具體實施例中，聯(lián)合用藥進一步包括了一免疫應(yīng)答增強劑以增強自體腫瘤特異性免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答增強劑首選使用的是卡介苗(bcg)(railiff，eur：urol，2：17-21(1992))、厭氧短棒桿菌(lillehoj等人，aviandis.,37(3)：731-40(1993))、流產(chǎn)布魯氏菌提取物、葡聚糖、左旋咪唑、替絡(luò)龍、一種酶、一種無毒力的病毒、多糖或草藥提取物如中草藥提取物。更優(yōu)選使用的酶是弧菌霍亂神經(jīng)氨酸酶(ycn)(seiler和sedlacek，resentresultscancerres.，75：53-60(1980))、木瓜蛋白酶(helling和nau,aetapatholmicrobiolimmunol.scand.，92(1)：59-63(1984)；和hess,eur.jimmunol.，6(3):188-93(1976))、β-半乳糖苷酶或刀豆蛋白。更優(yōu)選也使用無毒力的新城病毒(meulemans等人，vet.rec.,143(11)：300-3(1998)；和adams，poult，sci.,49(1)：229-33(1970))。更優(yōu)選使用來自液體培養(yǎng)蘆薈菌絲抗腫瘤多糖，具有β-1,2-連接的d-甘露吡喃糖基殘基和β-d-吡喃葡萄糖基-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基殘基作為側(cè)鏈的主鏈的初品葡甘露聚糖(mizuno等人，biochem.mol.biolint.47(4)：707-14(1999))、抗腫瘤絨狀火菇多糖制品(多糖的主鏈主要由β-(1>3)-d連接的葡萄糖，其分子量估計約為200kd)(leung等人，immunopharmacology,35(3)：255-63(1997))、西佐喃(spc)(tanji等人，yakugakuzasshi，110(11)：869-75(1990))、裂裥菌素(sakagami等人，biophys.res.commun.，155(2)：650-5(1988))、甘露聚糖(gavrilenko等人，vopr.onkol.，29(4)：67-70(1983))、香菇多糖(haba等人，int.j.cancer，l8(1)：93-104(1976))、蘇多糖(su-ps)(kumazawa等人，gantokagakuryoho,14(12)：3329-35(1987))、或mannozym(zastrow，padiatr.grenzgeb.,24(3)：229-36(1985))。

實施例

提供以下實施例來說明而不是限制本發(fā)明。

為了便于理解，提供了具體實施例以幫助解釋技術(shù)方案，即，這些實施例僅僅是為了說明的目的，而不是以任何方式來限制本發(fā)明的范圍。除非另有規(guī)定，實施例不顯示具體條件，符合常規(guī)條件或制造商的推薦條件。

實施例1晚期胰腺癌中在ct引導(dǎo)下經(jīng)皮瘤內(nèi)給藥半抗原增強的umipic治療

腫瘤內(nèi)藥物遞送的概念已經(jīng)知道了幾十年(goldberg等人，jpharmpharmacol2002，54(2)：159-80)。一些成功的實例已經(jīng)顯示了這種治療方案的臨床可行性，既可以顯著減少毒性有可以減少腫瘤的生長，但著不包括胰腺患者。胰腺癌位于一關(guān)鍵的器官，它被重要的組織和器官如十二指腸、膽囊、門靜脈和主動脈包圍著。胰腺癌對這些器官的腫瘤侵襲是最常見的，可能導(dǎo)致不可切除性。

在晚期胰腺癌患者中，我們比較了通過微創(chuàng)精準(zhǔn)個體化腫瘤內(nèi)化學(xué)誘導(dǎo)免疫治療方法增強半抗原的化學(xué)免疫治療(umipic)與腫瘤內(nèi)化療(itct)的臨床效果。然后我們分析了半抗原作為免疫增強劑的作用。

我們的數(shù)據(jù)表明umipic提供了一種理想的經(jīng)皮瘤內(nèi)方法對晚期胰腺腫瘤進行化學(xué)減瘤(半抗原在延長患者的生存時間中起重要作用)。

本發(fā)明在此描述了用umipic和itct治療的92例胰腺癌患者的結(jié)果，以前沒有報道數(shù)據(jù)是因為與雙重化療藥物和含或不含半抗原的氧化劑的組合用藥治療胰腺癌的比較研究仍在臨床研究進行中?，F(xiàn)在收集并分析了胰腺癌治療研究中使用單一藥物和含半抗原或不含半抗原氧化劑的數(shù)據(jù)。除了持續(xù)藥物釋放的創(chuàng)新之外，我們還研究了與itct相比較，umipic治療可能提供了半抗原增強的化學(xué)免疫治療(一種可能的癌癥自體疫苗)的臨床有效性的新選擇。我們進一步分析了半抗原作為免疫增強劑的作用。

材料和方法

患者選擇：

選擇的患者被診斷至少有一個直徑至少為1.5厘米的通過ct成像證實的實體胰腺癌腫瘤，活檢和病理檢查為惡性。局部晚期和/或轉(zhuǎn)移性腫瘤的胰腺癌患者用umipic治療或腫瘤內(nèi)化療(itct)治療。

研究共92例受試者。所有患者簽署了知情同意書，并隨機分入umipic治療組和itct治療組，醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)了這項研究。

在隨訪結(jié)束時還剩有83名患者(9例尚未完成研究)。umipic治療組(n＝57)有33例應(yīng)答數(shù)據(jù)，25例生存數(shù)據(jù)。itct組(n＝26)有14例應(yīng)答數(shù)據(jù)，20例生存數(shù)據(jù)。itct組中的26名患者用不含半抗原的氧化劑和細胞毒性藥物進行治療，剩余在umipic治療組中的57名患者用氧化劑和細胞毒性劑加半抗原治療[表1]。兩組患者基線特征平衡良好，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。

表1患者基線特征

umipic和itct的適應(yīng)癥和禁忌癥

除了遵循禁忌證外，所有胰腺癌患者均為umipic和itct的適應(yīng)癥。用umipic和itct治療的禁忌癥是功能狀況不佳(karnofsky狀態(tài)≤70％)、營養(yǎng)障礙、存在明顯的腹水、高血清總膽紅素水平[>3mg/dl(51.3μmoi/l)]和腎功能衰竭[血清肌酐水平>2mg/dl(176.8μmol/l)]。主要門靜脈部分或完全血栓形成是進一步排除篩選標(biāo)準(zhǔn)，其為心血管或呼吸衰竭。

藥劑的制備

由于胰腺組織非常脆弱，注射時的注意事項是關(guān)注出血，這限制了其應(yīng)用。在臨床實踐中用細針穿刺活檢，用于胰臟器官的治療診斷和評估，需要尖銳的細針。25號脊髓針和充氣器(充氣裝置，30atm/bar)均購自美國南約旦市的merit-medical醫(yī)院。在每次注射前，umipic和itct溶液都是新鮮配制的。umipic包含用于經(jīng)皮瘤內(nèi)遞送的臨床批準(zhǔn)的藥劑(氧化劑、細胞毒性藥物阿糖胞苷和半抗原)，itct含有臨床批準(zhǔn)的氧化劑和細胞毒性藥物阿糖胞苷。

治療設(shè)計

進行心肺功能和外周全血液計數(shù)的常規(guī)檢查，以排除肝臟和胰腺穿刺或相關(guān)的禁忌癥?；加幸认傺?、腸梗阻和其他重度感染的患者不能接受這種治療。在進行umipic治療之前，為了避免副作用和感染，要求患者無水?dāng)z入空腹14小時。為了控制治療期間的疼痛，在治療至少30分鐘前肌肉注射50mg的嗎啡。清潔皮膚，并在注射區(qū)域進行局部麻醉。

在ct引導(dǎo)下將脊髓針插入腫瘤。插入后，將針芯從針頭(連接到充氣筒用作高壓注射器的針)中取出，然后進行注射(圖1)。umipic和itct是相同的最小侵入性治療程序。umipic治療或itct是通過插入腫瘤的脊髓針頭輸送并和在壓力下與充氣筒連接注射以獲得臨床批準(zhǔn)的藥物在腫瘤中的完全分布。超聲或ct(pickeriq，pliillipshealthcare，bothellwa)介入用于掃描和監(jiān)測胰腺腫瘤中的點或區(qū)域密度變化(圖2-b)。特別注意監(jiān)測周邊腫瘤邊緣ct值變化，確保藥物向腫瘤邊緣全面分布(圖2-b，c)，由于聯(lián)合用藥包含注射到腫瘤塊中具有較高壓力水溶性藥物，它不同于油性乳液，油性乳液是粘稠且在腫瘤中難以分散。在umipic和itct治療中的藥物的聯(lián)合可以滲透到腫瘤的全部基質(zhì)中，甚至可以滲透到腫瘤細胞中，在氧化劑的幫助下，在腫瘤中持續(xù)釋放較長時間((qiong等人，jshandonguniv(2007)45：988-992)，注射過程平均使用時間約為30-45分鐘，然而，如果腫瘤難以滲透，則需要重復(fù)ct來監(jiān)測。對于1-5厘米的腫瘤，根據(jù)腫瘤的直徑(d^t)x2計算腫瘤的體積(d1)，對于6厘米或更大的腫瘤(d^t)x1.5計算腫瘤體積。良好操作規(guī)范，每個療法的關(guān)鍵點，應(yīng)該是基于該計算以達到遞送足夠的劑量藥物進入腫瘤。

每周一次，三周重復(fù)的ct掃描密切檢查腫瘤大小(腫瘤塊)，每周重復(fù)治療?？偣踩沃委煱ǔ跏贾委熥鳛閡mipic和itct的一個周期。如果腫瘤大小不穩(wěn)定，在重新檢查腫瘤8-9周后變小，再增加額外注射以維持更好的療效。如通過ct或超聲波測定的其他器官(如肝臟或腹部)腫瘤大小大于2厘米時，遠端腫瘤治療方案與最初胰腺癌腫瘤相同。

患者治療后密切監(jiān)測2天，明顯的全身性或局部不良反應(yīng)需要評價。

評價

對實體腫瘤治療作用的應(yīng)答根據(jù)1998年10月的erotc(歐洲癌癥研究與治療組織)和recist(nci，美國和加拿大)的評價標(biāo)準(zhǔn)(duffaud等人，bullcancer(2000)87(12)：881-886)進行評價，所有案例的報告格式(crf)由醫(yī)院的治療醫(yī)生填寫。

統(tǒng)計分析

統(tǒng)計分析由醫(yī)學(xué)院完成?？偵嫫?os)定義為從第一次治療日期到患者死亡日期的持續(xù)時間，根據(jù)kaplan-meier法繪制生存曲線，用卡方檢驗進行有效率比較。統(tǒng)計分析采用spss17.0統(tǒng)計軟件進行，p值<0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

有效性評價

對47例患者的治療效果進行了分析[表2]。應(yīng)答率[完全緩解(cr)+部分緩解(pr)/總患者]分別為12.12％和21.43％。在umipic治療和itct組中獲益率[完全緩解(cr)+部分緩解(pr)+穩(wěn)定病情(sd)/總患者]分別為87.9％和92.9％。兩組間在應(yīng)答率和獲益率無統(tǒng)計學(xué)意義(表2,3)。這可能是由于凝固(或與惡性細胞的相互作用)引起的炎癥反應(yīng)以及局部注射的細胞毒性藥物的極度濃度的原因，[6,7]絕大多數(shù)腫瘤包括遠端腫瘤處在穩(wěn)定狀態(tài)下。

表2umipic和itct治療組之間治療效果的比較

表3umipic和itct治療組之間治療效果的比較

umipic治療顯示了與一線治療相當(dāng)?shù)墓π?，并且顯示出顯著更長的總體生存期(umipic一年總生存期為28％，itct為5％)，生活質(zhì)量的最小化干擾和臨床效益率達到87.9％，這個結(jié)果是相對其他研究報道前景更好。在本研究中，發(fā)現(xiàn)一例胰腺癌患者部分緩解(圖2-a1，圖b)，但在umipic治療第一周期后兩年，發(fā)現(xiàn)部分緩解(pr)變化為完全緩解(cr)(圖2-a2-3)，在大多數(shù)患者中發(fā)現(xiàn)部分緩解和腫瘤穩(wěn)定，包括遠端腫瘤(圖2-c，d)，umipic組與itct組相比增加了1.5個月的平均中位數(shù)，并有顯著差異。

總體生存(os)(截尾觀察，幸存患者隨訪6-36個月)，umipic治療的中位生存時間為6.45個月，而與之比較的itct的中位生存時間為4.98個月，顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05，表4)。兩組的生存曲線(kaplan-meier)如圖3所示。表4顯示，umipic和itct組的中位生存時間和6個月存活率分別為6.45個月和4.98個月，及64％和45％(p<0.05)。umipic治療的一年生存率為28％，比itct的5％有顯著的改善(p<0.05)。

表4umipic和itct組之間的生存時間的比較

在umipac療法的溶液腫瘤內(nèi)注射后，患者出現(xiàn)數(shù)小時的暫時性輕度發(fā)熱(不超過38℃)，但無嚴(yán)重并發(fā)癥。沒有觀察到其他重要的全身或局部不良反應(yīng)。未觀察到針道中出血或骨髓抑制、中性粒細胞減少、血小板減少癥、胃腸道毒性或明顯掉頭發(fā)或食欲不振等副作用。

胰腺癌是一種侵襲性癌，其特征在于突出的侵襲性和遠處轉(zhuǎn)移的傾向。雖然只有不到20％的胰腺癌患者可手術(shù)切除，但手術(shù)相關(guān)的并發(fā)癥非常常見。胰腺癌也與多藥耐藥基因的高組織濃度相關(guān)，因此晚期胰腺癌可以抵抗常規(guī)治療方案，導(dǎo)致次優(yōu)治療結(jié)果(muclimore等人，proc3rdintlcongneo-adjuvantchemotherapy(1991)236-238；anigudii等人，cancer(1989)64：2001-2006)。因此，為了使毒性最小化并治療功效最大化，替代藥物遞送途徑對于實現(xiàn)臨床治療此目標(biāo)至關(guān)重要。在所有藥物遞送途徑中，我們研究中的經(jīng)皮瘤內(nèi)途徑聯(lián)合半抗原增強的化學(xué)免疫治療被認為是新的選擇研究方向，具有延長生存時間和提高不可切除胰腺癌患者生活質(zhì)量的最大潛力(lygidakis等人，annsurg(2002)236(6)：806-13)。這可以通過增加比化療栓塞更高的腫瘤部位的藥物濃度水平來實現(xiàn)，同時減少全身的藥物暴露和毒性(collinsjm，jclinoncol(1984)2：498-504)。

首先：在注射后立刻氧化劑可以擾亂腫瘤中的血管而有效凝固腫瘤體，最終導(dǎo)致凝固腫瘤塊內(nèi)更高濃度的注射藥物。這樣可以延長藥物作用的持續(xù)時間并降低給藥頻率來改善藥物利用。上述凝固是指將腫瘤塊轉(zhuǎn)化為軟或半固體的過程。這種轉(zhuǎn)化導(dǎo)致腫瘤代謝抑制，最終也會導(dǎo)致更高表達的纖維化(圖3)，并破壞腫瘤細胞生長的環(huán)境條件。在早期的動物研究和臨床研究顯示了這種轉(zhuǎn)化(qiong等人，jshandonguniv(2007)45：988-992)。在許多情況下，在umipic溶液到達腫瘤有超過90％的腫瘤細胞被殺死。一般來說，凝固過程的作用就像減少腫瘤體負荷的化學(xué)壓實或手術(shù)，同時保留腫瘤的小分的腫瘤被接下來的免疫系統(tǒng)治療。另外凝固也導(dǎo)致細胞表面和細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化。這最終導(dǎo)致細胞裂解，同時釋放腫瘤細胞內(nèi)的包括腫瘤抗原在內(nèi)的細胞內(nèi)容物，從而出現(xiàn)局部炎性反應(yīng)。這種炎癥作用，加上添加的用腫瘤相關(guān)抗原修飾的半抗原的存在，如通過凝固和化學(xué)治療從腫瘤細胞裂解中釋放的間皮細胞，可以導(dǎo)致更復(fù)雜的免疫發(fā)生。

第二：化療藥物阿糖胞苷可以通過阻斷存活細胞的分化和增殖來殺死剩余部分的腫瘤(在凝固破壞大多數(shù)腫瘤細胞后)。該作用是由一些細胞毒藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫原性的細胞凋亡引起的，即在免疫原性的細胞凋亡過程中非免疫原性細胞轉(zhuǎn)化成免疫原性細胞。例如，吉西他濱和多柔比星可以誘導(dǎo)免疫原性細胞(nowak等人，jimmunol(2003)170(10)：4905-4913)，其可能有助于化學(xué)療法致死的細胞釋放各種分子成分(casares等人，jexpmed(2005)202(12)：1691-1701)。本研究中使用阿糖胞苷僅報告對b7分子具有增強功能，有效表達和激活t細胞至jurkat細胞(一種白血病細胞)，但不適用于癌細胞免疫學(xué)死亡(ming等人，jbiochempharmaceutic(2009)30：6-13)。因此，半抗原的作用在增強腫瘤相關(guān)抗原的免疫應(yīng)答是很重要的。

此外，cd4⁺cd25⁺foxp³⁺調(diào)節(jié)性t細胞是一些最重要的免疫抑制因子。它們被細胞毒性藥物大大抑制，導(dǎo)致抗腫瘤免疫力的增強。化療可以上調(diào)treg細胞的cd95表達，可進一步誘導(dǎo)凋亡(與t細胞的效應(yīng)比較)。這表明treg細胞參與抗腫瘤免疫應(yīng)答可以作為新靶點(zhang等人，clinimmunol(2008)129(2)：219-229)。在umipic治療后腫瘤內(nèi)瞬間凝固可以殺死腫瘤塊中的treg細胞，并增強t細胞的上調(diào)。

第三：超過90％的腫瘤細胞在注射部位被凝固的腫瘤和細胞毒性藥物殺死。此后，多個自體腫瘤相關(guān)抗原從那些死亡的腫瘤細胞中釋放出來，從而激發(fā)輕度的免疫應(yīng)答作為自我接種。也就是說，自體腫瘤相關(guān)抗原的數(shù)量僅僅足以達到刺激免疫應(yīng)答所需的閾值。盡管如此，抗原的這種高度的免疫力對于免疫應(yīng)答是不可或缺的。因此，在鑲嵌變性腫瘤的小分子半抗原存在情況下，所得貯庫中裂解的腫瘤細胞被半抗原修飾并產(chǎn)生多個修飾的腫瘤相關(guān)抗原。釋放mhc相關(guān)肽，具有更復(fù)雜的免疫功能，也可作為自體腫瘤疫苗。這種腫瘤疫苗增強了患者本身腫瘤的免疫原性。瘤內(nèi)凝固治療后，在初始凝固(以及轉(zhuǎn)移性腫瘤和微小病灶)作用下，可以刺激t淋巴細胞抵抗原始腫瘤(不受umipic治療的影響)內(nèi)或周圍的存活腫瘤細胞。我們的臨床資料和動物研究表明，umipic治療后，免疫應(yīng)答顯著改善，特別是cd4⁺t細胞免疫^[12]。這種自體腫瘤免疫接種在預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移和從原始腫瘤細胞恢復(fù)中起到了重要作用。通過顯著增加和活化的抗原提呈細胞(包括樹突狀細胞和巨噬細胞)促進全身免疫抵抗患者特異性腫瘤相關(guān)抗原，進一步被t細胞和nk細胞識別，最終有助于抑制和根除腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移灶。另外，急性炎癥被重新定義為腫瘤進展的關(guān)鍵組成部分。炎性腫瘤細胞吸引不同的淋巴細胞，包括抗原提呈細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞、和活化的b細胞(其與腫瘤相關(guān)抗原如間皮瘤腫瘤復(fù)合物、dna、rna其他細胞溶解產(chǎn)物再作用(yub2004)[us6811788],le等人，jimmunother(2013)36(7)：382-9)。暴露于這些腫瘤相關(guān)抗原的淋巴細胞，特別是用半抗原修飾的抗原(由腫瘤細胞裂解物生成)引發(fā)腫瘤特異性免疫應(yīng)答。這可能包括激素，細胞和補體介導(dǎo)的反應(yīng)，其進一步抵抗最初不被凝固作用殺死的相鄰活腫瘤細胞的存在。其他炎性介質(zhì)如腫瘤壞死因子和干擾素-γ也被用于抗腫瘤生長，yuemei等人構(gòu)建了一種新的小鼠腫瘤模型，結(jié)合了一種代表了急性炎癥的人工手術(shù)傷口。他們發(fā)現(xiàn)早期階段的腫瘤細胞的抑制作用與傷口中的干擾素-γ分泌相關(guān)(ma等人，jexperclincancerres(2009)28：2)。因此，腫瘤特異性免疫應(yīng)答增強了，就像“看不見的外科手術(shù)刀”一樣，并對有生長力量的腫瘤細胞有影響作用，從而阻斷腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，凝固(如去膨脹)至少消除了腫瘤中一些(超過90％)抗腫瘤藥靶向的腫瘤細胞，其殺死了最初未被umipic殺死的剩余的活瘤細胞。原位“接種”進一步消除活的腫瘤細胞，這導(dǎo)致比其他治療選擇更好的治療效果。因此，有理由得出這樣的結(jié)論，umipic是一種相對更安全和更有效的治療方案，特別是對于強烈需要更有效地控制疾病的晚期階段疾病患者。

實施例2半抗原增強的umipic治療在晚期肺癌中的治療作用

umipic療法是癌癥治療的新選擇，因為它通過瘤內(nèi)藥物遞送整合了局部化療作用和系統(tǒng)抗腫瘤免疫。我們應(yīng)用了umipic療法用一復(fù)雜的溶液包括三個組成分，即，氧化劑、細胞毒性藥物(阿糖胞甙：ara-c)和半抗原來治療晚期肺癌。以前的動物研究表明，臨床認可的氧化劑可以通過變性徹底有效地凝固腫瘤塊，其可以殺死超過90％的腫瘤組織，減少血液流動，并且使得凝固的腫瘤內(nèi)有高濃度的注射細胞毒性藥物(大于常規(guī)化學(xué)治療的10倍)用于維持藥物釋放(baofayu(2004)[us6811788b2])。細胞毒性藥物阿糖胞苷可以繼續(xù)殺死未被凝固破壞的腫瘤細胞，同時從死亡的腫瘤釋放的自體腫瘤相關(guān)抗原引發(fā)免疫應(yīng)答作為自我接種。同時，半抗原與腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合，增加這些抗原的特異性，進一步增強全身的體液和細胞免疫，抑制和根除腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。在過去十年中，我們在晚期肺癌患者中聯(lián)合使用有或沒有半抗原的藥物進行了這項治療，收集和分析了兩組數(shù)據(jù)，并對半抗原在umipic的作用進行了評估分析(baofayu(2004)[us6811788b2])。

材料和方法

患者選擇和數(shù)據(jù)收集

120例晚期肺癌患者中有97例納入研究，并對完整的生存資料進行了分析。試驗組患者(n＝55)接受umipic療法治療，其中19/55例患者接受umipic療法兩周期的治療，20/55例患者接受umipic療法無輔助治療。對照組患者(n＝42)接受itct治療，其中29/42例患者接受itct治療兩周期，13/42例患者接受itct無輔助治療。患者被告知了研究細節(jié)，并簽署書面知情同意書同意參加試驗。醫(yī)院倫理委員會業(yè)批準(zhǔn)了這項研究。經(jīng)由成像和病理檢查或細胞學(xué)診斷證實，分析了1999年11月至2006年9月期間晚期和/或轉(zhuǎn)移性癌癥的原發(fā)性肺癌患者。數(shù)據(jù)收集來自醫(yī)院醫(yī)生歸檔的病例報告表(crf)。有三個可用內(nèi)容，臨床特征數(shù)據(jù)，隨訪時間和應(yīng)答數(shù)據(jù)(表1)。對于每位患者，第一次隨訪是在治療開始一個月后安排的，然后每月安排一次。記錄在每次隨訪后更新。

itct和umipic的配制

在每次腫瘤內(nèi)注射臨床認可的組分包括氧化劑，細胞毒性藥物和半抗原之前，用于umipic療法的藥物溶液要新鮮制備；而itct的溶液含有氧化劑和細胞毒性藥物，但沒有半抗原。

治療實施

所有患者均進行肺ct掃描作為治療前的基線。也進行了心肺功能的常規(guī)檢查?；颊咛膳P或側(cè)臥以準(zhǔn)確定位肌內(nèi)注射鹽酸布桂嗪注射液(0.1g)和注射用血凝糖酶(1ku)。在umipic之前，患者被要求空腹不進水14小時，以避免這種治療的副作用和感染。常規(guī)消毒后，鋪巾和用2％利多卡因局部麻醉，在ct引導(dǎo)下將25號脊髓針插入腫瘤，用ct監(jiān)測腫瘤中的針尖，取出針芯，將充氣機連接，用作高壓注射器(充氣裝置，30atm/bar，麥瑞通醫(yī)療，猶他州，美國)，然后進行溶液注射。

umipic和itct具有相同的微創(chuàng)和像針活檢那樣簡單的治療程序。umipic或itct由插入腫瘤的脊髓針進行實施，并將溶液加壓(在大氣壓水平)，在ct成像引導(dǎo)下將獲得臨床批準(zhǔn)的方案在腫瘤中全面分布。pickeriqct用于單片掃描，并對肺腫瘤感興趣區(qū)域ct值的密度變化進行監(jiān)測，需要特別注意監(jiān)測腫瘤邊緣ct值的密度變化，以確保藥物全面分布到邊緣。由于藥物是水溶性的，它比油性藥物更好，油性藥物是粘稠的，難以分散在腫瘤中。在高壓條件下，umipic和itct療法的聯(lián)合用藥可以滲透遍及全部的腫瘤基質(zhì)中，甚至長期持續(xù)存藥物釋放到腫瘤細胞中。整個操作的平均時間約30-45分鐘。治療期間有嚴(yán)重咳嗽患者無法運作，被排除在數(shù)據(jù)分析之外。對于1厘米至5厘米的腫瘤注射液的體積通過腫瘤直徑(d^t)×2計算，對于不低于6厘米的腫瘤注射液的體積通過腫瘤直徑(d^t)×1.5計算；根據(jù)這一計算，良好規(guī)范是所有手術(shù)成功治療的關(guān)鍵，以便向腫瘤提供足夠的劑量[圖1]。注射組合溶液后，醫(yī)生將通過ct在腫瘤感興趣的某一點或區(qū)域觀察密度值(表明藥物在腫瘤中擴散)和ct掃描成像引導(dǎo)的針跡周圍出血等相關(guān)并發(fā)癥。與一周期治療相比，通常需要第二和第三周期的治療可以獲得更好的療效。患者應(yīng)該最后一次治療4-6周后再次接受檢查，一些患者接受第二周期治療。

評價

對實體腫瘤治療的應(yīng)答根據(jù)1998年10月的erotc(歐洲癌癥研究與治療組織)和由nci(美國和加拿大)制定的recist(實體瘤反應(yīng)評價標(biāo)準(zhǔn))的評價標(biāo)準(zhǔn)(duffaud等人，bullcancer(2000)87(12)：881-886)進行評價，所有案例的報告格式(crf)由醫(yī)院的治療醫(yī)生填寫。

統(tǒng)計分析

濱州醫(yī)學(xué)院進行統(tǒng)計學(xué)分析。主要目的是評價總生存期(os)，其定義為從第一次治療日期到患者死亡日期的持續(xù)時間，并使用kaplan-meier生存分析進行評估。次要目標(biāo)是4-6周的應(yīng)答率，定義為根據(jù)recist(版本1.0)計算治療后完全緩解(cr)、部分緩解(pr)或疾病穩(wěn)定(sd)的患者比例。用卡方檢驗比較分析有效率。使用spss17.0統(tǒng)計軟件(spss公司，芝加哥，伊利諾斯州，美國)進行統(tǒng)計學(xué)分析，p值<0.05被認為是統(tǒng)計學(xué)顯著差異。

結(jié)果

患者特征：隨訪結(jié)束時，120例入選患者中有97人完成了研究，并分析了他們的生存數(shù)據(jù)，其中55例接受umipic治療，42例接受itct治療。在umipic組，男性43例，女性12例，年齡范圍28-76歲，中位年齡59士11歲；根據(jù)腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(tnm)分型83.6％診斷為ⅲ期和ⅳ期。組織病理學(xué)結(jié)果顯示，26例患者(47.3％)有鱗狀細胞癌，15例(27.2％)具有腺癌細胞癌，14例(25.5％)患有混合的或非特征性的肺癌(基于活檢診斷)。itct組男性33例，女性9例，年齡19-85歲，中位年齡55士12歲，其中腺癌6例(14.3％)、鱗癌17例(40.5％)和18例(42.8％)具有混合或非特征性肺癌(基于活檢診斷)。兩組患者的基線特征平衡良好[表5]。

表5患者基線特征

有效性評估：umipic組的中位總生存期(截尾觀察，仍然存活的患者繼續(xù)隨訪)為11.23個月，itct組為5.62個月[表6]。兩組間(長5.61個月)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)，兩組生存(kaplan-meier)如圖2-1所示，有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，6個月均存活率為76.36％(umipic)對45.23％(itct)，具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.01)，1年生存率為45.45％(umipic)對23.81％(itct)，具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05)[表7]。值得注意的是，umipic治療兩個周期比itct治療兩周期具有生存優(yōu)勢。我們評價了在umipic和itct再優(yōu)化組中兩個治療周期的患者的療效，結(jié)果顯示6個月存活率分別為100％和72.41％(p<0.05)，1年生存率為73.68％(umipic)對37.93％(itct)(p<0.05)[表8和9]。umpic與itct患者開展2個周期的治療，umipic治療組的中位生存期為14個月，itct為7個月，差異有顯著性(長7個月)(p<0.01)，所有組的生存曲線(kaplan-meier)如圖2-2所示。兩個治療周期的治療在主要腫瘤體中表現(xiàn)出比單周期治療更強的減瘤作用，并在umipic殺死主要腫瘤之后提供免疫力一更好的平衡點以消除腫瘤細胞更少的負載(不受umipic影響)。

表6umipic和its組之間的平均和中位生存時間的比較

表7umipic和itct組之間6個月和1年生存時間的比較

表8umipic和itct組治療兩個周期的的平均和中位生存期比較

表9umipic和itct組之間兩個周期的6個月和1年生存時間的比較

兩組中，對接受umipic(n＝20)或itct(n＝13)治療，并無輔助治療(手術(shù)，放療或放化療)的33例患者的完整存活資料也進行了分析，結(jié)果顯示umipic和itct治療組之間的平均os分別為11個月和4個月(長7個月)(p<0.05)，無輔助治療的情況見表10。umipic和itct治療的6個月存活率為80％與30.1％的(p<0.05)，umipic的1年存活率為50％，itct為15.38％(p<0.05，表11和生存如圖5-3所示)。umipic與itct比較[表10和表11]表明，umipic單一治療對患者存活率有較好的影響。

表10umipic和itct組之間沒有輔助治療的平均和中位生存時間的比較。

表11umipic和itct組之間沒有輔助治療的6個月和1年生存時間的比較。

umipic和itct組的應(yīng)答率(cr+pr+sd/total)分別為81.8％和83.3％，顯示無顯著差異(p＝0.055)[表12]。有必要指出，在首次ct檢查時，兩組臨床觀察到腫瘤塊的大小輕微增加，這可能是由于凝固誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，而在加半抗原蛋白umipic后誘導(dǎo)了更多的炎性免疫反應(yīng)活性(goldberg等人，procnanoscienceandtechnologyinst(nsti)(2006)2：1-4；hogeneschh.，vaccine(2002)20(3)：34-39)。令人鼓舞的是，晚期癌癥患者的一些顯著的反應(yīng)為umipic療法提供了最大的作用證據(jù)[圖6-1，圖6-2]。

表12umipic和itct組之間的治療應(yīng)答

并發(fā)癥：相關(guān)并發(fā)癥包括暫時性輕度發(fā)熱(不超過38℃)數(shù)小時，注射區(qū)輕微疼痛，氣胸4例，白細胞減少(正常范圍內(nèi))[表13]。治療后，沒有患者在腫瘤周圍出現(xiàn)出血和可觀察到針道。沒有觀察到明顯的全身或局部不良反應(yīng)和如骨髓抑制、中性粒細胞減少、血栓形成、胃腸道毒性、頭發(fā)或食欲明顯損失等副作用均未觀察到。

表13umipic和itct組的相關(guān)并發(fā)癥

世界范圍內(nèi)，肺癌仍然是主要的致命疾病之一。局部治療如手術(shù)和放射治療是肺癌早期患者的主要治療方法。約54％的患者在診斷時存在轉(zhuǎn)移灶，因為在初期階段缺乏臨床癥狀，往往會導(dǎo)致預(yù)后非常差，總體5年生存率為3.8％(wright等人，thorax(2006)61：597-603)。對于大多數(shù)晚期的肺癌，標(biāo)準(zhǔn)化療通常主流是涉及培美曲塞(zimmermann等人，lancetoncol(2012)13：247-255；baldwin等人，drugs(2009)69：2279-2302)，奧沙利鉑(cappuzzo等人，britishjournalofcancer(2005)93：29-34)和多西他賽(komiyama等人，britishjournalofcancer(2012)107：1474-1480)，但顯然其結(jié)構(gòu)已達到令人失望的平臺(schiller等人，nengljmed(2002)346：92-98)。在過去十年中，盡管為表皮生長因子受體(egfr)突變患者(吉非替尼或厄洛替尼)引入了一系列靶向藥物(mok等人，nengljmed(2009)361：947-957；maemondo等人，nengljmed(2010)362：2380-2388)和alk重排(克唑替尼)(takaaki等人，clincancerres(2011)11(23)：7213-7218)，存活率仍未明顯改善。今天，包括來自肺癌細胞系(或腫瘤相關(guān)抗原)和免疫刺激檢查點抗體的疫苗治療可以改善肺癌的結(jié)果，盡管傳統(tǒng)上認為對于轉(zhuǎn)移體的治療是不可能的。而且，免疫治療和化學(xué)治療或化學(xué)免疫治療聯(lián)合已經(jīng)成功運用于臨床(reck等人，jclinoncol(2013)31：abstrlba8011；sandler等人，nengljmed(2006)355：2542-2550；reck等人，annoncol(2010)21：1804-1809)。

umitic在這項臨床研究中是一項獲得專利的實體腫瘤治療方法，并在臨床上基于腫瘤大小的個性化劑量進行了探索，同時利用患者特異性體內(nèi)修飾的自體腫瘤抗原作為自身免疫接種以產(chǎn)生腫瘤特異性的應(yīng)答。該方案是一種個性化且新鮮制備的含有氧化劑、細胞毒性藥物和半抗原的化合物溶液。每個組分在治療中起重要作用。

瘤內(nèi)治療具有局部藥物濃度高，最低全身毒性的特點，是全身治療的一突出和有吸引力的替代方案，其臨床獲益越來越多(tohcla等人，chemotherapy1999)45：197-204；jackson等人，cancerres(2000)60：4146-4151)。瘤內(nèi)遞送方法與氧化劑誘導(dǎo)的凝固結(jié)合可以顯著增加藥物的局部蓄積(高達全身給藥的10-100x)(baofayu(2004)[us6811788b2]；brinckerh.，crit.rev.oncol.hematol(1993)15：91-98)。在抗腫瘤研究過程中，氧化劑通過凝固作為主要腫瘤減瘤的主要力量，而藥物阿糖胞苷繼續(xù)殺死剩余的腫瘤。凝固作用可以有效地改變細胞外基質(zhì)和改變腫瘤的形態(tài)和生物化學(xué)成分如膠原蛋白、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維、纖維素、蛋白聚糖、透明質(zhì)酸和其它大分子，獲得一軟的，半固體或固體物質(zhì)，破壞代謝和誘導(dǎo)的纖維化產(chǎn)生[圖7]。并在我們以前的動物實驗(qiong等人，jshandonguniv.(2007)45(10)：988-992)還發(fā)現(xiàn)也可能破壞腫瘤細胞生長的環(huán)境條件。因此，凝固是通過延長藥物作用的持續(xù)時間來改善藥物利用的主要原因之一，以及通過持續(xù)的藥物釋放進行系統(tǒng)的藥物暴露，毒性大大降低(collinsjm，jclinoncol(1984)2：498-504)。

在另一項臨床研究中觀察到持續(xù)釋放。我們分別開展了99tem標(biāo)記的阿糖胞苷聯(lián)合氧化劑和99tcrn-ara-e單用瘤內(nèi)注射在肝細胞癌患者的同一肝臟中的兩個腫瘤體中的治療試驗。我們發(fā)現(xiàn)在12小時保留在每個腫瘤中藥物比例分別為82％對16％，在注射后24小時保留在每個腫瘤中的藥物比例分別為60％對0％[圖8]。此外，在充氣筒的存在作用下，特別重要的是注意到該方法的優(yōu)點包括藥物在腫瘤中的高持續(xù)性和均勻的藥物擴散，可以呈現(xiàn)令人滿意的臨床結(jié)果。

與化療相比，在本研究中umipic的副作用包括輕度發(fā)燒、局部疼痛和4例偶爾氣胸，但是所有患者的生活質(zhì)量都改善。氣胸是胸部活檢的相關(guān)并發(fā)癥之一(zhenlu等人，chinjintervimagingther(2013)10：275-278)。雖然只發(fā)生在少數(shù)患者，然后自發(fā)恢復(fù)。然而，為了減少氣胸的可能性，建議在取出針頭之前，保持注射器有組合溶液，并要求患者吸氣以阻止針跡。最短距離和穿刺入腫瘤的理想角度是避免并發(fā)癥的先決條件。針跡帶來的潛伏性轉(zhuǎn)移細胞被留在針跡的組合溶液滴殺死，因此我們的研究中沒有發(fā)現(xiàn)局部轉(zhuǎn)移的病例。

由于被殺死的腫瘤細胞的腫瘤特異性抗原釋放，在腫瘤中創(chuàng)建一個原位疫苗庫是腫瘤內(nèi)化療過程中另一個有趣的因素(goldberg等人，jpharmpharmacol(2002)54：159-180)。此外，umipic不僅可以誘導(dǎo)體內(nèi)疫苗樣效應(yīng)，還可以通過添加半抗原顯著增加全身免疫。當(dāng)多個自體腫瘤抗原從細胞毒性藥物誘導(dǎo)的凋亡或壞死腫瘤細胞中釋放時，細胞死亡可能是t細胞應(yīng)答的啟動事件，并且可以誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答。這些細胞死亡被稱為“有益死亡”(nowak等人，advdrugdelivrev(2006)58(8)；975-990；lake等人，natrevcancer(2005)5(5)：397-405)，其可以引起弱的免疫應(yīng)答，作為免疫調(diào)節(jié)劑促進的體內(nèi)自體接種，即嵌入變性腫瘤的小分子半抗原；并且用腫瘤抗原修飾細胞碎片或基質(zhì)變成一新的復(fù)合物，對宿主免疫系統(tǒng)有更多的專屬性。這將產(chǎn)生更強的腫瘤抗原被稱為自體腫瘤疫苗，使腫瘤本身的癌細胞更具免疫原性。

鑒于uimpic治療的樂觀生存優(yōu)勢，我們進一步分析了umipic組與常規(guī)治療相結(jié)合的治療效果。聯(lián)合治療umipic的中位os為11.23個月(表6)，單獨的umipic治療為11個月(表10)，表明與單獨umipic治療相比，聯(lián)合治療不能充分延長存活時間。此外，根據(jù)臨床觀察，與單周期治療相比，患者接受兩個周期umipic治療的中位os為14個月(表8)和更優(yōu)的存活率(表9)。這可能歸因于組合型釋放抗原誘導(dǎo)的長期免疫記憶，導(dǎo)致更有效的抗腫瘤反應(yīng)。腫瘤負荷較小時，umipic治療的減瘤作用使免疫細胞更好地控制殘留的癌細胞。

假設(shè)由凝固和半抗原誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)也可能與抗腫瘤免疫有關(guān)?？乖岢始毎蜓仔越M織的遷移可以提高從死亡腫瘤釋放到引流淋巴結(jié)的腫瘤相關(guān)抗原的捕獲和加工。這推動了所需的抗原特異性免疫應(yīng)答，以進一步根除遠端的癌細胞(ribas等人，jclinoncol(2003)21：2415-2432)。

通過增加經(jīng)由抗原提呈細胞(包括樹突狀細胞和巨噬細胞)的半抗原修飾的抗原分別向i類和ii類途徑(對cd4⁺和cd8⁺t細胞)的呈遞而顯著增強患者對特異性腫瘤相關(guān)抗原的系統(tǒng)免疫，(dredge等人，cancerimmimolimmunother(2002)51，521-531；ho等人，jbiomedbiotechnol(2011)2011：250-860)。它有產(chǎn)生免疫應(yīng)答效應(yīng)物和免疫記憶應(yīng)答的潛能來識別和破壞umipic治療后原發(fā)性腫瘤和微型病灶中和周圍的的初始凝固未殺死的肺癌細胞，在我們的動物試驗中觀察到系統(tǒng)性免疫應(yīng)答升高的實例，有高水平的cd4+/cd8+(qiong等人，jshandonguniv.(2007)45(10)：988-992)。

臨床研究表明，umipic可以在局部腫瘤中誘導(dǎo)更多的炎癥反應(yīng)，并且與itct相比，在所有方面(表6-11)晚期肺癌患者中顯示出顯著延長的存活時間，并且umipic療法中加入半抗原作為免疫學(xué)助推器在延長生存時間方面發(fā)揮重要作用。

總之，umipic用于肺癌治療是一種非侵入性和有效的治療方法，具有令人滿意的高度特異性的特征，并且可以延長生存期。它提供了更精確的修正治療的前景，并可以產(chǎn)生更好的應(yīng)答，特別是對不能手術(shù)或耐藥類型的鱗狀細胞癌的晚期患者效果更好。

實施例3半抗原增強的抗腫瘤化學(xué)免疫治療(tcit)和腫瘤內(nèi)化療(itct)在晚期肝細胞癌中的治療效果

通過腫瘤內(nèi)給藥tcit將局部化療效果與全身抗腫瘤免疫活性相結(jié)合。我們已運用聯(lián)合藥物的tcit療法對治療晚期肝細胞癌開展治療。包含三種組分：氧化劑、細胞毒性藥物(阿糖胞苷(ara-c)和半抗原)。這種療法通過延長藥物作用的持續(xù)時間并降低給藥頻率來改善藥物利用。而注射藥物阿糖胞苷繼續(xù)殺死未被凝固破壞的腫瘤細胞，自身腫瘤相關(guān)抗原從被凝固(或阿糖胞苷)殺死的細胞中釋放出來，然后作為自體接種引發(fā)免疫應(yīng)答。

同時，一個小分子(半抗原)與這些抗原(和其他大載體)結(jié)合進一步增強全身體液和細胞免疫，以抑制和消除腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。收集和分析了這些數(shù)據(jù)。這項回顧性隊列研究的初步目標(biāo)是評估tcit與腫瘤內(nèi)化療藥物(itct)注射的可行性、安全性和有效性。評價了半抗原的作用。

材料和方法

患者選擇和數(shù)據(jù)收集

患者被告知研究程序細節(jié)，并通過簽署知情同意書同意參加。通過成像和病理學(xué)檢查證實，對局部晚期和/或轉(zhuǎn)移性癌癥的原發(fā)性的肝細胞癌患者進行回顧性分析。有些患者接受了tcit治療，其他的患者接受itct單獨治療(不加半抗原)。所有患者簽署了tcit的患者知情同意書，同意書由醫(yī)院的倫理委員會(98-23)批準(zhǔn)。數(shù)據(jù)是收集來自醫(yī)院醫(yī)師完成的病例復(fù)查表(crf)。收集的數(shù)據(jù)包括臨床特征，隨訪時間和應(yīng)答數(shù)據(jù)。對于每位患者，在治療開始后兩周首次進行隨訪，然后一個月一次隨訪。中位隨訪時間為6個月。在每次隨訪期間更新記錄。

tcit和itct治療的藥物配制

在每個注射劑前，聯(lián)合的藥物要新鮮制備，臨床批準(zhǔn)的氧化劑，腫瘤內(nèi)遞送的細胞毒性藥物(含有/不含有半抗原)方案。藥物是用連接到作為高壓注射器的擴張器(bd公司，加利福尼亞州)的脊柱針注射到腫瘤內(nèi)。

治療實施

所有患者治療前均要么有肝臟的超聲或ct掃描作為基線。治療前也進行了心肺功能的常規(guī)檢查。實驗室血液檢查包括乙型和丙型肝炎病毒抗原/抗體、血清甲胎蛋白(afp)、血清白蛋白(alb)、血清總膽紅素(alb)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alt)。肌內(nèi)注射鹽酸布桂嗪(100mg)和注射用血凝酶(1ku)。將患者置于仰臥位或側(cè)臥位，以準(zhǔn)確定位注射部位。常規(guī)皮膚消毒后，鋪巾和用2％利多卡因局部麻醉，在超聲或ct引導(dǎo)下，脊髓針以一定角度引入腫瘤。針頭到達腫瘤的必要深度，藥物在大氣壓水平下通過擴張器遞送到針頭，以促進腫瘤內(nèi)藥物的擴散(圖1)。注射了兩倍于腫瘤直徑(ml)的組合溶液后，醫(yī)師觀察到腫瘤內(nèi)藥物擴散及相關(guān)并發(fā)癥，例如腫瘤內(nèi)出血和針道周圍出血。整個過程大約需要30-45分鐘?；颊咴谧⑸浜髢蓚€小時接受嚴(yán)密觀察，以發(fā)現(xiàn)任何副作用，并進一步監(jiān)測5-7天，以確定是否需要更多的注射。如果需要更好的效果，在一或兩周的間隔里重復(fù)注射。在最后一次治療4-6周后，患者應(yīng)進行ct或超聲檢查。

評價

通過nci(國家癌癥研究所)(美國和加拿大)1999年10月制定的erotc(歐洲癌癥研究和治療組織)和recist(實體腫瘤反應(yīng)評價標(biāo)準(zhǔn))的實體腫瘤效應(yīng)評估標(biāo)準(zhǔn)評估治療的應(yīng)答情況。(daffaud等人，bullcancer(2000)87(12)：881-886)。

統(tǒng)計分析

進行了統(tǒng)計學(xué)分析。主要目的是評價總生存期(os)，其定義為從第一次治療日期到患者死亡日期的持續(xù)時間，并使用kaplan-meier生存分析進行評估。次要目標(biāo)是4-6周的應(yīng)答率，定義為根據(jù)recist(版本1.0)計算治療后完全緩解(cr)，部分緩解(pr)或疾病穩(wěn)定(sd)的患者比例。分析了應(yīng)答率和存活率并用卡方檢驗比較分析組間的統(tǒng)計差異。使用spss17.0統(tǒng)計軟件(spss公司，芝加哥，伊利諾斯州，美國)進行統(tǒng)計學(xué)分析，p值<0.05被認為是統(tǒng)計學(xué)顯著性。

結(jié)果

患者特征：隨訪結(jié)束時，總共有339例(男性：女性比例285：54)具有完整生存數(shù)據(jù)的患者納入了本研究。214例患者接受有半抗原的tcit治療，125例患者接受無半抗原的itct治療。大多數(shù)根據(jù)直徑超過5厘米的腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(tnm)分級分為iii期。兩組間患者的基線特征平衡良好(表14)。

表14患者的基線特征

有效性

接受itct治療的61例患者和接受tcit治療的119例患者的完整的腫瘤應(yīng)答數(shù)據(jù)可用于分析。tcit和itct組的應(yīng)答率(cr+pr+sd/total)分別為78.68％和81.52％，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表15)。治療后數(shù)天，觀察到兩組腫瘤塊的大小輕度增加，這可能是由凝固引起的炎癥反應(yīng)或惡性細胞與來自局部給藥的極高濃度細胞毒性藥物相互作用引起的相互(goldberg等人，procnstinanotech(2006)2：1-4；goldberg等人，jpharmpharmacol(2002)54(2)：159-180)。tcit和itct組的中位os(截尾觀察，尚存的患者仍然在隨訪)分別為7.0個月和4.0個月[表16]，表示兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)，兩組生存曲線(kaplan-meier)如圖9所示。tcit和itct組的6個月和1年生存率分別為60.8％對36.3％和31.1％對15.0％[表17]。tcit組的生存率顯著高于itct組。

表15腫瘤內(nèi)化療(itct)和殺腫瘤化療(tcit)的治療應(yīng)答效果

cr：完全緩解；pr：部分緩解；sd:病情穩(wěn)定；pd:疾病進展

表16接受tcit和itct治療患者的生存時間

表17tcit和itct治療的患者生存時間的比較

1例接受tcit治療患者臨床觀察到遠端腫瘤的全身應(yīng)答。一例有雙側(cè)肺轉(zhuǎn)移病灶的患者接受了11次針對原發(fā)性腫瘤的tcit治療，他從診斷的時間以來已經(jīng)存活了五年多。患者在肺部的原發(fā)性腫瘤以及未注射的遠端部位的腫瘤疾病退化[圖10]，進一步支持由半抗原增強的全身性免疫應(yīng)答引起的“遠端效應(yīng)”概念。

多次治療組的中位生存時間是單次治療組(7.0個月對3.0個月)的兩倍，顯示有明顯的差異(p<0.01)。同時，多次治療組的6個月和1年的生存率均顯著高于單次治療組(p<0.01)[表16-19]和[圖9]

表18單次和多次(≥2)治療組之間患者生存時間的比較

表19單次和多次(≥2)治療的療效比較

常見的并發(fā)癥包括暫時性的輕度發(fā)熱(不超過38℃)幾個小時，注射部位輕微疼痛，治療后腫瘤周圍和針道周圍出現(xiàn)最小的出血。沒有觀察到其它顯著的全身或局部不良反應(yīng)，沒有觀察到如骨髓抑制、中性粒細胞減少、血小板減少癥、胃腸道毒性、以及頭發(fā)和/或食欲的明顯減少的常見化療副作用。

肝細胞癌是基于免疫的療法靶向治療的潛在理想腫瘤(butterfieldlh，gastroenterology12(2004)(suppl1)25：232-241)，因此免疫治療方法可能在其治療中起關(guān)鍵作用。至今肝細胞癌的免疫治療策略包括免疫刺激細胞因子的施用(shiratori等人，anninternmed(2003)138(4)：299-306)，細胞因子和共刺激分子基因治療(cao等人，stemcells(1998)16(suppl1)：251-260)，用裝載特異性腫瘤抗原的樹突狀細胞進行的免疫治療(melcher等人，cancerres(1999)59：2802-2805))和用免疫原性疫苗或抗體刺激(matar等人，jbiomedsci(2009)16:30)。

由于腫瘤負荷超過免疫治療的能力，當(dāng)前單一的免疫療法(以及標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)療法)顯示對目前晚期肝細胞癌治療的有限效果。免疫治療和化療(或化學(xué)免疫治療)的有效聯(lián)合仍有待探索。

rescigno等人報道表明細胞毒性藥物并不總是對免疫系統(tǒng)有害；它實際上可以通過增加腫瘤抗原呈遞和消耗腫瘤促進調(diào)節(jié)性t細胞其他機制(rescigno等人，biochimbiophysacta(2007)1776(1)：108-123)來增強抗腫瘤免疫應(yīng)答。此外，化療免疫治療也證實了在治療肝細胞癌(lau等人，annsurg(2001)233(2)：236-241)，淋巴瘤(bujanda等人，clintransloncol(2009)11(9)：604-608)和白血病(schulz等人，blood(2002)100：3115-3120)中的協(xié)同效應(yīng)。在本臨床研究中，試驗的tcit療法是用于實體瘤適應(yīng)癥的專利治療方法，它利用患者體內(nèi)的特異性自體瘤相關(guān)抗原作為一種腫瘤特異性應(yīng)答的自體接種。

化療栓塞術(shù)是肝癌的介入放射治療方法(clarktwi，semininterventradiol(2006)23(2)：119-25)。然后如果腫瘤太大，或者沒有血管，這種治療是不合適的。化療栓塞術(shù)可以用油性藥物乳液來阻塞血管。藥物需要離開油性溶媒進入腫瘤以殺死癌細胞。當(dāng)油性藥物聯(lián)合向整個身體移動時，它會產(chǎn)生副作用，所以我們開發(fā)了tcit療法，不需要導(dǎo)管或油性藥乳液。

首先，在tcit之后，氧化劑可以通過凝固立即有效地改變細胞外基質(zhì)(em)和改變腫瘤細胞的形態(tài)和如膠原蛋白和其它高分子量物質(zhì)。這導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)化為軟的，半固體或固體，阻止腫瘤代謝并引起纖維化[圖7]。凝固也抑制血液流動并且在凝血的腫瘤內(nèi)以較高的濃度包裹注射的藥物。通過延長藥物的持續(xù)時間以及持續(xù)的藥物釋放而延長全身藥物暴露來改善藥物的利用率，還能降低其毒性。同時，藥物阿糖胞苷將繼續(xù)殺死不被凝固殺死的腫瘤細胞。腫瘤內(nèi)治療作為全身治療的顯著而有吸引力的替代方案已被批準(zhǔn)用于臨床(klutz等人，humgenether(2011)22(11)：1403-1412)?？拱┧幬锏牧鰞?nèi)遞送可以顯著提高藥物的局部蓄積(高于全身給藥的10-100倍)(goldberg等人，jpharmpharmacol(2002)54(2)：159-180)在我們的臨床治療中觀察到緩釋現(xiàn)象。我們在一名肝細胞癌患者的同一肝臟中兩個腫瘤塊中分別瘤內(nèi)注射了阿糖胞苷與氧化劑和阿糖胞苷單獨注射，并在12小時時發(fā)現(xiàn)每個腫瘤的藥物保留率分別為82％對16％，注射后24小時的藥物保留率分別為60％對0％[圖8]。因此，特別重要的是觀察這種方法的優(yōu)點是可以獲得包括持續(xù)均勻的藥物擴散。

大家相信腫瘤中的凝固和藥物持續(xù)的過程在化學(xué)減滅腫瘤主體中發(fā)揮了強大的作用(圖10)，并為患者用以發(fā)生抗微腫瘤(不超過108個腫瘤細胞，免疫治療起重要作用)的自身免疫療法提供了一個機會。

其次，據(jù)報道，有“遠端效應(yīng)”，經(jīng)局部治療后遠端腫瘤消退(demaria等人，intjradiatoncolbiolphys(2004)58：862-870)。該研究中，半抗原在一例雙側(cè)肺轉(zhuǎn)移的肝細胞癌患者中可以誘導(dǎo)一免疫學(xué)(相關(guān)的遠端樣應(yīng)答)抗腫瘤應(yīng)答。這意味著tcit誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答可以對在不同接種部位即使是成像-不可見或不可接近的腫瘤顯示有效抗微腫瘤的作用，charlesludgate(ludgate，cm，clincancerres(2012)18：4522-4525)指出，病原體-相關(guān)的分子模式(pamps)和損傷相關(guān)的分子模式(damp)可能通過使用“內(nèi)源性”疫苗方法誘發(fā)急性抗癌免疫應(yīng)答，從而對轉(zhuǎn)移性腫瘤部位具有期望的遠端效應(yīng)。臨床報告中提到了類似的結(jié)果postow等人，nengljmed(2012)366：925-931；abei等人，radiationoncology(2013)8：239)。

我們的研究結(jié)果表明，tcit療法提高了患者生存率。tcit和itct組的6個月和1年患者生存率分別為60.8％對36.3％和31.1％對15.0％(p<0.01)(見表16)。我們早期的動物研究表明，tcit治療后的全身免疫力有顯著的提升，特別是對于cd4⁺t細胞的數(shù)量。在出現(xiàn)遠端效應(yīng)的病例中，我們僅治療肝臟中的原發(fā)性腫瘤，結(jié)果導(dǎo)致兩個肺轉(zhuǎn)移灶消失。協(xié)同作用可能主要通過半抗原作為免疫佐劑結(jié)合局部化學(xué)治療劑以激活全身抗腫瘤免疫來實現(xiàn)的。

當(dāng)由凝固和細胞毒性藥物引起的凋亡或壞死的腫瘤細胞釋放多種自體腫瘤相關(guān)抗原時，理論上它們可以作為自體接種引發(fā)免疫應(yīng)答。然而，研究報告稱，細胞死亡可能是t細胞應(yīng)答的引發(fā)事件，并誘導(dǎo)有效的免疫性(nowak等人，advdrugdelivrev(2006)58(8):975-990；lake等人，natrevcancer(2005)5(5):397-405)。在免疫調(diào)節(jié)劑(即嵌入變性腫瘤的小分子半抗原)存在的情況下，所得到的貯庫中裂解的腫瘤細胞用半抗原修飾并產(chǎn)生更強的腫瘤相關(guān)抗原抗體，被稱為自體腫瘤疫苗(使腫瘤本身更具免疫原性)，因此，通過顯著增加活性的抗原提呈細胞(apcs)(包括樹突狀細胞(dcs)和巨噬細胞)來增強對患者特異性腫瘤相關(guān)抗原的全身免疫，其被t細胞和nk細胞識別?？晒艋钚?或致腫瘤性)原發(fā)性腫瘤細胞周圍的腫瘤細胞，因為活性腫瘤細胞還沒有被初始凝凝固殺死。

炎癥反應(yīng)可能涉及抗腫瘤免疫。具有細胞因子和趨化因子釋放的炎性組織的凝固體吸引樹突狀細胞和其他抗原呈遞細胞來滿足從死亡腫瘤細胞釋放的抗原至引流淋巴結(jié)，推動適應(yīng)性急性免疫進一步根除遠處的癌細胞。該臨床研究表明，tcit可以在局部腫瘤中誘發(fā)更多的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致tcit和itct組無顯著的治療效果。它確實顯示了tcit組的生存時間顯著增加。我們認為，有半抗原的tcit誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能在腫瘤的自體疫苗樣功能中起重要作用，但是這種免疫力可能不足以達到顯著的臨床獲益。因此，tcit治療可能需要多次治療(或免疫細胞或臍帶血細胞治療)作為tcit治療后進行主要腫瘤負荷減瘤的輔助治療(圖11)。

在我們的試驗中，多次治療已經(jīng)證明了臨床療效和安全性[表17和18]。這可能歸因于持續(xù)釋放抗原誘導(dǎo)的長期免疫記憶，導(dǎo)致更有效的抗腫瘤應(yīng)答。而且，作為活化的t細胞的標(biāo)記，共刺激劑的升高可能與臨床獲益和總生存率相關(guān)(carthon等人，clincancerres(2010)16：2861-2871)。

與傳統(tǒng)化療相比，tcit的副作用包括最低的發(fā)熱，局部疼痛和針道意外轉(zhuǎn)移。臨床結(jié)果是生活質(zhì)量改善。最好在保持注射器填充組合物溶液時退出針頭，努力阻止轉(zhuǎn)移性細胞回流。此外，最短的距離和理想的角度對于穿刺進入腫瘤是至關(guān)重要的。這是避免并發(fā)癥的前提條件。沿著針道的潛在轉(zhuǎn)移細胞被沿著針道組合溶液殺死。我們的研究中，我們在執(zhí)行這一步后沒有發(fā)現(xiàn)任何局部轉(zhuǎn)移的病例。在較早期的研究中，我們在注射器不包含組合溶液撤回針后發(fā)現(xiàn)一例皮膚下的轉(zhuǎn)移瘤案例，這被其他研究所支持，作為“最佳針刺活檢的臨床經(jīng)驗，幾乎沒有歸因于針道轉(zhuǎn)移的并發(fā)癥的證據(jù)”(goldberg等人，jpharmpharmacol(2002)54(2)：159-180))

總之，tcit提供了聯(lián)合半抗原增強的化療免疫治療是安全有效的治療方法，特別是對于晚期階段的患者。它創(chuàng)造了一種減小腫瘤體的方法，并以特定和創(chuàng)新的方式提高患者自身的免疫力來對抗微型癌癥。

實施例4用多次半抗原連續(xù)處理的化學(xué)手術(shù)治療

具有實體瘤的癌癥患者在雙周間隔進行多次化學(xué)手術(shù)治療。對于每個治療階段，專利是用氧化劑和不同的半抗原治療。這種治療方案減少了耐藥性的發(fā)展，提高了癌癥患者的反應(yīng)性。

材料和方法

患者選擇和數(shù)據(jù)收集

患者被告知該研究程序細節(jié)，并簽署知情同意書同意參加。通過成像和病理檢查證實有實體瘤的患者進行回顧性分析。設(shè)置對照組，每個治療期間接受相同的半抗原。所有患者由醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。數(shù)據(jù)來自醫(yī)院醫(yī)生完成的病例報告表(crf)。收集的數(shù)據(jù)包括臨床特征、隨訪時間和應(yīng)答數(shù)據(jù)。對于每個患者，治療完成后兩周進行首次隨訪，然后是一個月一次隨訪。中位隨訪時間為6個月。在每次隨訪期間更新記錄。

化學(xué)手術(shù)藥物配制

組合藥物在每次注射之前新鮮制備，包括臨床批準(zhǔn)的氧化劑和用于腫瘤內(nèi)遞送的半抗原方案。使用過氧化氫作為氧化還原劑。首次治療dnp用作半抗原。第二次治療芐基苯霉素用作半抗原。第三次治療，使用鹽酸普拉卡酰胺作為半抗原。第四次治療，使用鹽酸肼屈嗪作為半抗原。這些藥物被連接有一作為高壓注射器的擴張器的脊髓穿刺針將藥物注射進腫瘤(bd公司，加利福尼亞州)。

治療實施

所有患者要么有治療前的肝臟超聲要么ct掃描基線。治療前也進行心肺功能的常規(guī)檢查。實驗室血液檢查包括乙型和丙型肝炎病毒抗原/抗體、血清甲胎蛋白(afp)、血清白蛋白(alb)、血清總膽紅素(tbil)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alt)。肌內(nèi)注射鹽酸布桂嗪(100mg)和注射用血凝酶(1ku)?；颊弑３盅雠P位或側(cè)臥位以準(zhǔn)確定位注射部位。經(jīng)常規(guī)皮膚準(zhǔn)備，鋪巾和用2％利多卡因進行局部麻醉，在超聲或ct引導(dǎo)下，脊髓針以一定角度引入到腫瘤中。當(dāng)針頭達到腫瘤的必要深度時，在大氣壓力的水平下通過擴張器將藥物遞送至針頭，以促進藥物在腫瘤中的擴散。注射了兩倍腫瘤直徑(ml)的組合溶液后，醫(yī)師觀察到腫瘤內(nèi)藥物擴散和相關(guān)的并發(fā)癥，如瘤內(nèi)出血和針道周圍出血。整個過程大約需要30-45分鐘?；颊咴谧⑸浜蟊蛔屑氂^察兩個小時的任何副作用，并進一步監(jiān)測5-7天，以決定是否需要更多的注射。注射時間以兩周的間隔重復(fù)，最多四次，最后一次治療后4-6周，患者進行ct或超聲再次檢查。

評價

根據(jù)由nci(國家癌癥研究所)(美國和加拿大)1999年10月制定的erotc(歐洲癌癥研究和治療組織)和recist(實體腫瘤反應(yīng)評價標(biāo)準(zhǔn))的實體腫瘤效應(yīng)評估標(biāo)準(zhǔn)評估治療的應(yīng)答情況。(daffaud等人，bullcancer(2000)87(12)：881-886)。

統(tǒng)計分析

進行了統(tǒng)計學(xué)分析。主要目的是評價總生存期(os)，其定義為從第一次治療日期到患者死亡日期的持續(xù)時間，并使用kaplan-meier生存分析進行評估。次要目標(biāo)是4-6周的應(yīng)答率，定義為根據(jù)recist(版本1.0)計算治療后完全緩解(cr)、部分緩解(pr)或疾病穩(wěn)定(sd)的患者比例。分析了應(yīng)答率和存活率并用卡方檢驗比較分析組間的統(tǒng)計差異。使用spss17.0統(tǒng)計軟件(spss公司，芝加哥，伊利諾斯州，美國)進行統(tǒng)計學(xué)分析，p值<0.05被認為是統(tǒng)計學(xué)顯著性。

前述詳細描述實施例的附圖，其說明了本公開的具體實施例。具有不同結(jié)構(gòu)和操作的其他實施例不脫離本公開的范圍。術(shù)語“發(fā)明”或諸如此類的是參考本說明書中提出的申請人發(fā)明的許多可替代方面或?qū)嵤├哪承┚唧w示例來使用的，并且它的使用和缺失都不是為了限制申請人的發(fā)明或權(quán)利要求書的范圍。本說明書僅為了方便讀者而分成幾部分。標(biāo)題不應(yīng)該被限制在限制這個權(quán)利的范圍之內(nèi)。定義旨在作為本發(fā)明的描述的一部分。應(yīng)當(dāng)理解，在不脫離本發(fā)明的范圍的情況下，可以改變本發(fā)明的各種細節(jié)。此外，前述描述僅僅是為了說明的目的，而不是為了限制的目的。

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除非另有明確說明，否則在本文獻及其實施例中使用的術(shù)語和短語應(yīng)被解釋為公開的，而不是限制性的。作為上述的例子：術(shù)語“包括”應(yīng)當(dāng)被理解意思為“包括，無限制”或諸如此類；術(shù)語“示例”用于討論中的項目的示例性實例，不是詳盡的或限制性的列表；形容詞如“常規(guī)的”，“傳統(tǒng)的”“正常的”“標(biāo)準(zhǔn)的”“已知的”和相似意思的術(shù)語應(yīng)當(dāng)不被解釋為限制所描述的項目到給定的時間段，或在給定的時間可用。但是，這些術(shù)語應(yīng)該被理解為涵蓋常規(guī)的、傳統(tǒng)的、正常的或標(biāo)準(zhǔn)的可用的現(xiàn)在或?qū)砣魏螘r間已知的技術(shù)。同樣地，與連詞“和”連接的一組條款不應(yīng)被理解為需要每個后那些條款下每一項都在組中存在，反而應(yīng)該被理解為”和/或“，除非從上下文顯而易見或另有明確說明。類似地，一組條款用連詞“或”連接不應(yīng)被視為需要在組之間相互排斥，反而被理解為”和/或“此外，除非從上下文顯而易見或另有明確說明。而且盡管發(fā)明條款，元素或成分描述可單獨描述或用單數(shù)說明，但是復(fù)數(shù)被認為在其范圍之內(nèi)，除非明確地說明對單數(shù)的限制，例如，“至少一個“可以指單數(shù)或復(fù)數(shù)，也不限于此。

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