專利名稱：：一種治療免疫缺陷癥的藥物組合的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種藥物組合，更具體地說，本發(fā)明涉及重組人甘露糖結(jié)合型5凝集素治療免疫缺陷癥的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：甘露糖結(jié)合凝集素(MBU是補(bǔ)體系統(tǒng)的固有成分,是血清中的一種由肝臟合成的C型凝集素,是鈣依賴性糖結(jié)合蛋白。MBL可識別和結(jié)合病原微生物表面的甘露糖、巖藻糖(fucose)、和N-乙酰葡糖胺(N-acetyl-glucosamine,10Glc2NAc)等糖結(jié)構(gòu)。MBL首先與病原微生物的糖類配體結(jié)合，隨后構(gòu)象發(fā)生變化,激活與之相關(guān)聯(lián)的MBL相關(guān)的絲氨酸蛋白激酶(MBLassociatedserineprotease，MASP),兩種MASP(MASP1、MASP2)具有與活化的Cls類似的生物學(xué)活性，其中MASP2可水解C4和C2分子,MASP1則可直接切割C3,繼而形成C3轉(zhuǎn)化酶，然后補(bǔ)體順序激活，這是補(bǔ)體激活的MBL途徑(MBLpathway)，在機(jī)體的固15有性免疫防御中發(fā)揮重要作用。人類MBL基因定位于第IO號染色體上,有兩個基因，其中MBL1是偽基因，只有MBL2(下述MBL即指MBL2)能夠編碼蛋白質(zhì)。MBL由四個外顯子(exon)組成,分別編碼N-端富含半胱氨酸區(qū)、膠原區(qū)、頸區(qū)和糖基識別區(qū)(carbohy2draterecognitiondomain，CRD)。基本結(jié)構(gòu)是由三條相同約32kDa的多肽鏈構(gòu)成的20亞單位組成的26個不等的寡聚體,與Clq分子類似。其中N-端富含半胱氨酸區(qū)參與肽鏈亞單位間N-端二硫鍵形成；膠原樣區(qū)域相互盤繞,呈螺旋狀，參與免疫調(diào)理作用及結(jié)合MASP而激活補(bǔ)體；頸區(qū)位于膠原區(qū)和CRD之間，與穩(wěn)定亞單位的結(jié)構(gòu)有關(guān)；CRD形成球狀結(jié)構(gòu),此結(jié)構(gòu)是MBL蛋白質(zhì)發(fā)揮生理效應(yīng)的基礎(chǔ)。MBL功能依賴于蛋白質(zhì)多聚化程度和血漿水平，結(jié)構(gòu)基因變異可能會產(chǎn)生3不能多聚化的產(chǎn)物，從而不能激活補(bǔ)體,編碼區(qū)上游的變異會影響MBL血清濃度。己經(jīng)發(fā)現(xiàn)與MBL相關(guān)的基因突變位點(diǎn)共有l(wèi)l。MBL也是一種急性期反應(yīng)蛋白，其血清水平在外科創(chuàng)傷和感染后可增加3倍，MBL水平存在個體差異，兒童高于成人，新生兒出生后7d其血清水平是成人的2倍,此后持續(xù)下降，到12歲時達(dá)到5成人水平。MBL缺乏的病人接受化療、骨髓移植、造血干細(xì)胞移植的過程中，其嚴(yán)重感染的發(fā)生機(jī)率明顯高于MBL水平正常的病人。慢性病毒性肝炎也與MBL缺乏有關(guān)。在動物模型中觀察到MBL識別并殺死某些惡性細(xì)胞。MBL通過3個方面發(fā)揮抗病原微生物作用對病原微生物的調(diào)理作用；活化MBL途徑；結(jié)合、中和某些病原體。10MBL能與HIVgp120蛋白上高表達(dá)的甘露糖基結(jié)合，并使其唾液酸酸化，調(diào)節(jié)二者結(jié)合,葡萄糖基化酶抑制劑和神經(jīng)氨酸酶可促進(jìn)MBL與gpl20的結(jié)合。HIVgpl20上高表達(dá)的甘露糖基是鵬L與HIV作用的關(guān)鍵。Haurum等研究顯示MBL可與gpl20的重組體結(jié)合。Saifuddin等[16]把MBL固化在微孔滴定板上俘獲HIV病毒，顯示實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系產(chǎn)生的HIV病毒株和所有原始分離HIV病毒株都能與15鵬L緊密結(jié)合，用MBL在微孔板上涂層可以多俘獲5%109&的HIV，而等量的HIV特異性單克隆抗體多俘獲的量通常不超^:0.5%。亦即MBL對HIV的俘獲能力明顯高于HIV特異性單克隆抗體，因此，有學(xué)者根據(jù)MBL的顯著俘獲HIV的作用將其喻為"抗gpl20抗體"。目前認(rèn)為MBL與HIV作用的機(jī)制可能涉及4個方面:補(bǔ)體活化、調(diào)理作用、20中和作用和封閉DC-SIGN。補(bǔ)體活化:MBL是補(bǔ)體活化的MBL途徑的始動因子。但關(guān)于HIV或感染HIV的細(xì)胞活4tMBL途徑的研究不多。Haurum等用重組gpl20涂層微孔滴定巢。當(dāng)不含MBL的血清和含有MBL的血清加入滴定巢時，后者會出現(xiàn)顯示MBL途徑活化的C3禾PC4補(bǔ)體成分的沉積。這個實(shí)驗(yàn)說明MBL可以活化補(bǔ)25體活化的MBL途徑。但有研究者認(rèn)為Haurum的實(shí)驗(yàn)存在方法學(xué)上的不足，實(shí)驗(yàn)所用的重組gpl20是昆蟲細(xì)胞產(chǎn)生的，都是高表達(dá)型糖基。gpl20上這種增加了的高表達(dá)的糖基可能增加MBL結(jié)合gpl20和活化補(bǔ)體的能力。更有研究得出相反的結(jié)論，如Saarloos等則發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞上表達(dá)的HIVgp120表4面膜蛋白并不能有效結(jié)合MBL，而且細(xì)胞上與gp120結(jié)合的MBL也不能有效活化凝集素途徑。調(diào)理作用Ying等用單核細(xì)胞攝取HIV來評價MBL的調(diào)理作用。實(shí)驗(yàn)顯示，用MBL孵化的HIV野生株可以使單核細(xì)胞攝取的HIV增加6倍。表明在5體內(nèi)MBL可以通過結(jié)合病毒和調(diào)理組織巨噬細(xì)胞來影響血液中HIV的清除。中和作用Ezekowitz等首先用MBL培養(yǎng)H9T細(xì)胞系產(chǎn)生IOO個感染單位HIVIIIB,然后用HIVIIIB感染T細(xì)胞的H9細(xì)胞系，MBL在lug/ml、30ug/ml、50ug/ml濃度時中和HIV病毒株的百分比分別為25%、75%和10100%。Ying等的一項(xiàng)研究表明HIVIIIB在IOug/ml、50ug/ml水平中和HIV感染分別為31%和50%。與用另一個HIV細(xì)胞系衍生病毒株HIVMN觀察到的結(jié)果相似,這些實(shí)驗(yàn)部分揭示了MBL對HIV的中和作用。阻斷DC-SIGN:Gregory等發(fā)現(xiàn)預(yù)先將MBL與HIV的X4、R5株孵育能夠阻止DC-SIGN介導(dǎo)的T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，機(jī)制可能是MBL封閉了HIV結(jié)合15DC-SIGN陽性細(xì)胞，從而阻止進(jìn)一步感染T細(xì)胞；提示在HIV感染過程中，MBL可能會抑制DC-SIGN介導(dǎo)HIV的吸收和傳播。關(guān)于MBL與艾滋病的相關(guān)性研究,主要集中在兩方面艾滋病對MBL水平的影響；MBL水平與艾滋病的進(jìn)程的相關(guān)性。對于艾滋病中的MBL變化，Garred等報道低水平MBL的病人(包括由于MBL基因突變引起的MBL表達(dá)減少)對HIV的20易感性增加。本發(fā)明提供了一種MBL治療艾滋病的藥物組合，經(jīng)過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本藥物組合能夠明顯的抑制HIV21誘導(dǎo)C8166細(xì)胞形成合胞體，以及抑制HIV21感染細(xì)胞，具有良好的開發(fā)和應(yīng)用價值。
發(fā)明內(nèi)容25本發(fā)明提供了一種治療免疫缺陷癥的藥物組合。本發(fā)明設(shè)計的藥物組合5為重組人甘露糖結(jié)合型凝集素(MBL)為2.550mg/瓶，該藥物組合為液體制劑/或可重新溶解的凍干粉制劑。該藥物組合的pH控制在5.58.5之間；緩沖體系選擇磷酸鹽緩沖液或者Tris鹽緩沖液。該藥物組合包含藥學(xué)上可接受的穩(wěn)定劑、抑菌劑、等滲劑。5本發(fā)明的目的就是提供一種治療免疫缺陷癥的藥物組合。在本發(fā)明的第一個方面，就是提供了一種治療免疫缺陷癥的藥物組合，其主要成分為重組人甘露糖結(jié)合型凝集素(MBL)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，該藥物組合的MBL含量為2.550mg/瓶。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，該藥物組合為液體制劑/或?？芍匦氯芙獾?0凍干粉制劑。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，該藥物組合的PH控制在5.58.5之間；緩沖體系選擇磷酸鹽緩沖液或者Tris鹽緩沖液。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，該藥物組合包含藥學(xué)上可接受的穩(wěn)定劑、抑菌劑、等滲劑。15具體實(shí)施例實(shí)施例制劑方法一1.制劑處方重組人甘露糖結(jié)合型凝集素50mg;Na2HP04*12H20:3.95mg;NaH2P042H20:0.15mg;蔗糖6.0mg;甘露醇30.Omg;分裝體積為1.0ml;pH8.0。202.制劑工藝的確定為滿足臨床用藥的需要，開展中試規(guī)模的凍干粉針制劑工藝研究，確定了凍干曲線；在此基礎(chǔ)上連續(xù)制備了3批真空凍干制品，裝量50mg/支，灌裝體積分別為l.Oml/支(含O.lml附加量)。凍干粉針外觀潔白、細(xì)膩、疏松、強(qiáng)度好、殘余水分低于3%、理化性質(zhì)穩(wěn)定。對連續(xù)3批中試研究的產(chǎn)品的質(zhì)量進(jìn)行檢測，25結(jié)果表明注射用MBL蛋白凍干粉針的制備工藝是穩(wěn)定的，完全可以應(yīng)用于該產(chǎn)品的生產(chǎn)。實(shí)施例二制劑方法二1.制劑處方重組人甘露糖結(jié)合型凝集素20mg;蔗糖ll.Omg;甘露醇55.0mg;6Na2HP04'12H20:7.25mg;NaH2P04'2H20:0.26mg;分裝體積為1.10ml;pH7.0。2.制劑工藝的確定為滿足臨床用藥的需要，開展中試規(guī)模的液體制劑工藝研究；在此基礎(chǔ)上連續(xù)制備了3批無菌液體制劑制品，裝量20mg/lml/支，灌裝體積分別為1.Oml/5支(含0.lml附加量)。液體制劑透明、理化性質(zhì)穩(wěn)定。對連續(xù)3批中試研究的產(chǎn)品的質(zhì)量進(jìn)行檢測，結(jié)果表明注射用MBL蛋白液體制劑的制備工藝是穩(wěn)定的，完全可以應(yīng)用于該產(chǎn)品的生產(chǎn)。實(shí)施例三抑制HIV21誘導(dǎo)C8166細(xì)胞形成合胞體實(shí)驗(yàn)1.試劑10抗HIV2p24單克隆抗體(McAb)，艾滋病人血清(APS)，HRP標(biāo)記山羊抗人IgG抗體，F(xiàn)ITC綿羊抗人IgG結(jié)合物。2.細(xì)胞和病毒C8166細(xì)胞。按常規(guī)方法制備HIV21IIIB貯存液，滴定并計算出病毒的TCID50。病毒貯存液分裝后，置-70t保存。153.化合物對HIV誘導(dǎo)C8166細(xì)胞形成合胞體的抑制實(shí)驗(yàn)將待測化合物倍比稀釋,每孔100yL，設(shè)3個重復(fù)孔，設(shè)正常細(xì)胞和HIV感染細(xì)胞對照。每孔滴加3X105/mL的C8166細(xì)胞100uL,然后滴加200TCID50的HIV21IIIB。終體積為300uL。第3天在倒置顯微鏡下(X100)觀察待測化合物對合胞體形成的影響。EC50(50%effectiveconcentration)為抑制合胞體20形成達(dá)50%時的藥物濃度。選擇指數(shù)(SelectivityIndex,SI)為CC50/EC50的比值。4.HIV感染細(xì)胞融合阻斷實(shí)驗(yàn)將待測化合物倍比稀釋，設(shè)三復(fù)孔，每孔100pL。對照孔不含待測化合物。每孔滴加3X104個未感染的C8166細(xì)胞和1X104個HIV21IIIB/H9細(xì)胞。置25細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后，在倒置鏡下觀察細(xì)胞融合形成合胞體來判斷化合物是否阻斷病毒與細(xì)胞的結(jié)合過程。5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表lMBL抑制HIV21誘導(dǎo)C8166形成合胞體作用<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例四抑制HIV21感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)1.試劑抗HIV2p24單克隆抗體(McAb)，艾滋病人血清(APS)，HRP標(biāo)記山羊抗人5IgG抗體，F(xiàn)ITC綿羊抗人IgG結(jié)合物。2.細(xì)胞和病毒C8166細(xì)胞。按常規(guī)方法制備HIV21IIIB貯存液，滴定并計算出病毒的TCID50。病毒貯存液分裝后，置-70'C保存。3.ELISA檢測HIV21p24抗原10用碳酸鹽緩沖液稀釋抗HIV21p24McAb至10ug/mL，包被微量反應(yīng)板(Greiner公司)；7。C封板1.5h;每孔加待測樣品100uL,溫育2h后，力卩1:500稀釋的APS100uL。37。C溫育1h;每孔加入合適濃度的HPR標(biāo)記羊抗人lgG100uL。37。C溫育lh;充分洗滌，加入ABTS底物使用液100yL，15min后，中止反應(yīng)后，BioRad3550酶標(biāo)儀測定OD值(405/595nm)。154.化合物對HIV感染細(xì)胞的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)感染復(fù)數(shù)為0.005。計算出化合物對HIV21IIIB感染細(xì)胞的保護(hù)率。CC50為對50%的宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒性的化合物濃度；EC50為保護(hù)50%的HIV21HIB感染細(xì)胞存活時的化合物濃度。SI為CC50/EC50的比值。表2MBL抑制HIV21誘導(dǎo)C8166形成合胞體作用樣品細(xì)胞測定方法CC50(iiM)EC50(nM)選擇指數(shù)SIAZTC8166CPE/MTT1.680.1153907MBLC8166CPE/MTT0.0012NP3inactive在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請25所附權(quán)利要求書所限定的范圍。權(quán)利要求1.一種治療免疫缺陷癥的藥物組合，其特征在于，其主要成分為重組人甘露糖結(jié)合型凝集素(MBL)。2.如權(quán)利要求1所述，其特征在于，該藥物組合的MBL含量為2.5550mg/瓶。3.如權(quán)利要求l所述，其特征在于，該藥物組合為液體制劑/或。可重新溶解的凍干粉制劑。4.如權(quán)利要求1所述，其特征在于，該藥物組合的pH控制在5.58.5之間；緩沖體系選擇磷酸鹽緩沖液或者Tris鹽緩沖液。5.如權(quán)利要求1所述，其特征在于，該藥物組合包含藥學(xué)上可接受的穩(wěn)定劑、抑菌劑、等滲劑。全文摘要本發(fā)明提供了重組人甘露糖結(jié)合型凝集素(MBL)作為主要成分的藥物組合。該藥物組合在治療免疫缺陷癥方面，作用機(jī)理獨(dú)特，初步的研究證實(shí)了該藥物組合具有一定的抑制HIV病毒誘導(dǎo)的合胞體的形成和抑制HIV病毒感染細(xì)胞的護(hù)作用。文檔編號A61K38/17GK101485880SQ20081003263公開日2009年7月22日申請日期2008年1月15日優(yōu)先權(quán)日2008年1月15日發(fā)明者樺嚴(yán),軍任,史克勇,黃陽濱申請人:上海新生源醫(yī)藥研究有限公司;上海新生源生物醫(yī)藥有限公司