相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求2014年9月10日提交的美國臨時專利申請?zhí)?2/048,586的優(yōu)先權(quán)，該案以引用的方式整體并入本文中。

發(fā)明領(lǐng)域

本公開涵蓋用于治療癌前皮膚病變的組合物和方法。本發(fā)明的組合物包含細胞毒性劑和胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素(tslp)誘導劑。

發(fā)明背景

在美國，非黑色素瘤型皮膚癌是影響眾多個體的最常見癌癥類型[1]。如果不加治療，則這些癌癥會導致顯著發(fā)病，包括潰瘍、感染及局部毀容。重要的是，就鱗狀細胞癌來說，可以在臨床上鑒別為光化性角化病的癌前病變可以早期治療，以防止其發(fā)展成需要昂貴手術(shù)程序的全面爆發(fā)的皮膚惡性疾病。除用于臨床上可見的光化性角化病的破壞性治療(例如冷凍療法)外，也已經(jīng)開發(fā)出若干表面治療，這些治療還能治療亞臨床病變。這些針對區(qū)域的治療(field-directedtreatment)包括光動力療法、5-氟尿嘧啶及咪喹莫特(imiquimod)[2]。然而，當前治療的有效性、治療持續(xù)時間及與這些治療有關(guān)的副作用的嚴重程度限制了患者的順應(yīng)性及其治療功效。因此，需要開發(fā)針對光化性角化病的新穎治療方法，這些治療方法可以在較少應(yīng)用情況下提供最佳的結(jié)果，同時具有較少副作用。考慮到僅在美國，光化性角化病的年護理成本就超過$900,000,000[3]，故可以消除光化性角化病并預防皮膚癌發(fā)生的有效治療也將對衛(wèi)生系統(tǒng)帶來重要影響。

發(fā)明概述

在一方面，本發(fā)明涵蓋一種治療癌前皮膚病變的方法。該方法包括向病變表面施用含細胞毒性劑和胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素(tslp)誘導劑的組合物。

在另一方面，本發(fā)明涵蓋一種預防癌前皮膚病變轉(zhuǎn)變成皮膚癌的方法。該方法包括：(a)鑒別具有一個或多個癌前皮膚病變的受試者；及(b)向所述癌前皮膚病變表面施用含細胞毒性劑和tslp誘導劑的組合物，其中所述癌前皮膚病變的大小變小，由此防止向皮膚癌發(fā)展。

在又另一方面，本發(fā)明涵蓋一種預防癌前皮膚病變發(fā)生的方法。該方法包括向有發(fā)生癌前皮膚病變的受試者表面施用含細胞毒性劑和tslp誘導劑的組合物。

附圖簡述

本申請文件含有至少一個以彩色繪制的附圖。此帶有彩色附圖的專利申請公布的復本將在提出請求并繳納必要費用之后由專利局提供。

圖1a描繪了患者隨機分組的示意圖。登記入選患者并且對其所有適合治療的解剖部位進行評價并拍照。藥物治療隨機分組是基于由治療醫(yī)師挑選的參與者的主要適合解剖部位。在確定藥物治療分配之后，參與者將對其所有適合解剖部位施加相同的藥物治療。*：研究藥物是根據(jù)有關(guān)每一主要解剖部位的隨機化清單進行分配，但參與者將對其所有適合解剖部位施加相同藥物治療。rue：右上肢；lue：左上肢。圖1b描繪的圖略述了臨床試驗的時間表。應(yīng)注意，第2周和第4周的就診是可選的。*：推薦在第2周和第4周就診，但非必需的。

圖2描繪了研究的患者統(tǒng)計數(shù)據(jù)。顯示了入選患者的數(shù)量(175)、進入并完成研究的患者數(shù)量(132)及基于其主要解剖部位的分配。

圖3描繪了卡泊三醇+5-氟尿嘧啶與5-氟尿嘧啶治療之間光化性角化病病變減小百分比的比較。在8周就診時，相較于標準護理治療(5-fu+凡士林)，連續(xù)四天每天兩次用5-fu+卡泊三醇組合治療引起光化性角化病(ak)的明顯較高清除率(對于所有解剖部位，p＜0.0001，studentt檢驗；rue：右上肢；lue：左上肢)。

圖4描繪了與治療方案有關(guān)的不良事件的圖像。如緊接著在最后一次治療后(第5天)以及在停止治療后10天(第2周)所見，連續(xù)4天每天兩次用5-fu+卡泊三醇治療的參與者出現(xiàn)集中在光化性角化病部位周圍的明顯炎癥。

圖5a、圖5b、圖5c及圖5d描繪的圖顯示了每一治療的解剖部位的紅斑評分是0分、1分及2分的參與者的百分比。(圖5a)頭皮、(圖5b)面部、(圖5c)rue及(圖5d)lue。應(yīng)注意，由于治療持續(xù)時間較短，故沒有紅斑評分是3分或4分的參與者，而這在連續(xù)2-3周每天兩次用5-fu治療(標準護理方案)的患者中較常見。

圖6a和圖6b描繪了用于圖6c中呈現(xiàn)的圖像的兩種治療方案。圖6c描繪了在治療前后從ak得到的蘇木精與伊紅(h&e)染色的切片。這些圖像顯示用5-fu+卡泊三醇治療的參與者在治療(tx)后真皮上層中的淋巴細胞主要積累于ak中。治療前后針對ak的免疫熒光染色也顯示，用5-fu+卡泊三醇治療的參與者在治療后ak中出現(xiàn)穩(wěn)固tslp表達，包括真皮-表皮連接區(qū)附近cd3+t細胞的積累。這些t細胞中大部分是cd4+t輔助細胞(插圖)。k14指代皮膚角質(zhì)細胞。

發(fā)明詳述

申請人意外地發(fā)現(xiàn)，包含細胞毒性劑和胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素(tslp)誘導劑的表面組合物明顯減小癌前皮膚病變的數(shù)量和大小。病變數(shù)量和大小的減小是在較短治療過程中發(fā)生，由此降低了不良作用的風險。因此，本公開提供了用于預防和治療各種皮膚病變的組合物和方法。以下描述本發(fā)明的其它方面。

i.組合物

在一個方面，本發(fā)明的組合物包含細胞毒性劑和胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素(tslp)誘導劑。在一個具體實施方案中，本發(fā)明的組合物包含5-氟尿嘧啶(5-fu)和維生素d類似物。相較于未修飾形式，維生素d類似物可以被修飾成改善生物利用率、溶解性、穩(wěn)定性、處理特性或其組合。因此，在另一方面，本發(fā)明的組合物包含修飾的維生素d。在又另一方面，本發(fā)明的組合物包含維生素d類似物的前藥。

除細胞毒性劑和tslp誘導劑外，本發(fā)明的組合物還可以任選包含一種或多種另外的藥物或治療活性劑。本發(fā)明的組合物可以另外包含藥學上可接受的賦形劑、載劑或稀釋劑。此外，本發(fā)明的組合物可以含有防腐劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、甜味劑、著色劑、添味劑、鹽(本發(fā)明的物質(zhì)本身可以呈藥學上可接受的鹽形式)、緩沖劑、包覆劑或抗氧化劑。

以下將更詳細地描述本發(fā)明的其它方面。

(a)細胞毒性劑

如本文所使用，“細胞毒性劑”一般是影響正在迅速分裂的細胞的藥劑。細胞毒性劑是對正在迅速分裂的細胞有毒的任何天然存在、經(jīng)過修飾或合成的化合物。此類藥劑可用于治療贅生物，以及治療以細胞增殖或高活性細胞群為特征的其它癥狀或疾病。細胞毒性劑可以是烷化劑、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、抗細胞骨架劑、拓撲異構(gòu)酶抑制劑、抗激素劑、靶向性治療劑、血管生成抑制劑、生長抑制性多肽、光動力治療劑、抗腫瘤劑或其組合。在一個具體實施方案中，該細胞毒性劑可以選自由抗代謝物和光動力治療劑組成的群組。

適合烷化劑的非限制性實例可以包括六甲密胺(altretamine)、苯佐替派(benzodopa)、白消安(busulfan)、卡鉑(carboplatin)、卡波醌(carboquone)、卡莫司汀(carmustine)(bcnu)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlomaphazine)、膽磷酰胺(cholophosphamide)、氯脲霉素(chlorozotocin)、順鉑(cisplatin)、環(huán)磷酰胺(cyclosphosphamide)、達卡巴嗪(dacarbazine)(dtic)、雌莫司汀(estramustine)、福莫司汀(fotemustine)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、英丙舒凡(improsulfan)、順鉑質(zhì)脂體(lipoplatin)、洛莫司汀(lomustine)(ccnu)、馬磷酰胺(mafosfamide)、甘露舒凡(mannosulfan)、氮芥(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥、美法侖(melphalan)、美妥替哌(meturedopa)、莫司汀(mustine)(氮芥)、二溴甘露醇(mitobronitol)、尼莫司汀(nimustine)、新恩比興(novembichin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、苯芥膽固醇(phenesterine)、哌泊舒凡(piposulfan)、潑尼莫司汀(prednimustine)、雷莫司汀(ranimustine)、賽特鉑(satraplatin)、司莫司汀(semustine)、替莫唑胺(temozolomide)、塞替派(thiotepa)、曲奧舒凡(treosulfan)、三亞胺醌(triaziquone)、曲他胺(triethylenemelamine)、三亞乙基磷酰胺(triethylenephosphoramide，tepa)、三亞乙基硫代磷酰胺(塞替派)、三羥甲基三聚氰胺、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracilmustard)及烏瑞替哌(uredopa)。

適合抗腫瘤抗生素的非限制性實例可以包括阿克拉霉素(aclacinomysin)、阿柔比星(aclarubicin)、放線菌素(actinomycins)、阿霉素(adriamycin)、奧瑞他汀(aurostatin)(例如，單甲基奧瑞他汀e(monomethylauristatine))、安曲霉素(authramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycins)、放線菌素c(cactinomycin)、刺孢霉素(calicheamicin)、卡拉比星(carabicin)、卡諾霉素(caminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycins)、放線菌素d(dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-l-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、環(huán)氧霉素(epoxomicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素(mitomycins)、米拉霉素(mithramycin)、霉酚酸(mycophenolicacid)、諾拉霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、普卡霉素(plicamycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌羅霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、司帕霉素(sparsomycin)、鏈黑霉素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、戊柔比星(valrubicin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)及佐柔比星(zorubicin)。

適合抗細胞骨架劑的非限制性實例可以包括卡巴他賽(cabazitaxel)、秋水仙堿(colchicines)、秋水仙胺(demecolcine)、多西他賽(docetaxel)、艾普塞隆(epothilones)、伊沙匹隆(ixabepilone)、大分子霉素(macromycin)、高三尖杉酯堿(omacetaxinemepesuccinate)、沃塔紫杉醇(ortataxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)(例如dha-太平洋紫杉醇)、紫杉烷(taxane)、特斯紫杉醇(tesetaxel)、長春堿(vinblastine)、長春新堿(vincristine)、長春地辛(vindesine)及長春瑞濱(vinorelbine)。

適合拓撲異構(gòu)酶抑制劑可以包括但不限于，安吖啶(amsacrine)、依托泊苷(etoposide)(vp-16)、伊立替康(irinotecan)、米托蒽醌(mitoxantrone)、rfs2000、替尼泊苷(teniposide)及托泊替康(topotecan)。

適合抗激素劑的非限制性實例可以包括氨魯米特(aminoglutethimide)、抗雌激素(antiestrogen)、芳香化酶抑制性4(5)-咪唑、比卡魯胺(bicalutamide)、非那雄胺(finasteride)、氟他胺(flutamide)、氟維司群(fluvestrant)、戈舍瑞林(goserelin)、4-羥基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)、那洛昔芬(keoxifene)、亮丙瑞林(leuprolide)、ly117018、米托坦(mitotane)、尼魯米特(nilutamide)、奧那司酮(onapristone)、雷洛昔芬(raloxifene)、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)及曲洛司坦(trilostane)。

靶向性治療劑的實例可以包括但不限于，單克隆抗體，如阿侖珠單抗(alemtuzumab)、卡妥莫單抗(cartumaxomab)、依決洛單抗(edrecolomab)、依帕珠單抗(epratuzumab)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)、吉妥珠單抗奧佐米星(gemtuzumabozogamicin)、吉妥木單抗維多汀(glembatumumabvedotin)、替伊莫單抗(ibritumomabtiuxetan)、瑞妥昔(reditux)、利妥昔單抗(rimximab)、托西莫單抗(tositumomab)及曲妥珠單抗(trastuzumab)；蛋白激酶抑制劑，如貝伐珠單抗(bevacizumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、克唑替尼(crizonib)、達沙替尼(dasatinib)、厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、伊馬替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、莫立替尼(mubritinib)、尼羅替尼(nilotinib)、帕木單抗(panitumumab)、帕唑帕尼(pazopanib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、托西尼布(toceranib)及凡德他尼(vandetanib)。

血管生成抑制劑的非限制性實例可以包括血管抑素(angiostatin)、貝伐珠單抗、地尼白介素(denileukindiftitox)、內(nèi)皮抑素(endostatin)、依維莫司(everolimus)、染料木黃酮(genistein)、干擾素α(interferonalpha)、白細胞介素-2(interleukin-2)、白細胞介素-12(interleukin-12)、帕唑帕尼、培加尼布(pegaptanib)、雷珠單抗(ranibizumab)、雷帕霉素(rapamycin)(西羅莫司(sirolimus))、坦西莫司(temsirolimus)及沙利度胺(thalidomide)。

生長抑制性多肽的非限制性實例可以包括硼替佐米(bortazomib)、促紅細胞生成素、白細胞介素(例如il-1、il-2、il-3、il-6)、白血病抑制因子、干擾素、羅米地辛(romidepsin)、血小板生成素(thrombopoietin)、tnf-α、cd30配體、4-1bb配體及apo-1配體。

其它抗腫瘤劑可以包括阿那格雷(anagrelide)、三氧化二砷、門冬酰胺酶、貝沙羅汀(bexarotene)、溴匹立明(bropirimine)、塞來昔布(celecoxib)、以化學方式連接的fab、乙丙昔羅(efaproxiral)、依托格魯(etoglucid)、鐵銹醇(ferruginol)、羅尼達胺(lonidamide)、馬索羅酚(masoprocol)、米替福新(miltefosine)、米托胍腙(mitoguazone)、他侖帕奈(talapanel)、曲貝替定(trabectedin)及伏立諾他(vorinostat)。

在某些實施方案中，細胞毒性劑是光動力治療劑。光動力治療劑的非限制性實例可以包括氨基乙酰丙酸、氨基乙酰丙酸甲酯、類視黃醇(阿利維甲酸(alitretinon)、他米巴羅汀(tamibarotene)、維甲酸(tretinoin))及替莫泊芬(temoporfin)。在一個具體實施方案中，光動力治療劑是氨基乙酰丙酸。

在一個具體實施方案中，細胞毒性劑是抗代謝物。適合抗代謝物可以包括但不限于，氨基蝶呤(aminopterin)、安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、8-氮雜鳥嘌呤、6-氮雜尿苷、卡培他濱(capecitabine)、卡莫氟(carmofur)(1-己基氨甲?；?5-氟尿嘧啶)、克拉屈濱(cladribine)、氯法拉濱(clofarabine)、阿糖胞苷(cytarabine)(胞嘧啶阿拉伯糖苷(ara-c))、地西他濱(decitabine)、二甲葉酸(denopterin)、雙脫氧尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氮尿苷(floxuridine)、氟達拉濱(fludarabine)、5-氟尿嘧啶、吉西他賓(gemcitabine)、羥基脲、亞葉酸、6-巰基嘌呤、甲氨蝶呤(methotrexate)、萘福昔定(nafoxidine)、奈拉濱(nelarabine)、奧利默森(oblimersen)、培美曲塞(pemetrexed)、蝶羅呤(pteropterin)、雷替曲塞(raltitrexed)、替加氟(tegofur)、噻唑呋林(tiazofurin)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤及三甲曲沙(trimetrexate)。在一個具體實施方案中，抗代謝物是5-氟尿嘧啶(5-fu)。5-fu是一種作為嘧啶類似物的藥物，可用于治療癌癥。它是一種自殺抑制劑并且通過不可逆地抑制胸苷酸合成酶起作用。

一般來說，細胞毒性劑的劑型是乳膏或表面溶液。不過，也涵蓋其它適于表面施用的細胞毒性劑劑型。適于表面施用的藥物組合物可以被配制為油膏、乳膏、混懸液、洗液、散劑、溶液、糊劑、凝膠、噴霧劑、氣霧劑、油或敷藥膏形式。表面施用還可以涉及使用透皮施用，如透皮貼片或離子導入裝置。在一個具體實施方案中，該藥物組合物是以表面油膏或乳膏形式施用。

細胞毒性劑的劑量可以取決于待治療的疾病或病癥和/或待治療的受試者的年齡和狀況而變化。在向受試者施用包含細胞毒性劑和tslp誘導劑的組合物的實施方案中，該組合物中細胞毒性劑的濃度可以是約0.01％至約25％，或約0.1％至約10％，或更優(yōu)選是約0.5％至約5％。舉例來說，該組合物中細胞毒性劑的濃度可以是約0.1％、約0.2％、約0.3％、約0.4％、約0.5％、約0.6％、約0.7％、約0.8％、約0.9％、約1％、約1.5％、約2％、約2.5％、約3％、約3.5％、約4％、約4.5％、約5％、約5.5％、約6％、約6.5％、約7％、約7.5％、約8％、約8.5％、約9％、約9.5％或約10％?；蛘?，該組合物中細胞毒性劑的濃度可以是約10％、約11％、約12％、約13％、約14％、約15％、約16％、約17％、約18％、約19％、約20％、約21％、約22％、約23％、約24％或約25％。在某些實施方案中，該組合物中細胞毒性劑的濃度可以是約0.5％、約1％、約2％、約2.5％或約5％。在另一實施方案中，該組合物中細胞毒性劑的濃度是約2％至約5％。在一個具體實施方案中，該組合物中細胞毒性劑的濃度是約2.5％。在又另一實施方案中，該組合物中細胞毒性劑的濃度是約5％。

在某些實施方案中，細胞毒性劑是氨基乙酰丙酸。氨基乙酰丙酸的劑量可以取決于待治療的疾病或病癥和/或待治療的受試者的年齡和狀況而變化。在向受試者施用包含氨基乙酰丙酸和tslp誘導劑的組合物的實施方案中，該組合物中氨基乙酰丙酸的濃度可以是約10％至約25％，或更優(yōu)選是約15％至約20％。舉例來說，該組合物中氨基乙酰丙酸的濃度可以是約10％、約11％、約12％、約13％、約14％、約15％、約16％、約17％、約18％、約19％、約20％、約21％、約22％、約23％、約24％或約25％。在某些實施方案中，該組合物中氨基乙酰丙酸的濃度可以是約18％至約22％。在一個實施方案中，該組合物中氨基乙酰丙酸的濃度是約8％至約12％。在一個具體實施方案中，該組合物中氨基乙酰丙酸的濃度是約10％。在另一實施方案中，該組合物中氨基乙酰丙酸的濃度是約20％。

在一個具體實施方案中，細胞毒性劑是5-fu。5-fu的劑量可以取決于待治療的疾病或病癥和/或待治療的受試者的年齡和狀況而變化。在向受試者施用包含5-fu和tslp誘導劑的組合物的實施方案中，該組合物中5-fu的濃度可以是約0.1％至約10％，或更優(yōu)選是約0.5％至約5％。舉例來說，該組合物中5-fu的濃度可以是約0.1％、約0.2％、約0.3％、約0.4％、約0.5％、約0.6％、約0.7％、約0.8％、約0.9％、約1％、約2％、約3％、約4％、約5％、約6％、約7％、約8％、約9％、約10％。在某些實施方案中，該組合物中5-fu的濃度可以是約0.5％、約1％、約2％、約2.5％或約5％。在一個實施方案中，該組合物中5-fu的濃度是約2％至約5％。在一個具體實施方案中，該組合物中5-fu的濃度是約2.5％。在另一實施方案中，該組合物中5-fu的濃度是約5％。

(b)胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素(tslp)誘導劑

如本文所使用，“tslp誘導劑”是能夠誘導胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素(tslp)的任何化合物。tslp是屬于白細胞介素-7(il-7)細胞因子家族的上皮細胞源性細胞因子。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，tslp在皮膚中通過募集cd4+th2細胞對皮膚中設(shè)置免疫監(jiān)視而充當有效抗腫瘤細胞因子。用于確定一種化合物是否誘導tslp的方法是本領(lǐng)域中已知的。舉例來說，tslp核酸表達、tslp蛋白質(zhì)表達或tslp活性可以如以下在部分i(b)i、ii、iii中的詳細描述進行測量。tslp誘導劑的非限制性實例包括維生素d類似物、聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚(i：c)及其它tlr3配體)、fsl-1(和其它tlr2-tlr6配體)、鞭毛蛋白(及其它tlr5配體)、β2-腎上腺素受體激動劑、camp升高劑(例如forskolin)、脂肪酸(庚酸、辛酸、壬酸及癸酸)、二甲苯、1，2，4-三甲基苯、12-o-十四烷?；鸩ù?13-乙酸酯(tpa，十四烷酰基佛波醇乙酸酯及佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(pma))、鄰苯二甲酸二丁酯(dbp)及鄰苯二甲酸二異壬酯(dinp)。

在一個具體實施方案中，tslp誘導劑可以是維生素d或其類似物。維生素d是指一組脂溶性開環(huán)類固醇。開環(huán)類固醇與類固醇結(jié)構(gòu)極其類似，不過典型的四個類固醇環(huán)的兩個b環(huán)碳原子未聯(lián)接，而在類固醇中是聯(lián)接的?；钚跃S生素d或固化三醇是式(i)的化合物：

維生素d3，又稱膽骨化醇，是維生素d的一種形式并且當前驅(qū)分子7-脫氫膽固醇吸收光能時在動物的皮膚中產(chǎn)生。維生素d3或膽骨化醇是式(ii)的化合物：

維生素d的結(jié)構(gòu)改變的衍生物可以稱為維生素d類似物。相較于未修飾形式，維生素d類似物可以被修飾成改善生物利用率、溶解性，具有改善的穩(wěn)定性和/或處理特性。也涵蓋維生素d類似物的前藥。能夠結(jié)合至維生素d受體并且誘導胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素(tslp)的任何維生素d類似物都可以適用于本發(fā)明的組合物。維生素d類似物有許多，并且是熟練技術(shù)人員所了解的。適合維生素d類似物的非限制性實例包括1,25-(oh)2d3(骨化三醇)、26,27-ffi-1，25-(oh)2d3(st-630)、lα-(oh)d2、lα-(oh)d3、1,24-(oh)2d3(tv-02)、22-氧雜骨化三醇(oct)、卡泊三醇(mc903)、1，25-(oh)2-16-亞基-23-炔-d3(ro23-7553)、eb1089、ed-71、pri-2191、pri-2205、膽骨化醇、麥角鈣化醇、鈣化醇、calcijex、骨化三醇、度骨化醇(doxercalciferol)、hectorol、帕立骨化醇(paricalcitol)、rocaltrol、daivonex及zemplar。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“類似物”意圖包括合成類似物以及維生素d代謝物。在一個具體實施方案中，維生素d類似物是卡泊三醇?？ú慈?calcipotriol/calcipotriene/calcitrene)或是式(iii)的化合物：

一般來說，tslp誘導劑的劑型是乳膏、油膏或表面溶液。不過，也涵蓋其它適于表面施用的tslp誘導劑劑型。適于表面施用的藥物組合物可以被配制為油膏、乳膏、混懸液、洗液、散劑、溶液、糊劑、凝膠、噴霧劑、氣霧劑、油或敷藥膏形式。表面施用還可以涉及使用透皮施用，如透皮貼片或離子導入裝置。在一些實施方案中，該藥物組合物是以表面油膏或乳膏形式施用。

tslp誘導劑的劑量可以取決于待治療的疾病或病癥和/或待治療的受試者的年齡和狀況而變化。在向受試者施用包含細胞毒性劑和tslp誘導劑的組合物的實施方案中，該組合物中tslp誘導劑的濃度可以是約0.001％至約20％、約0.001％至約10％、約0.001％至約1％、約0.001％至約0.1％，或更優(yōu)選是約0.001％至約0.01％。舉例來說，該組合物中tslp誘導劑的濃度可以是約0.001％、約0.002％、約0.003％、約0.004％、約0.005％、約0.006％、約0.007％、約0.008％、約0.009％、約0.01％、約0.02％、約0.03％、約0.04％、約0.05％、約0.06％、約0.07％、約0.08％、約0.09％、約0.1％、約0.2％、約0.3％、約0.4％、約0.5％、約0.6％、約0.7％、約0.8％、約0.9％或約1.0％。在一個示例性實施方案中，該組合物中tslp誘導劑的濃度是約0.002％至約0.005％。在另一示例性實施方案中，該組合物中tslp誘導劑的濃度是約0.0025％。在又另一示例性實施方案中，該組合物中tslp誘導劑的濃度是約0.005％。

在一個具體實施方案中，tslp誘導劑是維生素d類似物。維生素d類似物的劑量可以取決于待治療的疾病或病癥和/或待治療的受試者的年齡和狀況而變化。在向受試者施用包含5-fu和維生素d類似物的組合物的實施方案中，該組合物中維生素d類似物的濃度可以是約0.001％至約0.1％，或更優(yōu)選是約0.001％至約0.01％。舉例來說，該組合物中維生素d類似物的濃度可以是約0.001％、約0.002％、約0.003％、約0.004％、約0.005％、約0.006％、約0.007％、約0.008％、約0.009％、約0.01％、約0.02％、約0.03％、約0.04％、約0.05％、約0.06％、約0.07％、約0.08％、約0.09％、約0.1％。在一個示例性實施方案中，該組合物中維生素d類似物的濃度是約0.002％至約0.005％。在另一個示例性實施方案中，該組合物中維生素d類似物的濃度是約0.0025％。在又另一個示例性實施方案中，該組合物中維生素d類似物的濃度是約0.005％。

i.tslp核酸表達

在一個實施方案中，可以測量tslp核酸表達以鑒別誘導tslp的化合物。舉例來說，當相對于未處理對照物，tslp核酸表達在化合物存在下增加時，該化合物誘導tslp。在一個具體實施方案中，可以測量tslpmrna以鑒別誘導tslp的化合物。

用于評估細胞中核酸表達量的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的評估核酸表達量的任何適合方法都涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如本文所使用，術(shù)語“核酸表達量”或“核酸表達水平”是指可測量的核酸表達水平，如但不限于，表達的信使rna(mrna)轉(zhuǎn)錄物或者mrna的特定變體或其它部分的水平、核酸的酶活性或其它活性，及特定代謝物的水平。術(shù)語“核酸”包括dna和rna并且可以是雙股或單股的。評估核酸表達量的適合方法的非限制性實例可以包括陣列法，如微陣列；pcr，如rt-pcr(包括定量rt-pcr)；核酸酶保護陣列；及northern印跡分析。在一個具體實施方案中，測定目標核酸的表達量部分地包括測量目標核酸mrna表達水平。

在一個實施方案中，可以使用陣列，如微陣列測定核酸表達量。使用核酸微陣列的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的。舉例來說，可以在陣列中使用與目標基因的表達產(chǎn)物互補或可雜交的核酸探針。術(shù)語“雜交”或“可雜交”是指與互補核酸的序列特異性非共價結(jié)合相互作用。在一個優(yōu)選實施方案中，雜交是在高嚴格度條件下進行。促進雜交的適當嚴格度條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，或者可以見于currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，n.y.(1989)，6.3.16.3.6。如本文所使用，術(shù)語“探針”是指將與核酸目標序列雜交的核酸序列。在一個實施例中，探針與核酸的rna產(chǎn)物或其互補核酸序列雜交。探針的長度取決于雜交條件以及探針的序列和核酸目標序列。在一個實施方案中，探針是至少8、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、400、500或更多個核苷酸長度。

在另一實施方案中，可以使用pcr測定核酸表達量。pcr方法是本領(lǐng)域中眾所周知的，并且可以包括定量pcr、半定量pcr、多重pcr或其任何組合。確切地說，可以使用定量rt-pcr測定核酸表達量。進行定量rt-pcr的方法是本領(lǐng)域中常用的。在此類實施方案中，用于定量rt-pcr的引物可以包含目標基因的正向和反向引物。如本文所使用，術(shù)語“引物”是指當處于誘導(例如在核苷酸和如dna聚合酶等誘導劑存在下及在適合溫度和ph下)合成與核酸股互補的引物延伸產(chǎn)物的條件下時能夠用作合成點的以純化的限制性消化物天然存在或以合成方式產(chǎn)生的核酸序列。引物必須足夠長以在誘導劑存在下引發(fā)所希望延伸產(chǎn)物的合成。引物的確切長度將取決于多種因素，包括溫度、印務(wù)序列及所用方法。引物典型地含有15-25個或更多個核苷酸，不過其可以含有更少或更多個核苷酸。測定引物的適當長度所涉及的因素是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員易于了解的。

核酸表達量可以通過測量核酸序列的整個mrna轉(zhuǎn)錄物或測量核酸序列的一部分mrna轉(zhuǎn)錄物來測量。舉例來說，如果利用核酸陣列測量mrna表達量，則該陣列可以包含針對所關(guān)注核酸序列的一部分mrna的探針，或該陣列可以包含針對所關(guān)注核酸序列的全部mrna的探針。類似地，在pcr反應(yīng)中，引物可以被設(shè)計成擴增所關(guān)注核酸序列的整個cdna序列，或一部分cdna序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認識到，可以使用超過一組引物來擴增所關(guān)注核酸序列的整個cdna或一部分cdna。設(shè)計引物的方法是本領(lǐng)域中已知的。從生物樣品中提取rna的方法是本領(lǐng)域中已知的。

表達水平可以或可以不歸一化為對照核酸水平。此類對照核酸不應(yīng)與本發(fā)明的mrna核苷酸序列特異性雜交。這允許在不同情形執(zhí)行的分析之間進行比較。

ii.tslp蛋白質(zhì)表達

在另一個實施方案中，可以測量tslp蛋白質(zhì)表達以鑒別誘導tslp的化合物。舉例來說，當相對于未處理對照物，tslp蛋白質(zhì)表達在化合物存在下增加時，該化合物誘導tslp。在一個具體實施方案中，tslp蛋白質(zhì)表達可以使用免疫印跡法測量。在另一具體實施方案中，tslp蛋白質(zhì)表達可以使用免疫熒光染色法測量。

用于評估細胞中蛋白質(zhì)表達量的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的評估蛋白質(zhì)表達量的任何適合方法都涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。評估蛋白質(zhì)表達量的適合方法的非限制性實例可以包括基于表位結(jié)合劑的方法及基于質(zhì)譜的方法。

在一些實施方案中，評估蛋白質(zhì)表達量的方法是質(zhì)譜法。通過利用質(zhì)量和電荷的固有特性，質(zhì)譜法(ms)可以解析并且確信地鑒別多種復雜的化合物，包括蛋白質(zhì)。傳統(tǒng)的定量ms使用了電噴霧電離(esi)，隨后串聯(lián)ms(ms/ms)(chen等人，2001；zhong等人，2001；wu等人，2000)，而開發(fā)的新穎定量方法使用了基質(zhì)輔助激光解吸/電離(maldi)，隨后飛行時間(tof)ms(bucknall等人，2002；mirgorodskaya等人，2000；gobom等人，2000)。根據(jù)本發(fā)明，可以使用質(zhì)譜法來了解由本發(fā)明的目標核酸編碼的蛋白質(zhì)的水平。

在一些實施方案中，該評估蛋白質(zhì)表達量的方法是基于表位結(jié)合劑的方法。如本文所使用，術(shù)語“表位結(jié)合劑”是指識別并且能夠結(jié)合至目標基因蛋白的抗體、適體、核酸、寡聚核酸、氨基酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、代謝物、小分子或其片段。核酸可以包括rna、dna及天然存在或合成產(chǎn)生的衍生物。

如本文所使用，術(shù)語“抗體”一般是指識別并且能夠結(jié)合至抗原表位的多肽或蛋白質(zhì)。如本文所使用，抗體可以是本領(lǐng)域中所了解的完整抗體，即，由兩個重鏈和兩個輕鏈組成的抗體，或者可以是具有抗原結(jié)合區(qū)的任何類抗體分子，并且包括但不限于，抗體片段，如fab’、fab、f(ab’)2、單結(jié)構(gòu)域抗體、fv及單鏈fv。術(shù)語抗體還指多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體及人源化抗體。有關(guān)制備和使用各種抗體類構(gòu)建體和片段的技術(shù)是本領(lǐng)域中眾所周知的。用于制備和表征抗體的方式也是本領(lǐng)域中眾所周知的(參見例如，antibodies：alaboratorymanual，coldspringharborlaboratory，1988；以引用的方式整體并入本文中)。

如本文所使用，術(shù)語“適體”是指就生物化學活性、分子識別或結(jié)合屬性來說具有有用的生物活性的多聚核苷酸，一般是rna或dna。通常，適體具有分子活性，如在特定表位(區(qū)域)處結(jié)合至目標分子。普遍認為，對結(jié)合至多肽具有特異性的適體可以通過體外進化法合成和/或鑒別。用于制備和表征適體的方式，包括體外進化法，是本領(lǐng)域中眾所周知的(參見例如us7,939,313；以引用的方式整體并入本文中)。

一般來說，評估蛋白質(zhì)表達量的基于表位結(jié)合劑的方法包括使包含多肽的樣品與對該多肽具有特異性的表位結(jié)合劑在允許該表位結(jié)合劑與該多肽之間形成復合物的條件下接觸?；诒砦唤Y(jié)合劑的方法可以在溶液中發(fā)生，或者表位結(jié)合劑或樣品可以固定于固體表面上。適合表面的非限制性實例包括微量滴定盤、試管、珠粒、樹脂及其它聚合物。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，表位結(jié)合劑可以通過多種方式附接至襯底?？梢韵群铣杀砦唤Y(jié)合劑，隨后附接至襯底，或者可以直接在襯底上合成表位結(jié)合劑。襯底和表位結(jié)合劑可以用隨后將附接這兩者的化學官能團衍生化。舉例來說，襯底可以用化學官能團，包括但不限于，氨基、羧基、氧代基或硫醇基衍生化。使用這些官能團，表位結(jié)合劑可以使用官能團直接附接，或使用連接子間接附接。

表位結(jié)合劑也可以非共價附接至襯底。舉例來說，可以制備生物素化的表位結(jié)合劑，該表位結(jié)合劑可以結(jié)合至共價涂布抗生蛋白鏈菌素的表面，引起附接?；蛘?，可以使用如光聚合和光刻術(shù)等技術(shù)在表面上合成表位結(jié)合劑。將表位結(jié)合劑附接至固體表面的額外方法及在襯底上合成生物分子的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的，即，來自affymetrix的vlsips技術(shù)(參見例如，美國專利號6,566,495以及rockett和dix，xenobiotica30(2)：155-177，二者以引用的方式整體并入本文中)。

使樣品與表位結(jié)合劑在有效條件下接觸足以允許形成復合物的時間段一般涉及將表位結(jié)合劑組合物添加至樣品中及溫育該混合物足夠長時間以使表位結(jié)合劑結(jié)合至存在的任何抗原。隨后，洗滌復合物并且可以通過本領(lǐng)域中眾所周知的任何方法檢測該復合物。檢測表位結(jié)合劑-多肽復合物的方法一般是基于檢測標記或標記物。如本文所使用，術(shù)語“標記”是指附接至表位結(jié)合劑或其它襯底材料的任何物質(zhì)，其中該物質(zhì)可以用檢測方法檢測。適合標記的非限制性實例包括發(fā)光分子、化學發(fā)光分子、熒光染料、熒光淬滅劑、顯色分子、放射性同位素、閃爍劑、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、蛋白質(zhì)a、蛋白質(zhì)g、抗體或其片段、聚組氨酸、ni2+、flag標簽、myc標簽、重金屬及酶(包括堿性磷酸酶、過氧化酶及熒光素酶)。基于標記或標記物的檢測來檢測表位結(jié)合劑-多肽復合物的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的。

在一些實施方案中，基于表位結(jié)合劑的方法是免疫分析法。免疫分析法可以用多種不同的形式執(zhí)行。一般來說，免疫分析法可以分成兩類：競爭性免疫分析和非競爭性免疫分析。在競爭性免疫分析中，樣品中未標記的分析物與標記的分析物競爭結(jié)合抗體。洗掉未結(jié)合的分析物并測量結(jié)合的分析物。在非競爭性免疫分析中，抗體而非分析物被標記。非競爭性免疫分析可以使用一種抗體(例如，捕獲抗體被標記)或超過一種抗體(例如，至少一種未標記的捕獲抗體及至少一種標記的“戴帽”或檢測抗體)。適合標記如上文所描述。

在一些實施方案中，基于表位結(jié)合劑的方法是elisa。在其它實施方案中，基于表位結(jié)合劑的方法是放射免疫分析法。在又其它實施方案中，基于表位結(jié)合劑的方法是免疫印跡法或western印跡法。在替代性實施方案中，基于表位結(jié)合劑的方法是陣列法。在另一實施方案中，基于表位結(jié)合劑的方法是流式細胞術(shù)。在不同實施方案中，基于表位結(jié)合劑的方法是免疫組織化學法(ihc)或免疫熒光法。ihc使用了抗體(或在免疫熒光法情況下是熒光標記的抗體)來檢測和定量完整組織樣品中的抗原。組織樣品可以是制備用于ihc或免疫熒光法研究的新鮮冷凍和/或福爾馬林固定、石蠟包埋(或塑料包埋的)組織塊。制備供ihc或免疫熒光法研究的組織塊的方法以及進行ihc或免疫熒光法的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的。

iii.tslp活性

在一個實施方案中，可以測量tslp活性以鑒別誘導tslp的化合物。tslp是屬于白細胞介素-7(il-7)細胞因子家族的上皮細胞源性細胞因子。tslp在皮膚中通過募集cd4+th2細胞而充當有效抗腫瘤細胞因子。因此，可以測量炎癥和/或th2細胞作為tslp活性的指示?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中的標準方法測量炎癥。舉例來說，可以使用ihc、免疫熒光法和/或rt-pcr目測測量炎癥。可以檢查的炎癥的非限制性標記物包括gr1、cd3、cd4、cd8、cd11b、cd11c、cd117、b220及ifnγ。當相對于未處理對照物，炎癥在化合物存在下增加時，該化合物誘導tslp。

在另一實施方案中，可以測量cd4+細胞和/或cd8+細胞作為tslp活性的指示。可以使用本領(lǐng)域中的標準方法測量cd4+細胞和/或cd8+細胞的量。舉例來說，可以使用流式細胞術(shù)測量cd4+細胞和/或cd8+細胞。當相對于未處理對照物，cd4+細胞和/或cd8+細胞的量在化合物存在下增加時，該化合物誘導tslp。

(c)組合物的組分

本公開還提供了藥物組合物。該藥物組合物包含作為活性成分的細胞毒性劑和tslp誘導劑，以及至少一種藥學上可接受的賦形劑。

藥學上可接受的賦形劑可以是稀釋劑、粘合劑、填充劑、緩沖劑、ph調(diào)節(jié)劑、崩解劑、分散劑、防腐劑、潤滑劑或著色劑。用于形成藥物組合物的賦形劑的量和類型可以根據(jù)制藥學的已知原理選擇。

在一個實施方案中，賦形劑可以是稀釋劑。稀釋劑可以是可壓縮(即，塑性變形)的或是磨蝕變脆的。適合的可壓縮稀釋劑的非限制性實例包括微晶纖維素(mcc)、纖維素衍生物、纖維素粉、纖維素酯(即，乙酸酯和丁酸酯混合酯)、乙基纖維素、甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、玉米淀粉、磷酸化玉米淀粉、預膠化玉米淀粉、大米淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉、淀粉-乳糖、淀粉-碳酸鈣、羥基乙酸淀粉鈉、葡萄糖、果糖、乳糖、乳糖單水合物、蔗糖、木糖、乳糖醇、甘露糖醇、麥芽糖醇、山梨糖醇、木糖醇、麥芽糊精及海藻糖。適合磨蝕變脆稀釋劑的非限制性實例包括磷酸氫二鈣(無水或二水合物)、磷酸三鈣、碳酸鈣及碳酸鎂。

在另一實施方案中，賦形劑可以是粘合劑。適合粘合劑包括但不限于，淀粉、預膠化淀粉、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯噁唑烷酮、聚乙烯醇、c12-c18脂肪酸醇、聚乙二醇、多元醇、糖、寡糖、多肽、寡肽及其組合。

在另一實施方案中，賦形劑可以是填充劑。適合填充劑包括但不限于，碳水化合物、無機化合物及聚乙烯吡咯烷酮。在非限制性實施例中，填充劑可以是硫酸鈣、二堿式和三堿式(di-andtri-basic)、碳酸鈣、碳酸鎂、微晶纖維素、磷酸二鈣、碳酸鎂、氧化鎂、硅酸鈣、滑石、改性淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇。

在又另一實施方案中，賦形劑可以是緩沖劑。適合緩沖劑的代表性實例包括但不限于，磷酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、tris緩沖劑及緩沖生理鹽水鹽(例如，tris緩沖生理鹽水或磷酸鹽緩沖生理鹽水)。

在各種實施方案中，賦形劑可以是ph調(diào)節(jié)劑。在非限制性實施例中，ph調(diào)節(jié)劑可以是碳酸鈉、碳酸氫鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸或磷酸。

在另一實施方案中，賦形劑可以是崩解劑。崩解劑可以是不起泡或起泡的。不起泡崩解劑的適合實例包括但不限于，淀粉，如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、其預膠化和改性淀粉；甜味劑；粘土，如膨潤土；微晶纖維素；海藻酸鹽；羥基乙酸淀粉鈉；樹膠，如瓊脂、瓜爾膠、刺槐豆膠、刺梧桐膠、果膠及黃芪膠。適合起泡崩解劑的非限制性實例包括碳酸氫鈉與檸檬酸的組合物以及碳酸氫鈉與酒石酸的組合。

在又另一實施方案中，賦形劑可以是分散劑或分散增強劑。適合分散劑可以包括但不限于，淀粉、海藻酸、聚乙烯吡咯烷酮、瓜爾膠、高嶺土、膨潤土、純化木質(zhì)纖維、羥基乙酸淀粉鈉、同晶型硅酸鹽及微晶纖維素。

在另一替代性實施方案中，賦形劑可以是防腐劑。適合防腐劑的非限制性實例包括抗氧化劑，如bha、bht、維生素a、維生素c、維生素e或棕櫚酸視黃酯、檸檬酸、檸檬酸鈉；螯合劑，如edta或egta；及抗微生物劑，如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇或苯酚。

在另一實施方案中，賦形劑可以是潤滑劑。適合潤滑劑的非限制性實例包括礦物質(zhì)，如滑石或硅石；及脂肪，如植物硬脂精、硬脂酸鎂或硬脂酸。

在又另一實施方案中，賦形劑可以是著色劑。適合的有色添加劑包括但不限于，食品、藥品及化妝品用色素(fd&c)、藥品和化妝品用色素(d&c)，或外用藥品和化妝品用色素(ext.d&c)。

以組合物的總重量計，組合物中賦形劑或賦形劑組分的重量份可以是約99％或更低，約97％或更低，約95％或更低，約90％或更低，約85％或更低，約80％或更低，約75％或更低，約70％或更低，約65％或更低，約60％或更低，約55％或更低，約50％或更低，約45％或更低，約40％或更低，約35％或更低，約30％或更低，約25％或更低，約20％或更低，約15％或更低，約10％或更低，約5％或更低，約2％，或約1％或更低。

該組合物可以被配制成各種劑型并且通過多種不同方式表面施用，這些方式將遞送治療有效量的活性成分。必要時，這些以劑量單位配制物形式表面施用的組合物可以含有常規(guī)無毒藥學上可接受的載劑、佐劑及媒劑。表面施用還可以涉及使用透皮施用，如透皮貼片或離子導入裝置。藥物配制物論述于例如gennaro，a.r.，remington′spharmaceuticalsciences，mackpublishingco.，easton，pa.(第18版，1995)，以及l(fā)iberman，h.a.和lachman，l.編輯，pharmaceuticaldosageforms，marceldekkerinc.，newyork，n.y.(1980)中。

對于表面(例如透皮或透粘膜)施用，制劑中一般包括適于透過屏障的滲透劑。適于表面施用的藥物組合物可以被配制為油膏、乳膏、混懸液、洗液、散劑、溶液、糊劑、凝膠、噴霧劑、氣霧劑或油形式。在一些實施方案中，該藥物組合物是以表面油膏或乳膏形式施用。當配制成油膏時，活性成分可以與石蠟或可與水混溶的油膏基質(zhì)一起使用?；蛘?，活性成分可以用水包油乳膏基質(zhì)或油包水基質(zhì)配制成乳膏形式。適于表面施用于眼部的藥物組合物包括滴眼液，其中將活性成分溶解或懸浮于適合載劑，尤其是水性溶劑中。適于在口中表面施用的藥物組合物包括錠劑、軟錠劑及漱口水。透粘膜施用可以通過使用鼻噴霧、氣霧劑噴霧、片劑或栓劑實現(xiàn)，而透皮施用可以經(jīng)由本領(lǐng)域中一般已知的油膏、敷藥膏、凝膠、貼片或乳膏實現(xiàn)。

在某些實施方案中，包含細胞毒性劑和tslp誘導劑的組合物被包封于適合媒劑中以幫助將化合物遞送至目標細胞、增加組合物穩(wěn)定性或使該組合物的潛在毒性減到最小。熟練技術(shù)人員應(yīng)理解，多種媒劑適于遞送本發(fā)明的組合物。適合結(jié)構(gòu)化流體遞送系統(tǒng)的非限制性實例可以包括納米粒子、脂質(zhì)體、微乳液、微胞、樹狀聚合物及其它含磷脂系統(tǒng)。將組合物并入遞送媒劑中的方法是本領(lǐng)域中已知的。

在一個替代性實施方案中，可以利用脂質(zhì)體遞送媒劑。取決于實施方案，就結(jié)構(gòu)和化學性質(zhì)來說，脂質(zhì)體適于遞送細胞毒性劑和tslp誘導劑。一般來說，脂質(zhì)體是具有磷脂雙層膜的球狀囊泡。脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙層可以與其它雙分子層(例如細胞膜)融合，由此將脂質(zhì)體的內(nèi)含物遞送到細胞。以此方式，細胞毒性劑和tslp誘導劑可以通過包封于與目標細胞膜融合的脂質(zhì)體中來選擇性遞送到細胞。

脂質(zhì)體可以包含烴鏈長度不同的多種不同類型的磷脂。磷脂一般包含通過甘油膦酸酯連接至多個極性基團之一的兩個脂肪酸。適合磷脂包括磷脂酸(pa)、磷脂酰絲氨酸(ps)、磷脂酰肌醇(pi)、磷脂酰甘油(pg)、二磷脂酰甘油(dpg)、磷脂酰膽堿(pc)及磷脂酰乙醇胺(pe)。包含磷脂的脂肪酸鏈可以是約6至約26個碳原子長度，并且脂質(zhì)鏈可以是飽和或不飽和的。適合脂肪酸鏈包括(括號中提供常用名)正十二烷酸酯(月桂酸酯)、正十四烷酸酯(肉豆蔻酸酯)、正十六烷酸酯(棕櫚酸酯)、正十八烷酸酯(硬脂酸酯)、正二十烷酸酯(花生酸酯)、正二十二烷酸酯(山崳酸酯)、正二十四烷酸酯(木蠟酸酯)、順-9-十六碳烯酸酯(棕櫚油酸酯)、順-9-十八烷酸酯(油酸酯)、順，順-9，12-十八碳二烯酸酯(亞油酸酯)、全順式-9，12，15-十八碳三烯酸酯(亞麻酸酯)及全順式-5，8，11，14-二十碳四烯酸酯(花生四烯酸酯)。磷脂的兩個脂肪酸鏈可以是相同或不同的?？山邮艿牧字ǘ王；鵳s、二油?；鵳c、二硬脂?；鵳s、二硬脂?；鵳c、二肉豆蔻?；鵳s、二肉豆蔻?；鵳c、二棕櫚酰基pg、硬脂酰基、油?；鵳s、棕櫚?；営王；鵳s等。

磷脂可以來自任何天然來源，并因此可以包含磷脂混合物。舉例來說，蛋黃富含pc、pg及pe，大豆含有pc、pe、pi及pa，并且動物腦或脊髓富含ps。磷脂也可以來源于合成來源?？梢允褂脗€別磷脂比率不同的磷脂混合物。不同磷脂的混合物可以產(chǎn)生具有有益活性或活性特性穩(wěn)定性的脂質(zhì)體組合物。以上提到的磷脂可以按最佳比率與陽離子型脂質(zhì)混合，如n-(1-(2，3-二油?；趸?丙基)-n，n，n-三甲基氯化銨、1，1’-二-十八烷基-3，3，3’，3’-四甲基吲哚菁高氯酸鹽、3，3’-二庚基氧化碳菁碘化物、1，1’-二-十二烷基-3，3，3’，3’-四甲基吲哚菁高氯酸鹽、1，1’-二油酰基-3，3，3’，3’-四甲基吲哚菁甲烷磺酸鹽、n-4-(二亞油?；被揭蚁┗?-n-甲基碘化吡啶或1，1，-二亞油酰基-3，3，3’，3’-四甲基吲哚菁高氯酸鹽。

脂質(zhì)體可以任選地包含鞘磷脂，其中鞘氨醇是甘油的結(jié)構(gòu)對應(yīng)物以及磷脂酰甘油或膽固醇(動物細胞膜的主要組分)的脂肪酸之一。脂質(zhì)體可以任選含有聚乙二醇化脂質(zhì)，這些脂質(zhì)是共價連接至聚乙二醇(peg)聚合物的脂質(zhì)。peg的大小可以在約500至約10,000道爾頓范圍內(nèi)。

脂質(zhì)體可以另外包含適合溶劑。該溶劑可以是有機溶劑或無機溶劑。適合溶劑包括但不限于，二甲亞砜(dmso)、甲基吡咯烷酮、n-甲基吡咯烷酮、乙腈、醇、二甲基甲酰胺、四氫呋喃或其組合。

帶有細胞毒性劑和tslp誘導劑的脂質(zhì)體可以利用例如美國專利號4,241,046、4,394,448、4,529,561、4,755,388、4,828,837、4,925,661、4,954,345、4,957,735、5,043,164、5,064,655、5,077,211及5,264,618中詳述的制備供藥物遞送的脂質(zhì)體的任何已知方法制備，所述專利的公開內(nèi)容以引用的方式整體并入本文中。舉例來說，可以通過在水性溶液聲波處理脂質(zhì)、溶劑注入、脂質(zhì)水合、逆相蒸發(fā)或利用反復地冷凍和解凍進行的冷凍干燥來制備脂質(zhì)體。在一個優(yōu)選實施方案中，脂質(zhì)體是通過聲波處理形成。脂質(zhì)體可以是多層的，像洋蔥一樣具有許多層，或者是單層的。脂質(zhì)體可以較大或較小。連續(xù)高剪切力聲波處理往往會形成較小的單層脂質(zhì)體。

普通技術(shù)人員應(yīng)顯而易見，管理脂質(zhì)體形成的所有參數(shù)都可以變化。這些參數(shù)包括但不限于，溫度、ph、甲硫氨酸化合物的濃度、脂質(zhì)的濃度和組成、多價陽離子的濃度、混合速率、溶劑的存在和濃度。

在另一實施方案中，本發(fā)明的組合物可以呈微乳液形式遞送至細胞。微乳液一般是包含水溶液、表面活性劑及“油”的澄清的熱力學穩(wěn)定溶液。在此情形中，“油”是超臨界流體相。表面活性劑保持在油-水界面處。多種表面活性劑適用于微乳液配制物中，包括本文中所描述或本領(lǐng)域另外已知的那些。適用于本發(fā)明中的水性微區(qū)一般具有約5nm至約100nm的特征性結(jié)構(gòu)尺寸。這種大小的聚集物是可見光的不良散射物，并因此，這些溶液是光學透明的。熟練技術(shù)人員應(yīng)理解，微乳液可以并且將具有多種不同的微觀結(jié)構(gòu)，包括球體、桿狀或盤狀聚集體。在一個實施方案中，該結(jié)構(gòu)可以是微胞，微胞是大體呈球形或圓柱形物體的最簡單的微乳液結(jié)構(gòu)。微胞如同水中的油滴，而反微胞如同油中的水滴。在一個替代性實施方案中，微乳液結(jié)構(gòu)是薄層狀的。它包含由表面活性劑層隔開的連續(xù)水層和油層。微乳液中的“油”最佳地包含磷脂。以上關(guān)于脂質(zhì)體詳述的任何磷脂都適于針對微乳液的實施方案。細胞毒性劑和tslp誘導劑可以通過本領(lǐng)域中一般已知的任何方法包封于微乳液中。

在又另一實施方案中，細胞毒性劑和tslp誘導劑可以通過樹狀大分子或樹狀聚合物遞送。一般來說，樹狀聚合物是一種分支樹狀分子，其中每個分支是在某一長度后分成兩個新分支(分子)的互連分子鏈。此分支持續(xù)到各分支(分子)緊密填充使得頂蓋層(canopy)形成球體。一般來說，樹狀聚合物的特性是由其表面處的官能團決定。舉例來說，親水性端基，如羧基，將典型地產(chǎn)生水溶性樹狀聚合物。或者，可以將磷脂并入樹狀聚合物的表面中以促進跨皮膚吸收。詳述的用于脂質(zhì)體實施方案中的任何磷脂都適用于樹狀聚合物實施方案中。本領(lǐng)域中一般已知的任何方法都可以用于制備樹狀聚合物并且將本發(fā)明的組合物包封于其中。舉例來說，可以利用一系列累接反應(yīng)步驟來制造樹狀聚合物，在這些步驟中，每一次額外的累接都會產(chǎn)生更高級的樹狀聚合物。因此，它們具有高度分支的規(guī)則3d結(jié)構(gòu)，以及大致均一的大小和形狀。此外，樹狀聚合物的最終大小典型地由合成期間使用的累接步驟的數(shù)目控制。多種樹狀聚合物大小適用于本發(fā)明中。一般來說，樹狀聚合物的大小可以在約1nm至約100nm范圍內(nèi)。

ii.方法

本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，包含細胞毒性劑和tslp誘導劑的組合物在治療癌前皮膚病變方面明顯比單獨細胞毒性劑有效，并且具有較短療程。此意外的發(fā)現(xiàn)還有一個附加益處，即，減少不良事件，由此潛在地改善患者的順應(yīng)性。tslp誘導劑用于誘導tslp的表達，由此調(diào)節(jié)皮膚中的免疫環(huán)境。細胞毒性劑誘導細胞中的細胞凋亡，由此釋放增大由tslp誘導劑引起的免疫反應(yīng)的抗原。

在一個方面，本公開涵蓋一種治療癌前皮膚病變的方法，該方法包括向所述病變表面施用包含細胞毒性劑和tslp誘導劑的組合物。在一個具體實施方案中，該組合物可以施用長達7天。在另一個實施方案中，本公開涵蓋一種防止癌前皮膚病變發(fā)生的方法，該方法包括向有發(fā)生癌前皮膚病變的風險的受試者表面施用包含細胞毒性劑和tslp誘導劑的組合物。在一個具體實施方案中，該組合物可以施用長達7天。如本文所使用，“癌前皮膚病變”是有可能發(fā)展成皮膚癌但不是癌癥的皮膚病變。癌前病變類型的非限制性實例可以包括光化性角化病(日光性角化病)、光化性唇炎(農(nóng)夫唇(farmer’slip))、皮角、痣(黑痣)及發(fā)育不良痣。在一個具體實施方案中，癌前皮膚病變是光化性角化病。鑒別癌前皮膚病變的方法是本領(lǐng)域中已知的。舉例來說，皮膚活檢或皮膚鏡可以鑒別癌前皮膚病變。有關(guān)皮膚鏡及其在診斷癌前皮膚病變方面的應(yīng)用的評述提供于giacomel等人，dermatolclin2013，31：649-678中，以引用的方式整體并入本文中。舉例來說，在皮膚鏡上，面部非色素性光化性角化病(ak)典型地顯示黃白色表面鱗屑和草莓狀圖案，后者由紅斑(粉紅至紅色)性假網(wǎng)絡(luò)包圍毛囊組成。毛囊開口被白色暈圈包圍并且被泛黃色的角栓填充，形成特有的靶樣外觀。此外，在毛囊的周圍通常會見到線性-波狀細小血管。另外，有時會在ak的面部見到盤狀小血管。也可以使用組織學來診斷癌前病變。舉例來說，在組織學水平上，光化性角化病(ak)是由發(fā)育不良定義并且由表現(xiàn)增大、不規(guī)則及染色質(zhì)過多的非典型性核的角化細胞組成。ak還展示無組織生長，由此破壞分化并產(chǎn)生保留有核的增厚的角質(zhì)層。為了對表皮發(fā)育不良的程度進行分層，推薦對ak采用三層分級量表，該量表同時用于評價子宮頸發(fā)育不良。表皮內(nèi)角化細胞瘤i(keratinocyticintraepidermalneoplasiai，kini)的組織學特征是局限于表皮下部三分之一處的基底角化細胞的細胞異型性。kinii顯示非典型性角化細胞占據(jù)表皮下部三分之二處，而kiniii顯示非典型性角化細胞遍布整個表皮；這后一階段相當于原位癌。ak中的局部表皮異型性反映分化程序部分破壞，而分化程序的更完全破壞伴隨原位scc(sccis)。kin分級標準評價了ak的宏觀和微觀特征。另外，臨床表現(xiàn)、患者病史(如uv暴露)及病變外觀可以鑒別癌前病變。舉例來說，光化性角化病(ak)典型地出現(xiàn)在日光照射的區(qū)域，如面部、光禿的頭皮、唇及手背。光化性角化病病變可以是平坦或略微突起的，通常直徑小于1英寸，質(zhì)地粗糙、干燥、有鱗屑并且類似于疣。大部分泛紅，但有一些會呈棕褐色、粉色、紅色和/或肉色。在一個具體實施方案中，本發(fā)明的方法可以用于治療kini、kinii和/或kiniii型ak病變。

在另一方面，本公開還涵蓋一種防止癌前病變轉(zhuǎn)變成皮膚癌的方法，該方法包括鑒別具有一個或多個癌前皮膚病變的受試者并且向癌前皮膚病變表面施用包含細胞毒性劑和tslp誘導劑的組合物，其中所述癌前皮膚病變的大小減小，由此防止發(fā)展成皮膚癌。在一個具體實施方案中，該組合物可以施用長達7天。在另一具體實施方案中，皮膚癌是非黑色素瘤型皮膚癌。未治療的光化性角化病會發(fā)展成鱗狀細胞癌(scc)。因此，本公開涵蓋一種防止光化性角化病病變轉(zhuǎn)變成鱗狀細胞癌的方法，該方法包括鑒別具有一個或多個光化性角化病病變的受試者并且向光化性角化病病變表面施用包含細胞毒性劑和tslp誘導劑的組合物，其中所述光化性角化病病變的大小減小，由此防止發(fā)展成鱗狀細胞癌。在一個具體實施方案中，該組合物可以施用長達7天。

在另一方面，本發(fā)明涵蓋一種治療非癌性皮膚病變的方法。該方法包括鑒別具有一個或多個非癌性皮膚病變的受試者并且向非癌性皮膚病變表面施用包含細胞毒性劑和tslp誘導劑的組合物，其中所述非癌性皮膚病變的大小減小。在一個具體實施方案中，該組合物可以施用長達10天。適合的非癌性皮膚病變可以包括疣和類似的皮膚病毒感染。疣的非限制性實例可以包括跖疣、皮膚疣、肛門生殖器疣、尋常疣、扁平疣、絲狀疣及與皮膚病毒感染有關(guān)的疣狀病變，如人乳頭瘤病毒和傳染性軟疣。診斷疣的方法是本領(lǐng)域中所知的。一般來說，熟練技術(shù)人員能夠通過檢查診斷疣。不過，也可以使用活檢診斷疣。疣可以出現(xiàn)在身體任何地方，不過面部、手、手指、腳、腿及生殖器最常見。疣可以看起來是粗糙、光滑、平坦、突起的，含有黑色“種子”，呈圓形、橢圓形，而且顏色比周圍皮膚淺或深。

在又另一方面，本發(fā)明涵蓋一種治療非黑色素瘤型皮膚癌的方法。該方法包括鑒別患有非黑色素瘤型皮膚癌的受試者，并且向非黑色素瘤型皮膚癌表面施用包含細胞毒性劑和tslp誘導劑的組合物，其中該非黑色素瘤型皮膚癌的大小減小。在一個具體實施方案中，該組合物可以施用長達10天。非黑色素瘤型皮膚癌類型的非限制性實例可以包括基底細胞癌、鱗狀細胞癌、bowen病、角化棘皮瘤、merkel細胞癌、皮膚淋巴瘤、kaposi肉瘤、皮膚附屬器腫瘤、皮脂腺癌及肉瘤。約80％的皮膚癌發(fā)生于基底細胞并且稱為基底細胞癌?；准毎┳铋L在頭頸部發(fā)生。它主要由日光照射引起或發(fā)生于在兒童期接受放射療法的人。這一類皮膚癌通常生長緩慢并且很少轉(zhuǎn)移(擴散)至身體其它部位。約20％的皮膚癌發(fā)生于鱗狀細胞并且稱為鱗狀細胞癌。這一類癌癥主要由日光照射引起，但它也可能出現(xiàn)在燒傷、化學品損傷或暴露于x射線的皮膚上。慢性炎癥性皮膚病、粘膜(口、鼻、肛門及女性的陰道內(nèi)襯的皮膚)及唇部位易患鱗狀細胞癌。鱗狀細胞癌很少轉(zhuǎn)移，但它擴散的可能性大于基底細胞癌。鑒別非黑色素瘤型皮膚癌的方法是本領(lǐng)域中已知的。一般來說，熟練技術(shù)人員能夠經(jīng)由檢查診斷非黑色素瘤型皮膚癌。不過，也可以使用活檢診斷非黑色素瘤型皮膚癌。

在又另一方面，本發(fā)明涵蓋一種治療黑色素瘤皮膚癌的方法。該方法包括鑒別患有黑色素瘤皮膚癌的受試者，并且向黑色素瘤皮膚癌表面施用包含細胞毒性劑和tslp誘導劑的組合物，其中該黑色素瘤皮膚癌的大小減小。在一個具體實施方案中，該組合物可以施用長達10天。當癌細胞在稱為黑素細胞的皮膚細胞中形成時，發(fā)生黑色素瘤。確切地說，本發(fā)明的方法可以用于治療原位黑色素瘤(mis)。mis又稱為0期黑色素瘤。在0期中，在表皮中發(fā)現(xiàn)異常黑素細胞。一般來說，mis僅影響皮膚頂層。這些異常黑素細胞可能變成癌癥并擴散至鄰近的正常組織中。診斷和鑒別黑色素瘤的方法是本領(lǐng)域中已知的。一般來說，可以基于家族史、患者病史、臨床表現(xiàn)，和/或針對大小、形狀或顏色改變，具有不規(guī)則邊界或邊緣，具有超過一種顏色、不對稱、發(fā)癢或滲液、出血或潰爛、色素沉積的皮膚或衛(wèi)星痣改變的痣的皮膚檢查活檢來診斷黑色素瘤。

施用本發(fā)明的組合物可以使病變大小相對于標準護理減小超過50％。舉例來說，施用本發(fā)明的組合物可以使病變大小相對于標準護理減小超過55％、超過60％、超過65％、超過70％、超過75％、超過80％、超過85％、超過90％、超過95％或100％。舉例來說，包含5-fu和維生素d類似物的組合物可以使病變大小相對于包含5-fu作為唯一活性劑的組合物減小超過50％。在一些實施方案中，施用包含5-fu和維生素d類似物的組合物可以使病變大小相對于包含5-fu作為唯一活性劑的組合物減小超過55％、超過60％、超過65％、超過70％、超過75％、超過80％、超過85％、超過90％、超過95％或100％。在病變大小減小100％的實施方案中，可以認為病變被清除。

本發(fā)明的方法可以使不良事件發(fā)生率和/或嚴重程度相對于在標準護理治療期間常見的不良事件發(fā)生率和/或嚴重程度有所降低。在表面使用細胞毒性劑期間的不良事件的非限制性實例包括：局部疼痛、瘙癢、發(fā)癢、燒灼感、刺痛、結(jié)痂、滲液、皮炎、光過敏、頭痛、失眠、易怒、皮疹、白細胞增多、血小板減少、出生缺陷、炎癥、流產(chǎn)、單純性皰疹、過敏性接觸性皮炎、毛細管擴張、色素過度沉著或色素沉著不足及瘢痕形成。確切地說，可以使發(fā)紅、起屑、結(jié)痂、發(fā)癢及燒灼感的發(fā)生率和/或嚴重程度相對于標準護理治療有所降低。舉例來說，可以使不良事件的發(fā)生率和/或嚴重程度相對于標準護理治療降低30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

(a)施用

在某些方面，可以向受試者施用治療有效量的本發(fā)明組合物。施用是使用標準有效技術(shù)執(zhí)行。在一個優(yōu)選實施方案中，表面施用組合物。本發(fā)明的組合物可以呈油膏、乳膏、混懸液、洗液、散劑、溶液、糊劑、凝膠、噴霧劑、氣霧劑、敷藥膏、貼片或油形式表面施用。在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物是以表面油膏或乳膏形式施用。

對于治療應(yīng)用，向受試者施用治療有效量的本發(fā)明組合物?！爸委熡行Я俊笔亲阋援a(chǎn)生可測量的反應(yīng)(例如，病變大小減小；病變數(shù)量減少；毒性降低和治療耐受性改善；tslp誘導；與病變有關(guān)的癥狀如發(fā)紅、起屑、結(jié)痂、發(fā)癢、燒灼感及變厚減輕；角化細胞分化和基因表達正?；?；具有適合屏障功能的表皮完整性的恢復；異常細胞增殖和炎癥的減少)的治療組合物的量。本發(fā)明的治療組合物中活性成分的實際劑量水平可以變化，以便施用在特定受試者中有效獲得希望的治療反應(yīng)的活性化合物量。所選劑量水平將取決于多種因素，包括治療組合物的活性、配方、施用途徑、與其它藥物或治療的組合、年齡、癌前病變、非黑色素瘤型皮膚癌、黑色素瘤皮膚癌、疣、癥狀和身體狀況，以及所治療的受試者的先前醫(yī)療史。在一些實施方案中，施用最低劑量，并在無劑量限制性毒性存在下遞增劑量。治療有效劑量的確定和調(diào)整，以及有關(guān)何時和如何作出此類調(diào)整的評價是醫(yī)學領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所了解的。

相對于疾病本身施用治療的時序及治療持續(xù)時間將由個別病例決定。治療可以在醫(yī)院或診所本身中開始，或在離開醫(yī)院之后或在去過門診之后一段時間開始。

在一個方面，施用本發(fā)明的組合物可以使治療持續(xù)時間相對于標準護理有所縮短。舉例來說，標準護理可以使每天兩次，持續(xù)2周。然而，申請人意外地發(fā)現(xiàn)，縮短治療持續(xù)時間會使病變大小相對于標準護理明顯減小。因此，治療持續(xù)時間可能不超過14天。舉例來說，治療持續(xù)時間可以是約13天、約12天、約10天、約9天、約8天、約7天、約6天、約5天、約4天、約3天、約2天或約1天。在某些實施方案中，治療持續(xù)時間可以是10天、7天、6天、5天、4天、3天或2天。在一個實施方案中，治療持續(xù)時間可以是至多7天。在另一實施方案中，治療持續(xù)時間可以在4天至6天之間。在一個具體實施方案中，治療持續(xù)時間可以是4天。在另一具體實施方案中，治療持續(xù)時間可以是6天。

標準護理的給藥頻率是每天兩次。因此，本發(fā)明組合物的給藥頻率可以是每天兩次。或者，預期可以改變給藥頻率。舉例來說，給藥頻率可以是每天一次、兩次或三次。增加給藥頻率可能引起治療持續(xù)時間縮短?；蛘?，減小給藥頻率可能引起治療持續(xù)時間增加。

(b)受試者

受試者可以是嚙齒動物、人類、家畜、寵物或動物園動物。在一個實施方案中，受試者可以是嚙齒動物，例如小鼠、大鼠、豚鼠等。在另一實施方案中，受試者可以是家畜。適合家畜的非限制性實例可以包括豬、牛、馬、山羊、綿羊、駱駝及羊駝。在又另一實施方案中，受試者可以是寵物。寵物的非限制性實例可以包括寵物，如狗、貓、兔及鳥。在又另一實施方案中，受試者可以是動物園動物。如本文所使用，“動物園動物”是指可以在動物園發(fā)現(xiàn)的動物。這些動物可以包括非人類靈長類動物、大型貓科動物、狼及熊。在一個優(yōu)選實施方案中，受試者是人類。

人類受試者可以是任何年齡。然而，由于黑色素瘤、非黑色素瘤型皮膚癌和癌前皮膚病變一般與年齡相關(guān)，故人類受試者可以是老年人類受試者。在一些實施方案中，人類受試者可以是約20歲、25歲、30歲、40歲、45歲、50歲、55歲、60歲、65歲、70歲、75歲、80歲、85歲、90歲、95歲或更大年齡。在一些優(yōu)選實施方案中，人類受試者是30歲或更大年齡。在其它優(yōu)選實施方案中，人類受試者是40歲或更大年齡。在其它優(yōu)選實施方案中，人類受試者是45歲或更大年齡。在又其它優(yōu)選實施方案中，人類受試者是50歲或更大年齡。在又其它優(yōu)選實施方案中，人類受試者是55歲或更大年齡。在其它優(yōu)選實施方案中，人類受試者是60歲或更大年齡。在又其它優(yōu)選實施方案中，人類受試者是65歲或更大年齡。在又其它優(yōu)選實施方案中，人類受試者是70歲或更大年齡。在其它優(yōu)選實施方案中，人類受試者是75歲或更大年齡。在又其它優(yōu)選實施方案中，人類受試者是80歲或更大年齡。在又其它優(yōu)選實施方案中，人類受試者是85歲或更大年齡。在又其它優(yōu)選實施方案中，人類受試者是90歲或更大年齡。

又另外，受試者可以是有發(fā)生癌前皮膚病變的風險的受試者。熟練技術(shù)人員將能夠確定有發(fā)生癌前皮膚病變的受試者。舉例來說，可以基于家族史、患者病史、臨床表現(xiàn)、皮膚檢查活檢、皮膚鏡、日光照射和/或皮膚暴露于化學品或x射線來確定有發(fā)生癌前皮膚病變的受試者。有風險的具體區(qū)域可以包括太陽照射的區(qū)域，如面部、光禿的頭皮、唇及手背。

實施例

包括以下實施例以展示本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，以下實施例中公開的技術(shù)表示發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在本發(fā)明實踐中良好起作用的方法，并因此可以被認為構(gòu)成其優(yōu)選的實踐模式。然而，依據(jù)本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，在不背離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的情況下，可以對所公開的具體實施方案進行許多修改，并且仍然獲得相同或類似的結(jié)果。

實施例1.用于評估卡泊三醇治療癌前皮膚病變的作用的臨床試驗.

目標：

本發(fā)明人假定，卡泊三醇可以用于在人類皮膚中產(chǎn)生抗腫瘤免疫環(huán)境，由此消除光化性角化病。因此，本發(fā)明人進行了臨床試驗來驗證此假說。該臨床試驗旨在確定卡泊三醇治療人類光化性角化病的治療潛力。卡泊三醇至少部分通過調(diào)節(jié)皮膚的免疫環(huán)境來發(fā)揮其抗腫瘤作用。因此，為了優(yōu)化攻擊皮膚腫瘤的免疫細胞的抗原暴露，將研究卡泊三醇增大當前診所中用于治療光化性角化病的表面用化學治療劑5-氟尿嘧啶的作用的能力。5-氟尿嘧啶對腫瘤細胞凋亡的誘導作用將釋放抗原，由此可以增大由卡泊三醇引起的免疫反應(yīng)。因此，將比較在連續(xù)4天每天兩次的治療期內(nèi)患有多處光化性角化病的患者對表面用卡泊三醇+5-氟尿嘧啶的反應(yīng)與對單獨5-氟尿嘧啶的反應(yīng)。治療組將基于光化性角化病病變的解剖部位(頭皮、面部、右上肢和左上肢)分組，以便進一步描繪這些治療的部位特異性作用。該研究的主要終點是比較表面用5-氟尿嘧啶+卡泊三醇與單獨5-氟尿嘧啶在治療患有多處光化性角化病的患者的四個解剖部位(頭皮、面部、右上肢和左上肢)中的每一個處的光化性角化病的功效。所關(guān)注的結(jié)果是在治療后8周時，在頭皮、面部、右上肢和左上肢上的目標治療部位中光化性角化病的數(shù)量自基線的變化百分比。該研究的次要終點包括：在治療后8周時，確定光化性角化病完全和部分(＞75％)清除；在4天的療程結(jié)束時，確定表面用5-氟尿嘧啶+卡泊三醇與單獨5-氟尿嘧啶在治療光化性角化病方面的毒性和耐受性；在4天的療程結(jié)束時，檢查在光化性角化病部位處卡泊三醇對角化細胞中tslp表達的誘導作用；在治療后8周時，確定四個解剖部位之間對表面用5-氟尿嘧啶+卡泊三醇與對單獨5-氟尿嘧啶的反應(yīng)的任何差異。

入選標準：

在這一隨機雙盲臨床試驗中，將患有光化性角化病的參與者隨機分配成接受5-fu+卡泊三醇(測試組)或5-fu+凡士林(對照組)表面制劑，每天兩次自施用，持續(xù)4天。

登記程序：

在這一隨機雙盲研究中，募集到132位光化性角化病患者，因為他們出現(xiàn)在washingtonuniversity的皮膚病門診。在wusm的皮膚病學臨床試驗單元(dermatologyclinicaltrialsunit)是美國知名的開發(fā)和參與臨床治療試驗的機構(gòu)。該臨床試驗單元源自于division的大型患者基地，該基地每年接待超過50,000患者。這些就診者中有15％是治療光化性角化病[11]。根據(jù)irb指導原則，滿足本研究的入選標準的超過50歲的患者參與本研究。如果自愿并且能夠參與，則使患者同意并基于治療的解剖部位登記進行研究。如果參與者有兩個或更多個合格的解剖部位，則由治療醫(yī)師選取一個作為主要解剖部位，而其它部位視為次要部位。主要解剖部位的指定按頭皮＞面部＞左上肢＞右上肢區(qū)分優(yōu)先次序。在所有情形中，參與者都接受一種藥物，參與者將該藥物施加于其受影響的所有部位以避免任何混淆。使用四個隨機藥物清單，每一主要解剖部位(頭皮、面部、右上肢和左上肢)各一個。

治療醫(yī)師選擇進行治療的主要和次要解剖部位(如適用)，記錄臨床上可見的光化性角化病的數(shù)量，在透明片上標記這些病變并分別拍攝治療區(qū)域的照片。參考關(guān)于主要解剖部位的隨機化清單隨機分配參與者接受5-fu+卡泊三醇(測試組)或5-fu+凡士林(對照組)表面用制劑。如果關(guān)于解剖部位的隨機化清單已滿(每個部位40個)，則醫(yī)師選取另一合格的解剖部位作為主要部位(如果存在的話)。從第一次就診的次日開始，連續(xù)4天，參與者每天兩次將研究藥物涂覆于所有其合格的治療區(qū)域。在初次就診時，向參與者無償提供表面用制劑。參與者被要求在第5天(即，最后一次用藥的次日)、第2周和第4周(推薦但非必需)及第8周返回進行隨訪。在每次隨訪時，針對任何刺激癥候(包括紅斑、結(jié)痂或潰瘍(使用紅斑量表，表2))評價治療的皮膚，并且在臨床上測定光化性角化病的數(shù)量并拍照。在最后一次就診時(8周)，在透明片上標記殘留的光化性角化病。在第2周和第4周時間點電話聯(lián)系未選擇參加第2周和/或第4周就診的任何參與者，詢問其治療的皮膚的情況、任何不良事件的存在、活檢部位的徹底愈合，并要求通過電子郵件(如果同意進行電子郵件通信)傳送照片。所有記錄都保存在上鎖的辦公室或設(shè)置密碼的計算機中，只有研究組的成員能夠接近。

研究/治療程序：

在初次就診時(第0天)，畫出合格光化性角化病治療區(qū)域的輪廓，計算病變數(shù)量，在透明片上標記，拍照并基于對應(yīng)參與者的主要解剖部位的隨機化清單指定研究藥物(圖1)。從第一次就診的次日開始，參與者將其指定藥物涂覆于所有其合格的解剖部位。告知參與者連續(xù)四天，一天兩次(早晨和就寢時)用手將薄薄一層藥物涂覆于受影響皮膚以覆蓋整個區(qū)域，并完全擦進皮膚中。在每次涂覆后，參與者應(yīng)徹底洗手。在4天治療期間，參與者應(yīng)避免暴露于天然或人造陽光(包括室內(nèi)日曬機、日光燈等)并且每天在早晨涂覆藥物之后使用spf50+防曬霜(向參與者提供防曬霜)。向參與者提供日記本以記錄其治療的時間和日期、防曬霜使用情況并記錄下任何副作用。參與者在第5天、第2周(可選)、第4周(可選)及第8周返回診所進行再評價。在每次就診時，由治療醫(yī)師在臨床上測定參與者的光化性角化病計數(shù)并拍照。在最后一次(第8周)就診時，在透明片上標記殘留的光化性角化病。另外，使用標準紅斑量表對其紅斑和刺激進行評價(表2；[12])。在這些時間點電話聯(lián)系未參加第2周和/或第4周就診的參與者以確定其治療皮膚的情況、活檢部位及任何不良事件的存在。要求參與者通過電子郵件(如果同意進行電子郵件通信)傳送其治療皮膚的照片。本研究的主要終點是在8周時每一解剖部位處光化性角化病總數(shù)相對于基線減少的百分比。為了證實卡泊三醇治療對tslp的誘導作用，在治療前后測量4mm的光化性角化病穿刺活檢組織中tslp的表達情況。治療醫(yī)師收集這些皮膚樣品并基于參與者獨有的三位數(shù)id(例如“201”)標記，以免影響其不知情狀況。使用標準方法處理這些組織以進行組織學分析。

藥細制備及儲存：將5-氟尿嘧啶5％表面用乳膏(efudex；taropharmaceuticalsu.s.a.inc.，hawthorne，ny)與卡泊三醇0.005％表面用油膏(calcitrene，calcipotriene，dovonex；taropharmaceuticals；測試組)或凡士林(對照組)以1∶1重量比混合。在皮膚病研究所的分部，根據(jù)usp795關(guān)于非無菌混配條件的指導方針，在sitemanncancercenterinvestigationaldrugpharmacy的監(jiān)督下混合這兩種藥物。另外，根據(jù)mo法規(guī)要求標記產(chǎn)品。5-fu+卡泊三醇和5-fu+凡士林容器用唯一的三位數(shù)代碼(例如“201”)標記。

每一個別研究藥物容器還將標記以下常規(guī)信息：參與者的研究id編號；短語“僅外用”；短語“在控制室溫15-25℃(59-77°f)下儲存”；短語“注意：新藥-僅限研究用；不適于眼用或陰道內(nèi)使用”；及短語“避免兒童接觸”。藥物將被儲存于washingtonuniversity皮膚病診所的控制室溫(15-25℃)的帶鎖櫥柜中。治療醫(yī)師對于容器的內(nèi)含物(用唯一的三位數(shù)代碼標記)不知情。

出于產(chǎn)品研發(fā)目的，可以增加組合乳膏中卡泊三醇的濃度以實現(xiàn)更高的抗腫瘤免疫反應(yīng)，但基于實驗數(shù)據(jù)，當前配制物中存在的5-fu的濃度(5％)是最佳的。

皮膚活檢：在治療前(第一次就診時)，利用4mm穿刺活檢程序?qū)γ娌?、頭皮或上肢的一個光化性角化病病變進行活檢。在4天的治療期之后(第5天就診時)，利用4mm穿刺活檢程序?qū)γ娌俊㈩^皮或上肢上經(jīng)過治療的光化性角化病進行活檢以便確定涂覆卡泊三醇對基因和蛋白質(zhì)表達的誘導作用。使用4mm穿刺活檢工具取下皮膚并用兩根可吸收縫合線閉合皮膚傷口。告知參與者在4天的治療期間應(yīng)避開“第0天”的活檢部位。將皮膚樣品分成兩半。一半用于rna制備，而另一半冷凍于oct介質(zhì)中或固定于甲醛介質(zhì)中，僅用研究id編號標記，并保持在-80℃的帶鎖冰箱或帶鎖辦公室中，以待日后處理用于常規(guī)h&e染色和免疫組織化學分析[13]。參與者接受口頭和書面?zhèn)谧o理介紹。參與者根據(jù)本程序的時間(推薦這些患者第5天就診進行第一次活檢；第2周就診進行另兩次活檢)在5-10天內(nèi)就診以確保傷口完全愈合，并治療任何可能的并發(fā)癥。

病變評估：通過臨床檢查評估所有光化性角化病并計數(shù)。臨床診斷標準包括日曬區(qū)域的變厚、起屑或結(jié)痂的粉紅色丘疹。在每次就診時利用照片記錄診斷和計數(shù)，并在第一次(第0天)和最后一次(第8周)就診時在透明片上標記。

結(jié)果：

參與者人數(shù)統(tǒng)計.

入選患者的數(shù)量是175位，進入并完整研究的數(shù)量是132位，并且基于其主要解剖部位進行的分配顯示于圖2中。年齡、性別及每一治療的解剖部位的藥物用量(克)顯示于表3中。就所列任何參數(shù)來說，測試組與對照組之間無顯著差異。

在每一解剖部位處光化性角化病數(shù)量減少的百分比.

在8周隨訪時，相較于標準護理治療(5-fu+凡士林)，連續(xù)四天每天兩次用5-fu+卡泊三醇組合治療引起光化性角化病(ak)的明顯較高清除率(對于所有解剖部位，p＜0.0001，studentt檢驗；rue：右上肢；lue：左上肢)(圖3)。統(tǒng)計分析詳情顯示于表4中。

不良事件.

紅斑是本研究中所觀察到的唯一不良事件，對應(yīng)于皮膚中免疫活化(即，炎癥)的水平。如緊接著在最后一次治療后(第5天)以及在停止治療后10天(第2周)所見，連續(xù)4天每天兩次用5-fu+卡泊三醇治療的參與者出現(xiàn)集中在光化性角化病部位周圍的明顯炎癥(圖4)?；诳ú慈颊T導免疫系統(tǒng)攻擊皮膚中的ak的假說，這一炎癥是所預期的。圖5中顯示每一治療的解剖部位紅斑評分是0分、1分和2分的參與者的百分比。應(yīng)注意，由于治療持續(xù)時間較短，故沒有紅斑評分是3分或4分的參與者，而這在連續(xù)2-3周每天兩次用5-fu治療(標準護理方案)的患者中較常見。

使用從光化性角化病(ak)部位收集的皮膚樣品確定5-fu+卡泊三醇針對ak的作用機制。

圖6顯示在治療前后蘇木精和伊紅(h&e)染色的ak切片。這些圖像顯示用5-fu+卡泊三醇治療的參與者在治療(tx)后真皮上層中的淋巴細胞主要積累于ak中。治療前后針對ak的免疫熒光染色也顯示，用5-fu+卡泊三醇治療的參與者在治療后ak中出現(xiàn)穩(wěn)固tslp表達，包括真皮-表皮連接區(qū)附近cd3+t細胞的積累。這些t細胞中大部分是cd4+t輔助細胞(插圖)。k14指代皮膚角質(zhì)細胞。

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