本發(fā)明通常涉及包封核酸納米粒組合物以及用于制備具有均勻的小粒度的包封核酸納米粒的方法和系統(tǒng)。發(fā)明背景向受治療者遞送生物活性劑(包括治療相關(guān)化合物)經(jīng)常由于化合物到達(dá)靶細(xì)胞或組織的困難而受到阻礙。具體而言，將許多生物活性劑運(yùn)輸?shù)交罴?xì)胞中受到細(xì)胞的復(fù)雜膜系統(tǒng)的高度限制。這些限制可導(dǎo)致需要使用比獲得結(jié)果所期望的那些高得多的濃度的生物活性劑，這增加了毒性作用和副作用的風(fēng)險(xiǎn)。一種解決該問(wèn)題的方法是利用特定的載體分子和載體組合物，它們被允許選擇性進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。脂質(zhì)載體、可生物降解的聚合物和各種綴合系統(tǒng)可用于改善生物活性劑向細(xì)胞的遞送。一類(lèi)特別難于遞送到細(xì)胞的生物活性劑是生物治療劑(包括核苷、核苷酸、聚核苷酸、核酸和衍生物，例如mRNA和RNAi劑)。通常，核酸在細(xì)胞或血漿中僅能在有限的時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定。RNA干擾、RNAi治療、mRNA治療、RNA藥物、反義治療和基因治療等的發(fā)展已經(jīng)增加了將活性核酸試劑引入細(xì)胞中的有效方式的需求。為此，對(duì)于能夠穩(wěn)定且遞送基于核酸的活性劑到細(xì)胞中的組合物是特別令人感興趣的。用于改善外源核酸向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的最充分研究的方法包括使用病毒載體或含陽(yáng)離子脂質(zhì)的制劑。病毒載體可用于將基因有效地傳遞到一些細(xì)胞類(lèi)型中，但是它們通常不能用于將化學(xué)合成的分子引入到細(xì)胞中。一種供選的方法是使用引入了陽(yáng)離子脂質(zhì)的遞送組合物，其在一個(gè)部分與生物活性劑相互作用病情在另一個(gè)部分與膜系統(tǒng)相互作用。據(jù)報(bào)道，這類(lèi)組合物根據(jù)組成和制備方法提供了脂質(zhì)體、膠束、脂質(zhì)復(fù)合物(lipoplexes)或脂質(zhì)納米粒(綜述參見(jiàn)Felgner,1990,AdvancedDrugDeliveryReviews,5,162-187；Felgner,1993,J.LiposomeRes.,3,3-16；Gallas,2013,Chem.Soc.Rev.,42,7983-7997；Falsini,2013,J.Med.Chem.dx.doi.org/10.1021/jm400791q；及其中參考文獻(xiàn))。自從在1965年Bangham首次描述了脂質(zhì)體(J.Mol.Biol.13,238-252)，對(duì)于開(kāi)發(fā)用于遞送生物活性劑的基于脂質(zhì)的載體系統(tǒng)存在持續(xù)的興趣和努力(Allen,2013,AdvancedDrugDeliveryReviews,65,36-48)。PhilipFelgner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,84,7413-7417(1987)首次描述了通過(guò)采用帶正電荷的脂質(zhì)體將功能性核酸引入培養(yǎng)細(xì)胞中的方法。K.L.Brigham等人,Am.J.Med.Sci.,298,278-281(1989)隨后在體內(nèi)驗(yàn)證了該方法。近來(lái)，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了體外和體內(nèi)具有驗(yàn)證了的功效的脂質(zhì)納米粒制劑(Falsini,2013,J.Med.Chem.dx.doi.org/10.1021/jm400791q；Morrissey,2005,Nat.Biotech.,23,1002-1007；Zimmerman,2006,Nature,441,111-114.；Jayaraman,2012,Angew.Chem.Int.Ed.,51,8529-8533)。脂質(zhì)制劑是很有吸引力的載體，因?yàn)樗鼈兡軌虮Ｗo(hù)生物分子不被降解并同時(shí)提高它們的細(xì)胞攝取。在各種類(lèi)型的脂質(zhì)制劑中，含有陽(yáng)離子脂質(zhì)的制劑通常被用于遞送聚陰離子(例如核酸)。這類(lèi)制劑可以使用單獨(dú)的陽(yáng)離子脂質(zhì)形成，任選地包括其它脂質(zhì)和兩親物如磷脂酰乙醇胺。本領(lǐng)域熟知的是，脂質(zhì)制劑的組成及其制備方法均影響所得聚集物的結(jié)構(gòu)和尺寸(Leung,2012,J.PhysChem.C,116,18440-18450)。已經(jīng)報(bào)道了多種技術(shù)將核酸包封在脂質(zhì)納米粒中，包括洗滌劑透析、擠出、高速混合和逐步稀釋。然而，現(xiàn)有的核酸包封方法具有低包封率或不可規(guī)?；膯?wèn)題，產(chǎn)生的納米粒缺乏高度均勻性，和/或不能獲得小于80nm平均粒度。因此，需要將核酸包封在脂質(zhì)納米粒中的新方法，其產(chǎn)生了高包封度、可規(guī)?；⑶耶a(chǎn)生了具有小于80nm的平均粒度的尺寸均勻的納米粒。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及改善的將核酸包封在脂質(zhì)納米粒主體(host)中的方法。該方法是可規(guī)模化的，并且提供了具有小的平均粒度(例如＜80nm)、改善的粒度均勻性和高的核酸包封度(例如>90％)的包封核酸納米粒的形成。通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的納米粒具有長(zhǎng)期穩(wěn)定性。本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了將核酸包封在脂質(zhì)納米粒主體中的方法，該方法通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)流與一個(gè)或多個(gè)核酸流合并和使所述合并流流動(dòng)以得到包封核酸納米粒的第一出口溶液。每個(gè)脂質(zhì)流包含一種或多種脂質(zhì)在有機(jī)溶劑(例如乙醇)中的混合物。每個(gè)核酸流包含一種或多種核酸在水性溶液中的混合物。在脂質(zhì)流和核酸流的交匯點(diǎn)，每種流都表征有線速度。所述一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)納米粒流具有大于或等于約1.5米/秒的復(fù)合線速度。同樣，所述一個(gè)或多個(gè)核酸流具有大于或等于約1.5米/秒的復(fù)合線速度。在脂質(zhì)流和核酸流合并和混合后，有機(jī)溶劑的最終濃度為使聚集最小的量(例如小于33％)。在一些實(shí)施方案中，第一出口溶液中有機(jī)溶劑的最終濃度為約20％至約25％。在第一個(gè)方面的一些實(shí)施方案中，將合并的脂質(zhì)和核酸流用稀釋溶劑稀釋?zhuān)蕴峁┑谝怀隹谌芤?。在第一個(gè)方面的其它實(shí)施方案中，合并的核酸流的復(fù)合線速度為約3至約14米/秒，脂質(zhì)流的復(fù)合線速度為約1.5至約7米/秒。在本發(fā)明的第二個(gè)方面，所述第一出口溶液通過(guò)稀釋、培養(yǎng)、濃縮和透析進(jìn)行進(jìn)一步加工。在第二個(gè)方面的一些實(shí)施方案中，透析溶液也可以是無(wú)菌過(guò)濾的。通過(guò)第二個(gè)方面的方法產(chǎn)生的包封核酸納米粒具有長(zhǎng)期穩(wěn)定性。在本發(fā)明的第三個(gè)方面，通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的包封脂質(zhì)納米粒具有小于約80nm的平均直徑。在一些實(shí)施方案中，納米粒具有約30至約80nM的平均直徑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，納米粒具有小于約70nm(例如約40-70nm)的平均直徑。本發(fā)明的第四個(gè)方面提供了包封核酸納米粒組合物，其包含可藥用載體、脂質(zhì)納米粒主體和核酸，其中所述包封核酸納米粒具有約40nm至約70nm的平均直徑。附圖簡(jiǎn)述圖1圖解了用于制備和加工包封核酸納米粒的示例性方法的流程圖。圖2圖解了用于制備包封核酸納米粒的代表性系統(tǒng)。圖2a圖解了圖2的系統(tǒng)中使用的稀釋室的供選實(shí)施方案。圖3a、3b和3c圖解了圖2的系統(tǒng)中使用的混合室的供選實(shí)施方案。圖4a是低溫電子顯微鏡檢查得到的圖像，其圖解了采用十字形混合室和方法實(shí)施例2中所述的方法和物質(zhì)產(chǎn)生的siRNA包封脂質(zhì)納米粒的顆粒均勻性。圖4b是低溫電子顯微鏡檢查得到的圖像，其圖解了采用T-形混合室和方法實(shí)施例2中所述的方法和物質(zhì)產(chǎn)生的siRNA包封脂質(zhì)納米粒的顆粒均勻性。詳細(xì)說(shuō)明1.0概述本發(fā)明提供了制備具有均勻的小粒度的包封核酸納米粒的方法。圖1顯示的是概括地描繪本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的步驟的代表性流程圖。在步驟100中，一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)流在第一交匯點(diǎn)與一個(gè)或多個(gè)核酸流合并，得到第一合并流。然后，使第一合并流流動(dòng)(步驟110)以允許所述合并流的各個(gè)流聯(lián)合，由此進(jìn)行脂質(zhì)納米粒組裝和核酸包封的過(guò)程。根據(jù)對(duì)初始核酸流所選擇的具體參數(shù)，合并流可以任選地用水性介質(zhì)進(jìn)一步稀釋(步驟120)，得到第一出口溶液(步驟130)?；蛘?，可以省略任選的稀釋步驟120和在步驟100中通過(guò)使用適當(dāng)稀釋的核酸流、由流動(dòng)的合并流直接獲得第一出口流。步驟130獲得的第一出口溶液含有包封核酸納米粒。可以對(duì)第一出口溶液進(jìn)行進(jìn)一步加工以除去有機(jī)溶劑和由此得到包封核酸納米粒，所述包封核酸納米粒為具有長(zhǎng)期穩(wěn)定性的制劑。首先，第一出口溶液的培養(yǎng)(步驟140)在室溫下進(jìn)行一段時(shí)間(例如60分鐘)，然后用水性介質(zhì)(例如水、檸檬酸鹽緩沖液)稀釋(步驟150)，濃縮和透析(步驟160)，最后無(wú)菌過(guò)濾(步驟170)。稀釋步驟150可以將有機(jī)溶劑濃度稀釋兩倍。濃縮可以通過(guò)切向流過(guò)濾進(jìn)行。已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)流與一個(gè)或多個(gè)核酸流合并/交匯獲得了小的和均勻的顆粒，其中合并的脂質(zhì)流和合并的核酸流各自保持了大于1.5米/秒的線速度，并且當(dāng)合并/混合流時(shí)有機(jī)溶劑的最終濃度小于33％體積。保持有機(jī)溶劑小于33％可抑制納米粒的聚集，而本發(fā)明的高流速保持粒度小且均勻。該方法提供了核酸的有效包封。在一些實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)核酸流的復(fù)合線速度為約1.5至約14米/秒，且所述一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)流的復(fù)合線速度為約1.5至約7米/秒。在其它實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)核酸流的復(fù)合線速度為約3至約14米/秒，且所述一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)流的復(fù)合線速度為約1.5至約4.5米/秒。在其它實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)核酸流的復(fù)合線速度為約8至約14米/秒，且所述一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)流的復(fù)合線速度為約1.5至約4.5米/秒。在其它實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)核酸流的復(fù)合線速度為約3至約8米/秒，且所述一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)流的復(fù)合線速度為約1.5至約4.5米/秒。在其它實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)核酸流的復(fù)合線速度為約9至約14米/秒，且所述一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)流的復(fù)合線速度為約3至約4米/秒。在其它實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)核酸流的復(fù)合線速度為約11至約14米/秒，且所述一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)流的復(fù)合線速度為約3至約4米/秒。在其它實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)核酸流的復(fù)合線速度為約9至約11米/秒，且所述一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)流的復(fù)合線速度為約3至約4米/秒。在其它實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)核酸流的復(fù)合線速度為約6至約8米/秒，且所述一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)流的復(fù)合線速度為約3至約4米/秒。在其它實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)核酸流的復(fù)合線速度為約10.2米/秒，且所述一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)流的復(fù)合線速度為約3.4米/秒。在其它實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)核酸流的復(fù)合線速度為約6.8米/秒，且所述一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)流的復(fù)合線速度為約3.4米/秒。在其它實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)核酸流的復(fù)合線速度為約13.6米/秒，且所述一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)流的復(fù)合線速度為約3.4米/秒。在其它實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)核酸流的復(fù)合線速度為約3.4米/秒，且所述一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)流的復(fù)合線速度為約1.7米/秒。在其它實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)核酸流的復(fù)合線速度為約3米/秒，且所述一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)流的復(fù)合線速度為約1.5米/秒。在其它實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)核酸流的復(fù)合線速度為約14米/秒，且所述一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)流的復(fù)合線速度為約7米/秒。2.0核酸適用于本發(fā)明的核酸包括：反義DNA或RNA組合物、嵌合DNA:RNA組合物、等位酶、適體、核酶、誘餌及其類(lèi)似物、質(zhì)粒及其它類(lèi)型的表達(dá)載體以及小核酸分子、RNAi劑、短干擾核酸(siNA)、信使核糖核酸(信使RNA、mRNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、微-RNA(miRNA)和短發(fā)夾RNA(shRNA)分子、肽核酸(PNA)、鎖定核酸核苷酸(LNA)、嗎啉代核苷酸、蘇糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、sisiRNA(小內(nèi)部節(jié)段干擾RNA)、aiRNA(不對(duì)稱(chēng)干擾RNA)和在正義鏈和反義鏈之間具有1個(gè)、2個(gè)或更多個(gè)錯(cuò)配的siRNA(相關(guān)細(xì)胞和/或組織的那些，例如在細(xì)胞組織、受治療者或生物體中)。這類(lèi)化合物可以被純化或部分純化，可以是天然存在的或合成的，并且可以是化學(xué)修飾的。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物活性劑為RNAi劑、短干擾核酸(siNA)、短干擾RNA(siRNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、微-RNA(miRNA)或短發(fā)夾RNA(shRNA)分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物活性劑為可用于調(diào)節(jié)RNA干擾(RNAi)的RNAi劑?！昂颂呛怂帷?RNA)是通過(guò)磷酸二酯鍵連接的核苷酸聚合物，其中每個(gè)核苷酸含有核糖或其修飾形式作為糖組分。核苷酸各自含有腺嘌呤(A)、鳥(niǎo)嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)或其修飾形式作為堿。mRNA分子中的遺傳信息以mRNA分子的核苷酸堿基序列進(jìn)行編碼，其被安排為各自由三個(gè)核苷酸堿基組成的密碼子。除了結(jié)束翻譯(蛋白質(zhì)合成)的終止密碼子，每個(gè)密碼子編碼多肽的特定氨基酸。在活細(xì)胞內(nèi)，mRNA被運(yùn)輸至核糖體(合成蛋白質(zhì)的位置)，在那里其提供了蛋白質(zhì)合成(翻譯)的遺傳信息。對(duì)于更完整的描述，參見(jiàn)AlbertsB等人(2007)MolecularBiologyofCell,第5版,GarlandScience。在真核生物中，mRNA在染色體中通過(guò)細(xì)胞酶RNA聚合酶被體內(nèi)轉(zhuǎn)錄。在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄期間或之后，將5'帽(也稱(chēng)為RNA帽、RNA7-甲基鳥(niǎo)苷帽或RNAm7G帽)在體內(nèi)加至mRNA的5'端。5'帽為末端7-甲基鳥(niǎo)苷殘基，其通過(guò)5'-5'-三磷酸酯鍵與第一個(gè)轉(zhuǎn)錄的核苷酸連接。另外，大多數(shù)真核生物mRNA分子在mRNA分子的3’端具有聚腺苷酰部分(“聚(A)尾”)。在體內(nèi)，真核細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄后添加聚(A)尾，通常長(zhǎng)度為約250個(gè)腺苷殘基。因此，典型的成熟真核mRNA具有如下結(jié)構(gòu)：在5’端以mRNA帽核苷酸開(kāi)始，接著是核苷酸的5’非翻譯區(qū)(5’UTR)，然后是以起始密碼子(其為核苷酸堿基的AUG三聯(lián)體)開(kāi)始、編碼蛋白質(zhì)序列并以可以是核苷酸堿基的UAA、UAG或UGA三聯(lián)體的終止密碼子結(jié)束的可讀框，之后是核苷酸的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)，以聚腺苷尾結(jié)束。雖然典型的成熟真核mRNA的特征是在真核細(xì)胞中體內(nèi)天然產(chǎn)生的，但是可以采用分子生物學(xué)方法體外產(chǎn)生相同的或結(jié)構(gòu)和功能上等同的特征。因此，任何具有與典型的成熟真核mRNA類(lèi)似結(jié)構(gòu)的RNA都可以起到mRNA的作用，并且也落入術(shù)語(yǔ)“信使核糖核酸”的范圍內(nèi)。mRNA分子通常具有可被包封在本發(fā)明的脂質(zhì)納米粒內(nèi)的尺寸。雖然mRNA分子的尺寸性質(zhì)上根據(jù)編碼特定蛋白質(zhì)的mRNA種類(lèi)的特性而變化，mRNA分子的平均尺寸是500－10,000個(gè)堿基的平均mRNA尺寸。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“脫氧核糖核酸”(DNA)指載有活生物體的細(xì)胞和多種病毒中的遺傳信息的聚合核酸。在體內(nèi)，DNA能夠自我復(fù)制和合成RNA。DNA由纏繞成雙螺旋且通過(guò)互補(bǔ)堿基腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C)和鳥(niǎo)嘌呤(G)之間的氫鍵結(jié)合的兩條核苷酸長(zhǎng)鏈組成。核苷酸的序列決定了個(gè)體遺傳特征。參見(jiàn)TheAmericanDictionaryoftheEnglishLanguage,第4版(2009年更新).HoughtonMifflinCompany。DNA聚合物的各個(gè)核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵以5’至3’方向連接。每個(gè)核苷酸含有脫氧核糖或其修飾物作為糖組分。每個(gè)核苷酸含有腺嘌呤(A)、鳥(niǎo)嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或其修飾物作為堿基。體內(nèi)存在的大多數(shù)DNA分子為雙鏈螺旋，所述雙鏈螺旋由反向平行形成的兩個(gè)長(zhǎng)聚合物組成，一個(gè)主鏈?zhǔn)?’，另一個(gè)是5’。在該雙鏈形成中，堿基通過(guò)氫鍵鍵合配對(duì)，腺嘌呤與胸腺嘧啶鍵合，鳥(niǎo)嘌呤與胞嘧啶鍵合，產(chǎn)生了雙螺旋結(jié)構(gòu)。其它DNA分子是單鏈的，雖然單鏈DNA分子如果與具有互補(bǔ)核苷酸序列的另一個(gè)單鏈DNA或RNA分子匹配的話有可能變成雙鏈。關(guān)于更詳細(xì)的說(shuō)明，參見(jiàn)AlbertsB等人,(2007)MolecularBiologyoftheCell,第5版,GarlandScience。沿著脫氧核糖主鏈的核苷酸堿基序列編碼遺傳信息。對(duì)于蛋白質(zhì)的合成，當(dāng)產(chǎn)生mRNA分子時(shí)，遺傳信息在稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中被拷貝到mRNA分子的核苷酸序列中。DNA能夠以至少兩種具有不同尺寸的形式存在。DNA的第一種形式是稱(chēng)為染色體的具有非常大尺寸的聚合物。染色體含有細(xì)胞中的多種或大多數(shù)蛋白質(zhì)的遺傳信息，并且還含有細(xì)胞能夠藉此控制DNA分子復(fù)制的信息。細(xì)菌細(xì)胞可以含有一種或多種染色體。真核細(xì)胞通常含有多于一種的細(xì)胞染色體，每種染色體。DNA的第二種形式是具有較短尺寸的形式。第二種形式的多種DNA分子具有能夠包封在本發(fā)明的脂質(zhì)納米粒中的尺寸。這些較短形式的DNA中的一些可以具有可用于編碼蛋白質(zhì)的尺寸。DNA的這些第二種較短的有用形式的實(shí)例包括質(zhì)粒及其它載體。關(guān)于更詳細(xì)的說(shuō)明，參見(jiàn)AlbertsB等人(2007)MolecularBiologyoftheCell,第5版,GarlandScience。質(zhì)粒是物理上與細(xì)胞內(nèi)的染色體DNA分離并且可獨(dú)立于細(xì)胞內(nèi)的染色體DNA進(jìn)行復(fù)制的小DNA分子。質(zhì)粒通常在體內(nèi)作為小的圓形雙鏈DNA分子存在。在性質(zhì)上，質(zhì)粒載有可轉(zhuǎn)錄和翻譯為對(duì)生物體存活有益的蛋白質(zhì)的基因(例如抗生素抗性)。在性質(zhì)上，質(zhì)粒常常可以通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移從一個(gè)生物體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)生物體。人工質(zhì)粒或重組質(zhì)粒廣泛用于分子生物學(xué)中，用來(lái)允許宿主生物體內(nèi)的重組DNA序列的復(fù)制和有用蛋白質(zhì)的表達(dá)。質(zhì)粒尺寸可以為1至超過(guò)25千堿基對(duì)不等。重組質(zhì)?？梢员恢亟M制成具有能夠包封在本發(fā)明的脂質(zhì)納米粒中的尺寸。在分子生物學(xué)中，載體為DNA分子，其用作載體以將來(lái)自一個(gè)細(xì)胞或來(lái)自體外生化反應(yīng)的遺傳物質(zhì)人工運(yùn)載到可以復(fù)制和/或表達(dá)該DNA的其它細(xì)胞中。含有外源DNA的載體稱(chēng)為重組體。有用的載體類(lèi)型包括質(zhì)粒和病毒載體。將載體插入到靶細(xì)胞中對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞通常稱(chēng)為轉(zhuǎn)化，對(duì)于真核細(xì)胞通常稱(chēng)為轉(zhuǎn)染，但是病毒載體的插入通常稱(chēng)為轉(zhuǎn)導(dǎo)。病毒載體通常是攜帶經(jīng)修飾的病毒DNA或RNA的重組病毒，已經(jīng)使其成為非傳染性的，但是含有病毒啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)基因，由此允許通過(guò)病毒啟動(dòng)子來(lái)翻譯轉(zhuǎn)基因。病毒載體通常被設(shè)計(jì)成將插入物永久合并入宿主基因組中，因而在合并轉(zhuǎn)基因后在宿主基因組中留下明顯的遺傳標(biāo)記。病毒載體可以被重組制成具有能夠被包封在本發(fā)明的脂質(zhì)納米粒中的尺寸。“RNAi劑”是能夠調(diào)節(jié)RNA干擾的組合物或化合物。術(shù)語(yǔ)“RNA干擾”(RNAi)是使用RNAi劑來(lái)降低含有與所述RNAi劑相同或非常類(lèi)似序列的信使RNA(mRNA)的轉(zhuǎn)錄后靶基因沉默技術(shù)。參見(jiàn)：Zamore和Haley2005Science309:1519-1524；Zamore等人,2000Cell101:25-33；Elbashir等人,2001Nature411:494-498；和Kreutzer等人,PCT公開(kāi)WO00/44895；Fire,PCT公開(kāi)WO99/32619；Mello和Fire,PCT公開(kāi)WO01/29058；等。如本文所用的RNAi相當(dāng)于用于描述序列特異性RNA干擾的其它術(shù)語(yǔ)，例如轉(zhuǎn)錄后基因沉默、翻譯抑制、轉(zhuǎn)錄抑制或表觀遺傳。例如，含有本發(fā)明的脂質(zhì)的制劑可以與siNA分子組合使用以在轉(zhuǎn)錄后水平和/或轉(zhuǎn)錄前水平在表觀遺傳學(xué)上使基因沉默。在非限制性實(shí)例中，通過(guò)siNA分子調(diào)節(jié)基因表達(dá)可以產(chǎn)生于經(jīng)由RISC或如本領(lǐng)域已知的翻譯抑制的siNA介導(dǎo)的RNA(編碼或非編碼RNA)裂解。在另一個(gè)實(shí)施方案中，siNA調(diào)節(jié)基因表達(dá)可以產(chǎn)生于轉(zhuǎn)錄抑制，例如如在Janowski等人,2005NatureChemicalBiology1:216-222中報(bào)道的那樣。RNAi劑特別包括siRNA或siNA、微RNA(miRNA)、shRNA、短干擾寡核苷酸和化學(xué)修飾的短干擾核酸分子。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“短干擾RNA”(siRNA)或“短干擾核酸”(siNA)等指能夠通過(guò)以序列特異性方式介導(dǎo)RNA干擾(RNAi)或基因沉默來(lái)抑制或下調(diào)基因表達(dá)或病毒復(fù)制的任意分子。siRNA可通過(guò)核糖核酸酶III裂解由較長(zhǎng)的雙鏈RNA(dsRNA)而天然產(chǎn)生，所述雙鏈RNA(dsRNA)與沉默的基因靶標(biāo)同源或?qū)ζ涮禺悺Ｋ鼈冞€可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種方法來(lái)人工產(chǎn)生。本公開(kāi)內(nèi)容的RNAi劑可以靶向任意靶基因，包含任意序列，并且可以具有多種形式、組分、取代和/或修飾中的任一種。RNAi劑通常包括兩條鏈，反義鏈(或引導(dǎo)鏈)和有義鏈(或過(guò)客鏈)；反義鏈被整合到RISC(RNA干擾沉默復(fù)合物)中并靶向于靶mRNA的相應(yīng)序列。反義鏈的序列(或其部分)與靶mRNA相匹配。可存在一些不阻止靶特異性RNAi活性的錯(cuò)配(通常每15nt序列不超過(guò)1-3個(gè)錯(cuò)配)。反義鏈和有義鏈可以是單獨(dú)的分子，或通過(guò)連接基或袢連接(以形成例如shRNA)。反義鏈通常為49-mer或更短，經(jīng)常是19-mer至25-mer。有義鏈可以具有與反義鏈相同的長(zhǎng)度或比其更短或更長(zhǎng)。如本文所示，反義鏈可以短至18-mer，有義鏈可以短至14-mer。典型的siRNA為兩條鏈的RNA，各自為21-mer，具有19-bp(堿基對(duì))雙鏈區(qū)和兩個(gè)2-nt(核苷酸)突出物。Elbashir等人,2001Nature411:494-498；Elbashir等人,2001EMBOJ.20:6877-6888。突出物可以被二核苷酸如dTdT、TT、UU、U(2’-OMe)dT、U(2’-OMe)U(2’-OMe)、T(2’-OMe)T(2’-OMe)、T(2’-OMe)dT等所替代。突出物發(fā)揮保護(hù)RNAi劑不被核酸酶裂解的作用，同時(shí)不干擾RNAi活性或有助于靶識(shí)別。Elbashir等人,2001Nature411:494-498；Elbashir等人,2001EMBOJ.20:6877-6888；和Kraynack等人,2006RNA12:163-176。另外的3'-未端核苷酸突出物包括dT(脫氧胸苷)、2’-O,4’-C-乙烯基胸苷(eT)和2-羥乙基磷酸酯(hp)。也可以進(jìn)行4-硫尿嘧啶和5-溴尿嘧啶取代。Parrish等人,2000MolecularCell6:1077-1087。核苷酸突出物可以被非核苷酸3’端帽代替，條件是這類(lèi)帽能夠保護(hù)末端不被裂解，并且允許分子的RNAi活性。參見(jiàn)例如U.S.專(zhuān)利號(hào)8,097,716；8,084,600；8,404,831；8,404,832；和8,344,128；和U.S.專(zhuān)利申請(qǐng)61/886,739，它們整體引入本文作為參考。在任一條鏈中，一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)可以被間隔基替代。這些包括但不限于糖、烷基、環(huán)烷基、核糖醇或其它類(lèi)型的堿基核苷酸、2’-脫氧-核糖醇、二核糖醇、2’-甲氧基乙氧基-核糖醇(具有2’-MOE的核糖醇)、C3-6烷基或4-甲氧基丁烷-1,3-二醇(5300)。在某些分子中，可以向有義鏈中引入空位，產(chǎn)生兩個(gè)較短的有義鏈；這稱(chēng)為sisiRNA。Wengels和Kjems的WO2007/107162。也可以在有義鏈和反義鏈之間引入一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配和凸出。Khvorova的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.2009/0209626。RNAi劑可以由RNA構(gòu)建，如在典型siRNA中。然而，在各種RNAi劑中，RNA核苷酸可以被取代或修飾。在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)，RNA核苷酸可以被DNA、肽核酸(PNA)、鎖定核酸(LNA)、嗎啉代核苷酸、蘇糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、阿拉伯糖核酸(ANA)、2’-氟阿拉伯糖核酸(FANA)、環(huán)己烯核酸(CeNA)、失水己糖醇核酸(HNA)或解鎖定核酸(UNA)取代或修飾。特別地，在種子區(qū)域(反義鏈的約2-7位和有義鏈的相應(yīng)位點(diǎn))，一條或兩條鏈中的核苷酸可以被DNA替代。整個(gè)種子區(qū)域可以被DNA替代，形成能夠調(diào)節(jié)RNA干擾的DNA-RNA雜交物。Yamato等人,2011.CancerGeneTher.18:587-597。RNA核苷酸可以被其它組分(如上所述)取代和/或修飾。修飾和/或取代可以在糖、磷酸酯基和/或堿基上進(jìn)行。在各個(gè)方面，RNAi劑包括糖的2'-修飾，例如2'-氨基、2'-C-烯丙基、2'-脫氧、2'-脫氧2'-氟(2’-F)、2'-O-甲基(2’-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-氨基丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基氨基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基氨基丙基(2'-O-DMAP)、2'-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O-N-甲基乙酰氨基(2'-O-NMA)；其它RNA修飾是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)例如UsmanandCedergren1992TIBS.17:34；Usman等人,1994NucleicAcidsSymp.Ser.31:163；Burgin等人,1996Biochemistry35:14090。在某些實(shí)施方案中，任一條或兩條鏈的3’端上的兩個(gè)RNA核苷酸被2’-MOE修飾，形成2’-MOE夾。U.S.專(zhuān)利號(hào)8,097,716；和8,084,600。糖-磷酸酯主鏈的一個(gè)或多個(gè)磷酸酯基可以被例如經(jīng)修飾的核苷內(nèi)連接基替代。這可以包括但不限于硫代磷酸酯基、二硫代磷酸酯基、氨基磷酸酯基、硼烷膦酸酯基(boranophosphonoate)、酰胺連接基和式(Ia)的化合物其中R3選自O(shè)-、S-、NH2、BH3、CH3、C1-6烷基、C6-10芳基、C1-6烷氧基和C6-10芳基氧基，其中C1-6烷基和C6-10芳基是未取代的或任選獨(dú)立地被1至3個(gè)獨(dú)立地選自鹵素、羥基和NH2的基團(tuán)取代；和R4選自O(shè)、S、NH或CH2。堿基也可以是經(jīng)修飾的或取代的，例如被下述基團(tuán)修飾或取代：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤(xantine)、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(β-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥(niǎo)嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥(niǎo)嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥(niǎo)嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥(niǎo)嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷(β-D-mannosylqueosine)、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、丁氧核苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶(pseudouracil)、Q核苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2,6-二氨基嘌呤。在某些方面，RNAi劑可以包含非天然核堿基，其中非天然核堿基為二氟甲苯基、硝基吲哚基、硝基吡咯基或硝基咪唑基。很多其它修飾是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)例如Usman等人,1992TIBS17:34；Usman等人,1994Nucl.AcidsSymp.Ser.31:163；Burgin等人,1996Biochem.35:14090。例如，一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)可以由2'-O-甲基胞苷-5’-磷酸酯基、2'-O-甲基尿苷-5’-磷酸酯基代表。簡(jiǎn)言之，任何一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)都可以由本領(lǐng)域已知的任何修飾或取代所代表，所述修飾或取代包括但不限于2'-O-甲基修飾的核苷酸、包含5'硫代磷酸酯基團(tuán)的核苷、與膽甾醇基衍生物或十二烷酸二癸酰胺基團(tuán)連接的未端核苷、鎖定核苷、無(wú)堿基核苷、2'-脫氧-2'-氟修飾的核苷、2'-氨基修飾的核苷、2'-烷基修飾的核苷、嗎琳代基核苷、解鎖定核糖核苷酸(例如無(wú)環(huán)核苷酸單體，如WO2008/147824中所述)、磷酰胺或包含核苷的非天然堿基或其任意組合。任意這些各種形式、組分、取代和/或修飾可以以不同方式混合和匹配或合并以形成針對(duì)任意靶標(biāo)和包含任意序列的RNAi劑。例如，本公開(kāi)內(nèi)容涉及包含兩條鏈的RNAi劑，其中一條或兩條鏈為18-mer，其在3’端以磷酸酯基或經(jīng)修飾的核苷間連接基終止，并且以5’至3’順序進(jìn)一步包含間隔基、第二個(gè)磷酸酯基或經(jīng)修飾的核苷間連接基和3’端帽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容涉及包含有義鏈和反義鏈的RNAi劑，其中反義鏈以5-至3-順序包含18-mer，其在3’端以磷酸酯基或經(jīng)修飾的核苷間連接基終止，并且以5’至3’順序進(jìn)一步包含間隔基、第二個(gè)磷酸酯基或經(jīng)修飾的核苷間連接基和3’端帽；并且其中有義鏈以5’至3’順序包含14-mer(或更長(zhǎng))，其在3'端以磷酸酯基或經(jīng)修飾的核苷間連接基終止，并且以5’至3’順序進(jìn)一步包含間隔基、第二個(gè)磷酸酯基或經(jīng)修飾的核苷間連接基和3'端帽。在本公開(kāi)內(nèi)容的多個(gè)實(shí)施方案中，RNAi劑可以靶向任意靶基因和可以具有任意序列，并且可以具有如本文所述的或本領(lǐng)域已知的任何形式、組分、取代和/或修飾。術(shù)語(yǔ)“RNAi抑制劑”為可以下調(diào)(例如降低或抑制)細(xì)胞或患者中RNA干擾功能或活性的任何分子。RNAi抑制劑可以通過(guò)與RNAi途徑的任何組分(包括蛋白質(zhì)組分如RISC或核酸組分如miRNA或siRNA)的功能相互作用或相互干擾而下調(diào)、減少或抑制RNAi(例如RNAi介導(dǎo)的靶聚核苷酸裂解、翻譯抑制或轉(zhuǎn)錄沉默)。RNAi抑制劑可以是siNA分子、反義分子、適體或影響或干擾RISC、miRNA或siRNA或細(xì)胞或患者中RNAi途徑的任何其它組分的功能的小分子。通過(guò)抑制RNAi(例如RNAi介導(dǎo)的靶聚核苷酸的裂解、翻譯抑制或轉(zhuǎn)錄沉默)，RNAi抑制劑可用于調(diào)節(jié)(例如上調(diào)或下調(diào))靶基因的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，RNA抑制劑經(jīng)由翻譯抑制、轉(zhuǎn)錄沉默或RISC介導(dǎo)的聚核苷酸(例如mRNA)的裂解、通過(guò)干擾(例如減少或阻止)基因表達(dá)的內(nèi)源性下調(diào)或抑制而用于上調(diào)基因表達(dá)。通過(guò)干擾基因表達(dá)的內(nèi)源性遏制、沉默或抑制的機(jī)制，本發(fā)明的RNAi抑制劑因而可用于上調(diào)基因表達(dá)，從而用于治療由功能喪失導(dǎo)致的疾病或病癥。在本文的各個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“RNAi抑制劑”與術(shù)語(yǔ)“siNA”可互換使用。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“酶性核酸”指在底物結(jié)合區(qū)域與特定基因靶具有互補(bǔ)性并且還具有特異性裂解靶RNA、由此使靶RNA分子失活的酶活性的核酸分子?；パa(bǔ)區(qū)域允許酶性核酸分子與靶RNA充分雜交，由此允許裂解。100％的互補(bǔ)性是優(yōu)選的，但是低至50-75％的互補(bǔ)性也可用于本發(fā)明(參見(jiàn)例如Werner和Uhlenbeck,1995,NucleicAcidsResearch,23,2092-2096；Hammann等人,1999,AntisenseandNucleicAcidDrugDev.,9,25-31)。核酸可以在堿基、糖基和/或磷酸酯基進(jìn)行修飾。術(shù)語(yǔ)酶性核酸與諸如核酶、催化RNA、酶性RNA、催化DNA、適體酶(aptazyme)或結(jié)合適體的核酶、可調(diào)節(jié)的核酶、催化寡核苷酸、核酶(nucleozyme)、DNA酶、RNA酶、核糖核酸內(nèi)切酶、核酸內(nèi)切酶、微小酶(minizyme)、leadzyme、低聚酶(oligozyme)或DNA酶。所有這些術(shù)語(yǔ)均描述了具有酶活性的核酸分子。酶性核酸分子的關(guān)鍵特征是其具有與靶核酸區(qū)域中的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)的特異性底物結(jié)合位點(diǎn)，并且其具有在底物結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)或其周?chē)慕o分子賦予核酸裂解和/或結(jié)合活性的核苷酸序列(參見(jiàn)例如Cech等人,U.S.專(zhuān)利4,987,071；Cech等人,1988,260JAMA3030)。本發(fā)明的核酶和酶性核酸分子可以是化學(xué)修飾的，例如如本領(lǐng)域或本文其它地方所述。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“反義核酸”指利用RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-PNA(proteinnucleicacid；Egholm等人,1993Nature365,566)相互作用與靶RNA結(jié)合和改變靶RNA活性的非酶性核酸分子(綜述參見(jiàn)Stein和Cheng,1993Science261,1004和Woolf等人,U.S.專(zhuān)利5,849,902)。反義DNA可以是化學(xué)合成的或經(jīng)由利用單鏈DNA表達(dá)載體或其同等物表達(dá)的。本發(fā)明的反義分子可以是化學(xué)修飾的，例如如本領(lǐng)域所述。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“RNaseH活化區(qū)域”指能夠結(jié)合靶RNA以形成被細(xì)胞RNaseH酶識(shí)別的非共價(jià)復(fù)合物的核酸分子的區(qū)域(長(zhǎng)度通常大于或等于4-25個(gè)核苷酸，優(yōu)選長(zhǎng)度為5-11個(gè)核苷酸)(參見(jiàn)例如Arrow等人,U.S.專(zhuān)利5,849,902；Arrow等人,U.S.專(zhuān)利5,989,912)。RNaseH酶結(jié)合核酸分子-靶RNA復(fù)合物，并且裂解靶RNA序列。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“2-5A反義嵌合體”指含有5’-磷酸化2’-5’-連接的腺苷酸殘基的反義寡核苷酸。這些嵌合體以序列特異性的方式結(jié)合靶RNA，并且激活細(xì)胞2-5A-依賴(lài)性核糖核酸酶，其隨后裂解靶RNA(Torrence等人,1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA90,1300；Silverman等人,2000,MethodsEnzymol.,313,522-533；Player和Torrence,1998,Pharmacol.Ther.,78,55-113)。2-5A反義嵌合體分子可以是化學(xué)修飾的，例如如本領(lǐng)域所述。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“三螺旋形成寡核苷酸”指能夠以序列特異性方式結(jié)合雙鏈DNA以形成三鏈螺旋的寡核苷酸。這類(lèi)三螺旋結(jié)構(gòu)的形成已經(jīng)顯示出抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄(Duval-Valentin等人,1992Proc.Natl.Acad.Sci.USA89,504；Fox,2000,Curr.Med.Chem.,7,17-37；Praseuth等人,2000,Biochim.Biophys.Acta,1489,181-206)。本發(fā)明的三螺旋形成寡核苷酸可以是化學(xué)修飾的，例如如本領(lǐng)域所述。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“誘餌RNA”指被設(shè)計(jì)成與預(yù)期配體優(yōu)先結(jié)合的RNA分子或適體。這種結(jié)合可導(dǎo)致靶分子的抑制或活化。誘餌RNA或適體可以與天然存在的結(jié)合靶競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合特定配體。類(lèi)似地，誘餌RNA被設(shè)計(jì)成與受體結(jié)合并阻斷效應(yīng)分子的結(jié)合，或者可以被設(shè)計(jì)成結(jié)合感興趣的受體并阻止與受體的相互作用。本發(fā)明的誘餌分子可以是化學(xué)修飾的，例如如本領(lǐng)域所述。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“單鏈DNA”(ssDNA)指含有線性單鏈的天然存在的或合成的脫氧核糖核酸分子，例如ssDNA可以是有義或反義基因序列或EST(已表達(dá)序列標(biāo)志)。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“等位酶”指變構(gòu)酶性核酸分子，包括例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,834,186、5,741,679、5,589,332、5,871,914和PCT公開(kāi)號(hào)WO00/24931、WO00/26226、WO98/27104和WO99/29842。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“適體”指與靶分子特異性結(jié)合的聚核苷酸組合物，其中所述聚核苷酸具有的序列不同于細(xì)胞中靶分子所正常識(shí)別的序列?；蛘撸m體可以是與靶分子結(jié)合的核酸分子，其中靶分子不天然地結(jié)合核酸。靶分子可以為任何感興趣的分子。本發(fā)明的適體分子可以是化學(xué)修飾的，例如如本領(lǐng)域所述。3.0脂質(zhì)3.1陽(yáng)離子脂質(zhì)適用于脂質(zhì)組合物的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括但不限于N,N-二油基-N,N-二甲基氯化銨(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨(DDAB)、N-(1-(2,3-二油酰基氧基)丙基)N,N,N-三甲基氯化銨(DOTAP)、N-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油基氧基)丙胺(DODMA)、1,2-二油?；?3-二甲基銨-丙烷(DODAP)、1,2-二油?；奔柞；?3-二甲基銨丙烷(DOCDAP)、1,2-Dilineoy1-3-二甲基銨丙烷(DLINDAP)、二油?；趸?N-[2-精胺甲酰氨基)乙基}-N,N-二甲基-1-丙烷三氟乙酸銨(DOSPA)、雙十八烷基酰氨基甘氨酰精胺(DOGS)、DC-Chol、1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羥基乙基溴化銨(DMRIE)、3-二甲基氨基-2-(膽甾-5-烯-3β-氧基丁烷-4-氧基)-1-(順式,順式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5'-(膽甾-5-烯-3～-氧基)-3'-氧雜戊氧基)-3-二甲基-1-(順式,順式-9',12'-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油基氧基芐胺(DMOBA)、1,2-N,N'-二油基氨甲?；?3-二甲基氨基丙烷(DOcarbDAP)和/或其混合物。其它適宜的陽(yáng)離子脂質(zhì)公開(kāi)在美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/918,927中，其整體引入本文作為參考。一種適宜的脂質(zhì)為式(I)化合物或其鹽：其中n和p各自獨(dú)立地為1或2；R1為雜環(huán)基、雜環(huán)基-C1-8-烷基或雜環(huán)基-C1-8-烷氧基，其各自可以任選被1、2或3個(gè)基團(tuán)取代，所述基團(tuán)獨(dú)立地選自C1-8-烷基、C3-7-環(huán)烷基、C3-7-環(huán)烷基-C1-8-烷基、雜環(huán)基、-[(C1-C4)亞烷基]v-N(R’)R”、-O-[(C1-C4)亞烷基]v-N(R’)R”或N(H)-[(C1-C4)亞烷基]v-N(R’)R”，其中所述(C1-C4)亞烷基任選被一個(gè)或多個(gè)R基團(tuán)取代；v為0、1、2、3或4；R為氫或-C1-8-烷基，或當(dāng)v為0時(shí)R不存在；R’和R”各自獨(dú)立地為氫、-C1-8-烷基；或R'和R”與它們結(jié)合的氮一起且任選包括另一個(gè)選自N、O和S的雜原子以形成5-8元雜環(huán)或雜芳基，任選被-C1-8-烷基、羥基或環(huán)烷基-C1-8-取代；R2和R3各自獨(dú)立地為C12-22烷基、C12-22鏈烯基、R4選自氫、C1-14烷基、其它陽(yáng)離子脂質(zhì)包括式(II)化合物或其鹽：其它適宜的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括式(I)和(II)的那些，其中R4為氫或其中R4為其它適宜的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括前述脂質(zhì)，其中R1選自：其它適宜的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括前述脂質(zhì)，其中R2選自：其它適宜的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括前述脂質(zhì)，其中R3選自：根據(jù)前述脂質(zhì)的其它適宜脂質(zhì)包括其中R2和R3相同的那些。具體的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括選自下述的化合物：雙(十八碳-9,12-二烯酸(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(((1,3-二甲基吡咯烷-3-羰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯；雙(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(((3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙?；?氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯；雙(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(((4-(吡咯烷-1-基)丁?；?氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯；雙(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(((4-(哌啶-1-基)丁?；?氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯；雙(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(((3-(二甲基氨基)丙?；?氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯；雙(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((2-(二甲基氨基)乙酰氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯；雙(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(((3-(二乙基氨基)丙?；?氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯；雙(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(((1,4-二甲基哌啶-4-羰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯；雙(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(((1-(環(huán)丙基甲基)哌啶-4-羰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯；雙(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(((3-嗎琳子基丙?；?氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯；雙(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(((4-(二甲基氨基)丁?；?氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯；雙(8-(辛酰氧基)辛酸)2-(((1,3-二甲基吡咯烷-3-羰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯；十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁?；?氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基酯；十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基酯；十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁?；?氧基)-2-((((1-乙基哌啶-3-基)甲氧基)羰基)氧基)甲基)丙基酯；雙(2-庚基十一酸)2-((((2-(二乙基氨基)乙氧基)羰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯；十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-(((2-(二乙基氨基)乙氧基)羰基)氧基)-2-(((2-庚基十一?；?氧基)甲基)丙基酯；雙(2-庚基十一酸)2-((((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯；十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-2-(((2-庚基十一酰基)氧基)甲基)丙基酯；十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-(((2-(二甲基氨基)乙氧基)羰基)氧基)-2-(((3-辛基十一?；?氧基)甲基)丙基酯；雙(3-辛基十一酸)2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯；十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-2-(((3-辛基十一酰基)氧基)甲基)丙基酯；十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-2-(((9-戊基十四酰基)氧基)甲基)丙基酯；十八碳-9,15-二烯酸(9Z,12Z)-3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-2-(((5-庚基十二烷酰基)氧基)甲基)丙基酯；十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-(2,2-雙(庚氧基)乙酰氧基)-2-((((2-(二甲基氨基)乙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基酯；和十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((6,6-雙(辛氧基)己?；?氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基酯。其它適宜的陽(yáng)離子脂質(zhì)公開(kāi)在美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/918,941中，其全文引入本文作為參考。一種適宜的脂質(zhì)為式(III)化合物或其鹽：其中n為0、1、2、3或4；p為0、1、2、3、4、5、6、7或8；L1為-O-或價(jià)鍵；L2為-OC(O)-或-C(O)O-；R1選自：v為0、1、2、3或4；w為0、1、2或3；Cyl為任選被一個(gè)或兩個(gè)烷基取代的5-7元含氮雜環(huán)；R和R’各自獨(dú)立地為氫或C1-8烷基；和R2選自C6-20烷基，任選被下述基團(tuán)取代：羥基、C15-19鏈烯基、C1-12烷基-OC(O)-C5-20烷基、C1-12烷基-C(O)O-C5-20烷基和R3選自：C4-22烷基、C12-22鏈烯基、其它適宜的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括式(IV)的那些或其鹽:其它適宜的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括式(V)的那些:其它適宜的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括式(III)至式(V)的那些，其中R2選自：其它適宜的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括式(III)至式(V)的那些，其中R2為：其它適宜的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括式(III)至式(V)的那些，其中所述化合物具有式(VI):其它適宜的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括式(III)至式(VI)的那些，其中R3選自：其它適宜的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括式(III)至式(VI)的那些，其中R3為其它適宜的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括式(III)至式(VI)的那些，其中R3為其它適宜的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括式(III)至式(VI)的那些，其中所述化合物具有式(VII):其它適宜的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括式(III)至式(VII)的那些，其中所述化合物具有式(VIII):其它適宜的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括式(III)至式(VIII)的那些，其中所述化合物具有式(IX):其它適宜的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括式(III)至式(IX)的那些，其中R1選自:其它適宜的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括式(III)至式(IX)的那些，其中R1為其它適宜的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括式(III)至式(IX)的那些，其中R1為其它適宜的陽(yáng)離子脂質(zhì)選自：二辛酸2-(10-十二烷基-3-乙基-8,14-二氧代-7,9,13-三氧雜-3-氮雜十八烷-18-基)丙烷-1,3-二基酯；二辛酸2-(9-十二烷基-2-甲基-7,13-二氧代-6,8,12-三氧雜-2-氮雜十七烷-17-基)丙烷-1,3-二基酯；二辛酸2-(9-十二烷基-2-甲基-7,13-二氧代-6,8,12-三氧雜-2-氮雜十五烷-15-基)丙烷-1,3-二基酯；二辛酸2-(10-十二烷基-3-乙基-8,14-二氧代-7,9,13-三氧雜-3-氮雜十六烷-16-基)丙烷-1,3-二基酯；二辛酸2-(8-十二烷基-2-甲基-6,12-二氧代-5,7,11-三氧雜-2-氮雜十七烷-17-基)丙烷-1,3-二基酯；二辛酸2-(10-十二烷基-3-乙基-8,14-二氧代-7,9,13-三氧雜-3-氮雜十九烷-19-基)丙烷-1,3-二基酯；二辛酸2-(9-十二烷基-2-甲基-7,13-二氧代-6,8,12-三氧雜-2-氮雜十八烷-18-基)丙烷-1,3-二基酯；二辛酸2-(8-十二烷基-2-甲基-6,12-二氧代-5,7,11-三氧雜-2-氮雜十八烷-18-基)丙烷-1,3-二基酯；二辛酸2-(10-十二烷基-3-乙基-8,14-二氧代-7,9,13-三氧雜-3-氮雜二十烷-20-基)丙烷-1,3-二基酯；二辛酸2-(9-十二烷基-2-甲基-7,13-二氧代-6,8,12-三氧雜-2--氮雜十九烷-19-基)丙烷-1,3-二基酯；4,4-雙(辛氧基)丁酸3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；4,4-雙((2-乙基己基)氧基)丁酸3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；4,4-雙((2-丙基戊基)氧基)丁酸3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；4,4-雙((2-丙基戊基)氧基)丁酸3-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；4,4-雙((2-丙基戊基)氧基)丁酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；6,6-雙(辛氧基)己酸3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；6,6-雙(己氧基)己酸3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；6,6-雙((2-乙基己基)氧基)己酸3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；8,8-雙(己氧基)辛酸3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；8,8-二丁氧基辛酸3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；8,8-雙((2-丙基戊基)氧基)辛酸3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；8,8-雙((2-丙基戊基)氧基)辛酸3-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；8,8-雙((2-丙基戊基)氧基)辛酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；3-辛基十一酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；3-辛基十一碳-2-烯酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；7-己基十三碳-6-烯酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；9-戊基十四烷酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；9-戊基十四碳-8-烯酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；5-庚基十二烷酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；5-庚基十二烷酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十三烷基酯；5-庚基十二烷酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十一烷基酯；琥珀酸1,3-雙(辛酰氧基)丙-2-基酯(3-(((2-(二甲基氨基)乙氧基)羰基)氧基)十五烷基)酯；琥珀酸1,3-雙(辛酰氧基)丙-2-基酯(3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基)酯；癸二酸1-(3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基)酯10-辛基酯；癸二酸1-(3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基)酯10-辛基酯；癸二酸1-(3-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基)酯10-辛基酯；癸二酸1-(3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基)酯10-(2-乙基己基)酯；癸二酸1-(3-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基)酯10-(2-乙基己基)酯；10-(辛酰氧基)癸酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；癸酸8-十二烷基-2-甲基-6,12-二氧代-5,7,11-三氧雜-2-氮雜十九烷-19-基酯；10-(辛酰氧基)癸酸3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；10-(辛酰氧基)癸酸3-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-(((2-(二甲基氨基)乙氧基)羰基)氧基)十五烷基酯；1,4-二甲基哌啶-4-甲酸1-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯?；趸?十五烷-3-基酯；4,4-雙((2-乙基己基)氧基)丁酸2-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十四烷基酯；十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-(12Z,15Z)-3-((3-(二甲基氨基)丙?；?氧基)二十一碳-12,15-二烯-1-基酯；3-辛基十一酸(12Z,15Z)-3-((4-(二甲基氨基)丁?；?氧基)二十一碳-12,15-二烯-1-基酯；5-庚基十二烷酸(12Z,15Z)-3-((4-(二甲基氨基)丁?；?氧基)二十一碳-12,15-二烯-1-基酯；7-己基十三烷酸(12Z,15Z)-3-((4-(二甲基氨基)丁?；?氧基)二十一碳-12,15-二烯-1-基酯；9-戊基十四酸(12Z,15Z)-3-((4-(二甲基氨基)丁?；?氧基)二十一碳-12,15-二烯-1-基酯；3-(二甲基氨基)丙酸(12Z,15Z)-1-((((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基)羰基)氧基)二十一碳-12,15-二烯-3-基酯；2,2-雙(庚氧基)乙酸(13Z,16Z)-4-(((2-(二甲基氨基)乙氧基)羰基)氧基)二十二碳-13,16-二烯-1-基酯；2,2-雙(庚氧基)乙酸(13Z,16Z)-4-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)二十二碳-13,16-二烯-1-基酯；3-((3-乙基-10-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)-8,15-二氧代-7,9,14-三氧雜-3-氮雜十七烷-17-基)二硫基)丙酸2,2-雙(庚氧基)乙基酯；琥珀酸(13Z,16Z)-4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)二十二碳-13,16-二烯-1-基酯十七碳-9-基酯；十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-2-(((11Z,14Z)-2-((3-(二甲基氨基)丙酰基)氧基)二十碳-11,14-二烯-1-基)氧基)乙基酯；十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-13-(辛酰氧基)十三烷基酯；3-辛基十一烷酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-13-(辛酰氧基)十三烷基酯；5-庚基十二烷酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-13-羥基十三烷基酯；5-庚基十二烷酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-13-(辛酰氧基)十三烷基酯；7-己基十三烷酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-13-(辛酰氧基)十三烷基酯；9-戊基十四烷酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-13-羥基十三烷基酯；9-戊基十四烷酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-13-(辛酰氧基)十三烷基酯；癸二酸1-(3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-13-(辛酰氧基)十三烷基)酯10-辛基酯；10-(辛酰氧基)癸酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-13-(辛酰氧基)十三烷基酯；十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-5-辛基十三烷基酯；癸酸3-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-5-辛基十三烷基酯；辛酸5-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-7-辛基十五烷基酯；十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-5-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-7-辛基十五烷基酯；辛酸9-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-11-辛基十九烷基酯；癸酸9-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-11-辛基十九烷基酯；十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-9-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十九烷基酯；己酸9-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十九烷基酯；3-辛基十一烷酸9-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十九烷基酯；己酸9-((4-(二甲基氨基)丁?；?氧基)十九烷基酯；3-辛基十一烷酸9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十九烷基酯；雙(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷酰基)氧基)丙烷-1,3-二基酯；雙(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((4-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷?；?氧基)丙烷-1,3-二基酯；雙(十八碳-9,12,15三烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z,15Z,15'Z)-2-((4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷?；?氧基)丙烷-1,3-二基酯；二油酸(Z)-2-((4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷?；?氧基)丙烷-1,3-二基酯；雙十四酸烷2-((4-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷酰基)氧基)丙烷-1,3-二基酯；雙十四烷酸2-((4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷酰基)氧基)丙烷-1,3-二基酯；雙十四烷酸2-((4-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷?；?氧基)丙烷-1,3-二基酯；雙十二烷酸2-((4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷?；?氧基)丙烷-1,3-二基酯；雙十二烷酸2-((4-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷?；?氧基)丙烷-1,3-二基酯；雙十二烷酸2-((4-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷酰基)氧基)丙烷-1,3-二基酯；雙(癸酸)2-((4-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷?；?氧基)丙烷-1,3-二基酯；雙(癸酸)2-((4-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷酰基)氧基)丙烷-1,3-二基酯；二辛酸2-((4-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷酰基)氧基)丙烷-1,3-二基酯；二辛酸2-((4-(((3-(乙基(甲基)氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷?；?氧基)丙烷-1,3-二基酯；二辛酸2-(((13Z,16Z)-4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)二十二碳-13,16-二烯?；?氧基)丙烷-1,3-二基酯；二辛酸2-(((13Z,16Z)-4-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)二十二碳-13,16-二烯?；?氧基)丙烷-1,3-二基酯；雙(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((2-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十四烷?；?氧基)丙烷-1,3-二基酯；雙(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((2-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十二烷酰基)氧基)丙烷-1,3-二基酯；雙(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((2-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十四烷?；?氧基)丙烷-1,3-二基酯；雙(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-((2-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十二烷?；?氧基)丙烷-1,3-二基酯；二辛酸2-((2-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十四烷?；?氧基)丙烷-1,3-二基酯；4-(((3-(二甲基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六烷酸4,4-雙(辛氧基)丁基酯；2-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)十二烷酸4,4-雙(辛氧基)丁基酯；十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-10-十二烷基-3-乙基-14-(2-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酰氧基)乙基)-8,13-二氧代-7,9-二氧雜-3,14-二氮雜十六烷-16-基酯；二辛酸2-((4-(((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)-11-(辛酰氧基)十一烷?；?氧基)丙烷-1,3-二基酯；和雙(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(9-十二烷基-2-甲基-7,12-二氧代-6,8,13-三氧雜-2-氮雜十四烷-14-基)丙烷-1,3-二基酯。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“烷基”指具有指定碳原子數(shù)的完全飽和的支鏈或非支鏈烴鏈。例如，C1-8烷基指具有1至8個(gè)碳原子的烷基。例如，C4-22烷基指具有4至22個(gè)碳原子的烷基。例如，C6-10烷基指具有6至10個(gè)碳原子的烷基。例如，C12-22烷基指具有12至22個(gè)碳原子的烷基。烷基的代表性實(shí)例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基、正十二烷基、正十三烷基、9-甲基十七烷基、1-庚基癸基、2-辛基癸基、6-己基十二烷基、4-庚基十一烷基等。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“亞烷基”指二價(jià)的如上文定義的烷基。亞烷基的代表性實(shí)例包括但不限于亞甲基、亞乙基、正亞丙基、異亞丙基、正亞丁基、仲亞丁基、異亞丁基、叔亞丁基、正亞戊基、異亞戊基、新亞戊基、正亞己基、3-甲基亞己基、2,2-二甲基亞戊基、2,3-二甲基亞戊基、正亞庚基、正亞辛基、正亞壬基、正亞癸基等。如本文所用的“鏈烯基”指具有指定碳原子數(shù)并且在鏈中具有一條或多條碳-碳雙鍵的不飽和支鏈或非支鏈烴鏈。例如，C12-22鏈烯基指具有12至22個(gè)碳原子并且在鏈中具有一條或多條碳-碳雙鍵的鏈烯基。在某些實(shí)施方案中，鏈烯基在鏈中具有一條碳-碳雙鍵。在其它實(shí)施方案中，鏈烯基在鏈中具有多于一條的碳-碳雙鍵。鏈烯基可以任選被一個(gè)或多個(gè)如式(I)或(III)中定義的取代基取代。鏈烯基的代表性實(shí)例包括但不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基等。鏈烯基的其它實(shí)例包括但不限于：Z-十八碳-9-烯基、Z-十一碳-7-烯基、Z-十七碳-8-烯基、(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基、(8Z,11Z)-十七碳-8,11-二烯基、(8Z,11Z,14Z)-十七碳-8,11,14-三烯基、亞麻基(linolenyl)、2-辛基癸-1-烯基、亞油基(linoleyl)和油基。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“亞烯基”指二價(jià)的如上文定義的鏈烯基基團(tuán)。亞烯基的代表性實(shí)例包括但不限于亞乙烯基、亞丙烯基、亞丁烯基、亞戊烯基、亞己烯基等。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“烷氧基”指通過(guò)氧橋連接的任意烷基部分(即-O-C1-3烷基，其中C1-3烷基如本文定義)。這類(lèi)基團(tuán)的實(shí)例包括但不限于甲氧基、乙氧基和丙氧基。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“環(huán)烷基”指具有指定碳原子數(shù)的飽和單環(huán)、二環(huán)或三環(huán)烴環(huán)。例如，C3-7環(huán)烷基指具有3至7個(gè)碳原子的環(huán)烷基環(huán)。環(huán)烷基可以任選被一個(gè)或多個(gè)如式(I)中定義的取代基取代。環(huán)烷基的代表性實(shí)例包括但不限于環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、二環(huán)[2.1.1]己基、二環(huán)[2.2.1]庚基、金剛烷基等。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“鹵素”指氟、氯、溴和碘。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)”指含有1至4個(gè)雜原子的4至12元飽和或不飽和單環(huán)或雙環(huán)。雜環(huán)環(huán)系不是芳香性的。含有一個(gè)以上雜原子的雜環(huán)基團(tuán)可含有不同的雜原子。雜環(huán)基團(tuán)是單環(huán)、螺環(huán)或者稠合或橋連的雙環(huán)環(huán)系。單環(huán)雜環(huán)基團(tuán)的實(shí)例包括四氫呋喃基、二氫呋喃基、1,4-二噁烷基、嗎啉基、1,4-二噻烷基、氮雜環(huán)丁烷基、哌嗪基、哌啶基、1,3-二氧戊環(huán)基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡咯啉基、吡咯烷基、四氫吡喃基、二氫吡喃基、1,2,3,6-四氫吡啶基、氧硫雜環(huán)戊烷基、二硫雜環(huán)戊烷基、1,3-二噁烷基、1,3-二噻烷基、氧硫雜環(huán)己烷基、硫嗎啉基、1,4,7-三氧雜-10-氮雜環(huán)十二烷基、氮雜環(huán)庚基等。螺雜環(huán)的實(shí)例包括但不限于1,5-二氧雜-9-氮雜螺[5.5]十一烷基、1,4-二氧雜-8-氮雜螺[4.5]癸基、2-氮雜-7-氮雜螺[3.5]壬基等。稠合雜環(huán)環(huán)系具有8至11個(gè)環(huán)原子，并且包括其中雜環(huán)與苯基環(huán)稠合的基團(tuán)。稠合雜環(huán)的實(shí)例包括但不限于十氫喹啉基(decahydroqunilinyl)、(4aS,8aR)-十氫異喹啉基、(4aS,8aS)-十氫異喹啉基、八氫環(huán)戊二烯并[c]吡咯基、異喹啉基(isoinolinyl)、(3aR,7aS)-六氫-[1,3]二氧雜環(huán)戊烯并[4.5-c]吡啶基、八氫-1H-吡咯并[3,4-b]吡啶基、四氫異喹啉基等。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)基C1-8烷基”指通過(guò)單鍵或通過(guò)如上定義的C1-8烷基基團(tuán)連接至分子的其余部分的如上定義的雜環(huán)。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“雜芳基”指包含1、2、3或4個(gè)單獨(dú)地選自氮、氧和硫的雜原子的5-或6-元芳族單環(huán)基團(tuán)。雜芳基基團(tuán)可以經(jīng)由碳原子或雜原子鍵合。雜芳基的實(shí)例包括但不限于呋喃基、吡咯基、噻吩基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、異噻唑基、噁唑基、異噁唑基、三唑基、四唑基、吡嗪基、噠嗪基、嘧啶基或吡啶基。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“雜芳基C1-8烷基”指通過(guò)單鍵或通過(guò)如上定義的C1-8烷基基團(tuán)連接至分子的其余部分的如上定義的雜芳基環(huán)。3.2中性脂質(zhì)適用于本發(fā)明的脂質(zhì)組合物的中性脂質(zhì)包括例如多種中性的不帶電荷或兩性離子性的脂質(zhì)。適用于本發(fā)明的中性磷脂的實(shí)例包括但不限于:5-十七烷基苯-1,3-二醇(間二苯酚)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、磷酸膽堿(DOPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)、磷脂酰膽堿(PLPC)、l,2-二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DAPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、蛋磷脂酰膽堿(EPC)、二月桂酰磷脂酰膽堿(DLPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)、l-肉豆蔻酰基-2-棕櫚?；字Ｄ憠A(MPPC)、l-棕櫚?；?2-肉豆蔻?；字Ｄ憠A(PMPC)、l-棕櫚?；?2-硬脂?；字Ｄ憠A(PSPC)、l,2-二花生酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DBPC)、l-硬脂?；?2-棕櫚?；字Ｄ憠A(SPPC)、l,2-雙二十碳烯?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DEPC)、棕櫚酰油?；字Ｄ憠A(POPC)、溶血磷脂酰膽堿、二油?；字Ｒ掖及?DOPE)、二亞油?；字Ｄ憠A二硬脂?；字Ｒ掖及?DSPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕櫚?；字Ｒ掖及?DPPE)、棕櫚酰基油?；字Ｒ掖及?POPE)、溶血磷脂酰乙醇胺及其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，中性磷脂選自二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)和二肉豆蔻?；字Ｒ掖及?DMPE)。3.3陰離子脂質(zhì)適用于本發(fā)明的陰離子脂質(zhì)包括但不限于磷脂酰甘油、心磷脂、二?；字＝z氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰基磷脂酰乙醇胺、N-丁二酰基磷脂酰乙醇胺、N-戊二?；字Ｒ掖及纺懝檀及腌晁狨?CHEMS)和賴(lài)氨酰基磷脂酰甘油。3.4輔助脂質(zhì)(Helperlipids)輔助脂質(zhì)是以某種程度增強(qiáng)轉(zhuǎn)染(例如，包括生物活性劑的納米粒的轉(zhuǎn)染)的脂質(zhì)。輔助脂質(zhì)增強(qiáng)轉(zhuǎn)染的機(jī)制可包括例如增強(qiáng)顆粒穩(wěn)定性和/或增強(qiáng)膜融合性(fusogenicity)。輔助脂質(zhì)包括類(lèi)固醇和烷基間苯二酚。適用于本發(fā)明的輔助脂質(zhì)包括但不限于膽固醇、5-十七烷基間苯二酚和膽固醇半琥珀酸酯。3.4隱形脂質(zhì)(Stealthlipids)隱形脂質(zhì)是增加納米?？梢泽w內(nèi)(例如在血液中)存在的持續(xù)時(shí)間的脂質(zhì)。適用于本發(fā)明的脂質(zhì)組合物的隱形脂質(zhì)包括但不限于具有與脂質(zhì)部分連接的親水性頭基的隱形脂質(zhì)。這類(lèi)隱形脂質(zhì)的實(shí)例包括式(XI)化合物，如WO2011/076807中所述，或其鹽或可藥用衍生物，其中：Z為選自PEG和基于下述的聚合物的親水性頭基組分：聚(噁唑啉)、聚(環(huán)氧乙烷)、聚(乙烯醇)、聚(甘油)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚[N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺]、多糖和聚(氨基酸)，其中所述聚合物可以是直鏈或支鏈的，并且其中所述聚合物可以任選被取代；其中Z為n個(gè)亞基聚合的；n為在10至200個(gè)Z單元之間的數(shù)均聚合度，其中n對(duì)于不同的聚合物類(lèi)型是優(yōu)化的；L1為任選取代的C1-10亞烷基或C1-10雜亞烷基連接基，其包括醚(例如-O-)、酯(例如-C(O)O-)、琥珀酸酯基(例如-O(O)C-CH2-CH2-C(O)O-))、氨甲酸酯基(例如-OC(O)-NR’-)、碳酸酯基(例如-OC(O)O-)、酮(例如-C-C(O)-C-)、羰基(例如-C(O)-)、脲(例如-NRC(O)NR’-)、胺(例如-NR’-)、酰胺(例如-C(O)NR’-)、亞胺(例如-C(NR’)-)、硫醚(例如-S-)、黃原酸酯基(例如-OC(S)S-)和磷酸二酯(例如-OP(O)2O-)中的零個(gè)、一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)；其任意一者可以被零、一個(gè)或多個(gè)Z基團(tuán)取代；其中R’獨(dú)立地選自-H、NH-、-NH2、-O-、-S-、磷酸酯基或任選取代的C1-10亞烷基；X1和X2獨(dú)立地選自碳或雜原子，所述雜原子選自-NH-、-O-、-S-或磷酸酯基；A1和A2獨(dú)立地選自C6-30烷基、C6-30鏈烯基和C6-30炔基，其中A1和A2可以相同或不同，或其中A1和A2與它們連接的碳原子一起形成任選取代的類(lèi)固醇。具體的隱形脂質(zhì)包括但不限于表1中列舉的那些。表1.隱形脂質(zhì)適用于本發(fā)明的脂質(zhì)組合物的其它隱形脂質(zhì)和關(guān)于這類(lèi)脂質(zhì)的生物化學(xué)的信息可以在Romberg等人,PharmaceuticalResearch,第25卷,第1期,2008,第55-71頁(yè)和Hoekstra等人,BiochimicaetBiophysicaActa1660(2004)41-52中找到。在一個(gè)實(shí)施方案中，適宜的隱形脂質(zhì)包括選自PEG(有時(shí)稱(chēng)為聚(環(huán)氧乙烷))和基于下述的聚合物的集合：聚(噁唑啉)、聚(乙烯醇)、聚(甘油)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚氨基酸和聚[N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺]。其它適宜的PEG脂質(zhì)公開(kāi)在例如WO2006/007712中。特別適宜的隱形脂質(zhì)包括聚乙二醇-二酰甘油或聚乙二醇-二酰甘氨酸酰胺(glycamide)(PEG-DAG)共軛物，包括包含二烷基甘油或二烷基甘氨酸酰胺基團(tuán)、具有獨(dú)立地包含約C4至約C40飽和或不飽和碳原子的烷基鏈長(zhǎng)度的那些。二烷基甘油或二烷基甘氨酸酰胺基團(tuán)可以進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)取代的烷基。在本文描述的任一項(xiàng)實(shí)施方案中，PEG共軛物可以選自PEG-二月桂基甘油、PEG-二肉豆蔻基甘油(PEG-DMG)(目錄號(hào)GM-020，來(lái)自NOF,日本東京)、PEG-二棕櫚?；视汀EG-二硬脂基(disteryl)甘油、PEG-二月桂基甘氨酸酰胺、PEG-二肉豆蔻基甘氨酸酰胺、PEG-二棕櫚?；拾彼狨０泛蚉EG-二硬脂基甘氨酸酰胺、PEG-膽固醇(1-[8’-(膽甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰氨基-3’,6’-二氧雜辛烷基]氨甲?；?[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-雙十四烷氧基芐基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](目錄號(hào)880150P，來(lái)自AvantiPolarLipids,Alabaster,Alabama,USA)。在一個(gè)實(shí)施方案中，隱形脂質(zhì)為S010、S024、S027、S031或S033。在另一個(gè)實(shí)施方案中，隱形脂質(zhì)為S024。除非另有說(shuō)明，否則如本文所用的術(shù)語(yǔ)“PEG”指任何聚乙二醇或其它聚亞烷基醚聚合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，PEG為乙二醇或環(huán)氧乙烷的任選取代的直鏈或支鏈聚合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，PEG為未取代的。在一個(gè)實(shí)施方案中，PEG為取代的，例如被一個(gè)或多個(gè)烷基、烷氧基、酰基、羥基或芳基基團(tuán)取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，該術(shù)語(yǔ)包括PEG共聚物，例如PEG-聚氨酯或PEG-聚丙烯(參見(jiàn)例如J.MiltonHarris,Poly(ethyleneglycol)chemistry:biotechnicalandbiomedicalapplications(1992))；在另一個(gè)實(shí)施方案中，該術(shù)語(yǔ)不包括PEG共聚物。在一個(gè)實(shí)施方案中，PEG具有的分子量為約130至約50,000；在一個(gè)亞實(shí)施方案中，分子量為約150至約30,000；在一個(gè)亞實(shí)施方案中，分子量為約150至約20,000；在一個(gè)亞實(shí)施方案中，分子量為約150至約15,000；在一個(gè)亞實(shí)施方案中，分子量為約150至約10,000；在一個(gè)亞實(shí)施方案中，分子量為約150至約6000；在一個(gè)亞實(shí)施方案中，分子量為約150至約5000；在一個(gè)亞實(shí)施方案中，分子量為150至約4000；在一個(gè)亞實(shí)施方案中，分子量為150至約3000；在一個(gè)亞實(shí)施方案中，分子量為300至約3000；在一個(gè)亞實(shí)施方案中，分子量為約1000至約3000；和在一個(gè)亞實(shí)施方案中，分子量為約1500至約2500。在一些實(shí)施方案中，PEG為“PEG-2K”，也稱(chēng)為“PEG2000”，其具有約2000道爾頓的平均分子量。PEG-2K在本文中由下式(XIIa)表示，其中n為45，表示數(shù)均聚合度包括約45個(gè)亞基。然而，可以使用本領(lǐng)域已知的其它PEG實(shí)施方案，包括例如其中數(shù)均聚合度包括約23個(gè)亞基(n＝23)和/或68個(gè)亞基(n＝68)的那些。用于本發(fā)明的方法的優(yōu)選的式(I)-(IX)化合物為下述實(shí)施例1-36。4.0包封核酸納米?！爸|(zhì)納米粒”指包括多個(gè)(即多于一個(gè))彼此通過(guò)分子間力物理結(jié)合的脂質(zhì)分子的顆粒。脂質(zhì)納米?？梢允抢缥⑶?包括單層和多層囊泡，例如脂質(zhì)體)、乳劑中的分散相、膠束或混懸液中的內(nèi)相。術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)納米粒主體”指多個(gè)彼此通過(guò)分子間力/靜電相互作用物理結(jié)合以包封一個(gè)或多個(gè)核酸分子如siRNA的脂質(zhì)分子。某些實(shí)施方案提供了包封核酸納米粒組合物，其包含可藥用載體和包封核酸納米粒。所述包封核酸納米粒包括脂質(zhì)納米粒主體和被包封在脂質(zhì)納米粒主體中的核酸。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“可藥用載體”指無(wú)毒的惰性稀釋劑?？梢猿洚?dāng)可藥用載體的物質(zhì)包括但不限于無(wú)熱原水、去離子水、等滲鹽水、林格氏溶液和磷酸鹽緩沖液。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，包封核酸納米粒具有約40至約70nm的平均尺寸和小于約0.1的多分散指數(shù)(如通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射、例如采用MalvernZetasizerNanoZS測(cè)定)。脂質(zhì)納米粒主體包含可降解的陽(yáng)離子脂質(zhì)、脂質(zhì)化聚乙二醇、膽固醇和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿組分，如本文在別處所述的。本發(fā)明的實(shí)施方案提供了制備包含陽(yáng)離子脂質(zhì)和其它脂質(zhì)組分的包封核酸納米粒組合物的方法。另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用陽(yáng)離子脂質(zhì)和輔助脂質(zhì)如膽固醇的方法。另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用陽(yáng)離子脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)如膽固醇和中性脂質(zhì)如DSPC的方法。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用陽(yáng)離子脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)如膽固醇、中性脂質(zhì)如DSPC和隱形脂質(zhì)如S010、S024、S027、S031或S033的方法。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了將核酸包封在脂質(zhì)納米粒主體中的方法，其中所述納米粒包含陽(yáng)離子脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)如膽固醇、中性脂質(zhì)如DSPC、隱形脂質(zhì)如S010、S024、S027、S031或S033，并且核酸為例如RNA或DNA。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用陽(yáng)離子脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)如膽固醇、中性脂質(zhì)如DSPC和隱形脂質(zhì)如S010、S024、S027、S031或S033的方法，其中所述核酸為例如mRNA、siRNA或DNA。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，脂質(zhì)溶液/流含有陽(yáng)離子脂質(zhì)化合物、輔助脂質(zhì)(膽固醇)、任選的中性脂質(zhì)(DSPC)和隱形脂質(zhì)(例如S010、S024、S027或S031)。當(dāng)制劑含有四種脂質(zhì)組分時(shí)，脂質(zhì)的摩爾比范圍對(duì)于陽(yáng)離子脂質(zhì)而言可以是20至70摩爾百分比(目標(biāo)是40-60)，輔助脂質(zhì)的摩爾百分比范圍為20至70(目標(biāo)是30至50)，中性脂質(zhì)的摩爾百分比范圍為0-30，PEG脂質(zhì)的摩爾百分比范圍為1至6(目標(biāo)是2至5)。在某些實(shí)施方案中，脂質(zhì)溶液/流含有30-60％的式(III)化合物、30-60％的膽固醇/5-10％的DSPC和1-5％的PEG-DMG、S010、S011或S024。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了采用陽(yáng)離子脂質(zhì)和輔助脂質(zhì)如膽固醇將核酸包封在脂質(zhì)納米粒主體中的方法，其中脂質(zhì)摩爾比為約40-55的陽(yáng)離子脂質(zhì)/約40-55的輔助脂質(zhì)。另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用陽(yáng)離子脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)如膽固醇和中性脂質(zhì)如DSPC的方法，其中脂質(zhì)摩爾比為約40-55的陽(yáng)離子脂質(zhì)/約40-55的輔助脂質(zhì)/約5-15的中性脂質(zhì)。另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用陽(yáng)離子脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)如膽固醇、中性脂質(zhì)如DSPC和隱形脂質(zhì)如S010、S024、S027、S031或S033的方法，其中脂質(zhì)摩爾比為約40-55的陽(yáng)離子脂質(zhì)/約40-55的輔助脂質(zhì)/約5-15的中性脂質(zhì)/約1-10的隱形脂質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了采用陽(yáng)離子脂質(zhì)和輔助脂質(zhì)如膽固醇將核酸包封在脂質(zhì)納米粒主體中的方法，其中脂質(zhì)摩爾比為約40-50的陽(yáng)離子脂質(zhì)/約40-50的輔助脂質(zhì)。另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用陽(yáng)離子脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)如膽固醇和中性脂質(zhì)如DSPC的方法，其中脂質(zhì)摩爾比為約40-50的陽(yáng)離子脂質(zhì)/約40-50的輔助脂質(zhì)/約5-15的中性脂質(zhì)。另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用陽(yáng)離子脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)如膽固醇、中性脂質(zhì)如DSPC和隱形脂質(zhì)如S010、S024、S027、S031或S033的方法，其中脂質(zhì)摩爾比為約40-50的陽(yáng)離子脂質(zhì)/約40-50的輔助脂質(zhì)/約5-15的中性脂質(zhì)/約1-5的隱形脂質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用陽(yáng)離子脂質(zhì)和輔助脂質(zhì)如膽固醇將核酸包封在脂質(zhì)納米粒主體中的方法，其中脂質(zhì)摩爾比為約43-47的陽(yáng)離子脂質(zhì)/約43-47的輔助脂質(zhì)。另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用陽(yáng)離子脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)如膽固醇和中性脂質(zhì)如DSPC的方法，其中脂質(zhì)摩爾比為約43-47的陽(yáng)離子脂質(zhì)/約43-47的輔助脂質(zhì)/約7-12的中性脂質(zhì)。另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用陽(yáng)離子脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)如膽固醇、中性脂質(zhì)如DSPC和隱形脂質(zhì)如S010、S024、S027、S031或S033的方法，其中脂質(zhì)摩爾比為約43-47的陽(yáng)離子脂質(zhì)/約43-47的輔助脂質(zhì)/約7-12的中性脂質(zhì)/約1-4的隱形脂質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用陽(yáng)離子脂質(zhì)和輔助脂質(zhì)如膽固醇將核酸包封在脂質(zhì)納米粒主體中的方法，其中脂質(zhì)摩爾比為約45％的陽(yáng)離子脂質(zhì)和約44％的輔助脂質(zhì)。另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用陽(yáng)離子脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)如膽固醇和中性脂質(zhì)如DSPC的方法，其中脂質(zhì)摩爾比為約45％的陽(yáng)離子脂質(zhì)、約44％的輔助脂質(zhì)和約9％的中性脂質(zhì)。另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用陽(yáng)離子脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)如膽固醇、中性脂質(zhì)如DSPC和隱形脂質(zhì)如S010、S024、S027、S031或S033的方法，其中脂質(zhì)摩爾比為約45％的陽(yáng)離子脂質(zhì)、約44％的輔助脂質(zhì)、約9％的中性脂質(zhì)和約2％的隱形脂質(zhì)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了制備包含式(I)化合物和其它一種或多種脂質(zhì)組分的包封核酸納米粒組合物的方法。另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用式(I)化合物和輔助脂質(zhì)如膽固醇的方法。另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用式(I)化合物、輔助脂質(zhì)如膽固醇和中性脂質(zhì)如DSPC的方法。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用式(I)化合物、輔助脂質(zhì)如膽固醇、中性脂質(zhì)如DSPC和隱形脂質(zhì)如S010、S024、S027、S031或S033的方法。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了將核酸包封在脂質(zhì)納米粒主體中的方法，其中所述納米粒包含式(I)化合物、輔助脂質(zhì)如膽固醇、中性脂質(zhì)如DSPC、隱形脂質(zhì)如S010、S024、S027、S031或S033，并且核酸為例如RNA或DNA。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用式(I)化合物、輔助脂質(zhì)如膽固醇、中性脂質(zhì)如DSPC和隱形脂質(zhì)如S010、S024、S027、S031或S033的方法，其中所述核酸為例如mRNA、siRNA或DNA。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用式(I)-(IX)任一者的化合物和輔助脂質(zhì)如膽固醇將核酸包封在脂質(zhì)納米粒主體中的方法，其中脂質(zhì)摩爾比為約40-55的式(I)化合物/約40-55的輔助脂質(zhì)。另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用式(I)-(IX)任一者的化合物、輔助脂質(zhì)如膽固醇和中性脂質(zhì)如DSPC的方法，其中脂質(zhì)摩爾比為約40-55的式(I)-(IX)任一者的化合物/約40-55的輔助脂質(zhì)/約5-15的中性脂質(zhì)。另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用式(I)-(IX)任一者的化合物、輔助脂質(zhì)如膽固醇、中性脂質(zhì)如DSPC和隱形脂質(zhì)如S010、S024、S027、S031或S033的方法，其中脂質(zhì)摩爾比為約40-55的式(I)化合物/約40-55的輔助脂質(zhì)/約5-15的中性脂質(zhì)/約1-10的隱形脂質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用式(I)-(IX)任一者的化合物和輔助脂質(zhì)如膽固醇將核酸包封在脂質(zhì)納米粒主體中的方法，其中脂質(zhì)摩爾比為約40-50的式(I)-(IX)任一者的化合物/約40-50的輔助脂質(zhì)。另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用式(I)-(IX)任一者的化合物、輔助脂質(zhì)如膽固醇和中性脂質(zhì)如DSPC的方法，其中脂質(zhì)摩爾比為約40-50的式(I)-(IX)任一者的化合物/約40-50的輔助脂質(zhì)/約5-15的中性脂質(zhì)。另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用式(I)-(IX)任一者的化合物、輔助脂質(zhì)如膽固醇、中性脂質(zhì)如DSPC和隱形脂質(zhì)如S010、S024、S027、S031或S033的方法，其中脂質(zhì)摩爾比為約40-50的式(I)-(IX)任一者的化合物/約40-50的輔助脂質(zhì)/約5-15的中性脂質(zhì)/約1-5的隱形脂質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用式(I)-(IX)任一者的化合物和輔助脂質(zhì)如膽固醇將核酸包封在脂質(zhì)納米粒主體中的方法，其中脂質(zhì)摩爾比為約43-47的式(I)-(IX)任一者的化合物/約43-47的輔助脂質(zhì)。另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用式(I)-(IX)任一者的化合物、輔助脂質(zhì)如膽固醇和中性脂質(zhì)如DSPC的方法，其中脂質(zhì)摩爾比為約43-47的式(I)-(IX)任一者的化合物/約43-47的輔助脂質(zhì)/約7-12的中性脂質(zhì)。另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用式(I)-(IX)任一者的化合物、輔助脂質(zhì)如膽固醇、中性脂質(zhì)如DSPC和隱形脂質(zhì)如S010、S024、S027、S031或S033的方法，其中脂質(zhì)摩爾比為約43-47的式(I)-(IX)任一者的化合物/約43-47的輔助脂質(zhì)/約7-12的中性脂質(zhì)/約1-4的隱形脂質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用式(I)-(IX)任一者的化合物和輔助脂質(zhì)如膽固醇將核酸包封在脂質(zhì)納米粒主體中的方法，其中脂質(zhì)摩爾比為約45％的式(I)-(IX)任一者的化合物和約44％的輔助脂質(zhì)。另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用式(I)-(IX)任一者的化合物、輔助脂質(zhì)如膽固醇和中性脂質(zhì)如DSPC的方法，其中脂質(zhì)摩爾比為約45％的式(I)-(IX)任一者的化合物、約44％的輔助脂質(zhì)和約9％的中性脂質(zhì)。另一個(gè)實(shí)施方案提供了使用式(I)-(IX)任一者的化合物、輔助脂質(zhì)如膽固醇、中性脂質(zhì)如DSPC和隱形脂質(zhì)如S010、S024、S027、S031或S033的方法，其中脂質(zhì)摩爾比為約45％的式(I)-(IX)任一者的化合物、約44％的輔助脂質(zhì)、約9％的中性脂質(zhì)和約2％的隱形脂質(zhì)。在本發(fā)明的方法中的脂質(zhì):核酸(例如siRNA)的比例可以為約15-20:1(wt/wt)。在某些實(shí)施方案中，脂質(zhì):核酸的比例為約17-19:1。在其它實(shí)施方案中，脂質(zhì):核酸的比例為約18.5:1。通過(guò)本發(fā)明的方法制備的納米粒具有平均直徑和在平均值周?chē)牧６确植?。較窄范圍的粒度對(duì)應(yīng)于更均勻的粒度分布。粒度可以在收集納米粒時(shí)、培養(yǎng)時(shí)間之后或在整個(gè)處理(例如稀釋、過(guò)濾、透析等)納米粒制劑之后測(cè)定。例如，粒度測(cè)定通常在60分鐘培養(yǎng)期之后和/或在整個(gè)樣品處理之后進(jìn)行。平均粒度報(bào)道為Z-均值或數(shù)均值。Z-均值通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射在MalvernZetasizer上測(cè)量。將納米粒樣品稀釋在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，使得計(jì)數(shù)速率為約200-400kcts。數(shù)據(jù)表示為強(qiáng)度測(cè)量值的加權(quán)平均值。動(dòng)態(tài)光散射還提供了多分散指數(shù)(PDI)，其對(duì)粒度分布的寬度進(jìn)行了定量。較大的PDI與較大的粒度分布相關(guān)，反之亦然。在另一方面，數(shù)均值可以通過(guò)在顯微鏡下測(cè)量來(lái)確定。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)本發(fā)明的方法制備的包封核酸納米粒具有約30至約150nm的平均直徑。在其它實(shí)施方案中，顆粒具有約30至約40nm的平均直徑。在其它實(shí)施方案中，顆粒具有約40至約70nm的平均直徑。在其它實(shí)施方案中，顆粒具有約65至約80nm的平均直徑。在其它實(shí)施方案中，顆粒具有約50至約80nm的Z-均值和/或約40至約80nm的數(shù)均值。在其它實(shí)施方案中，顆粒具有約50至約70nm的Z-均值和/或約40至約65nm的數(shù)均值。在其它實(shí)施方案中，顆粒具有約70至約80nm的Z-均值和/或約60至約80nm的數(shù)均值。所獲得的顆粒的具體尺寸可取決于核酸和脂質(zhì)流的線速度、任選稀釋步驟的使用和所用的具體核酸或脂質(zhì)。較大的線速度和保持第一出口溶液中的有機(jī)溶劑濃度＜33％傾向于產(chǎn)生較小的粒度。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)本發(fā)明的方法制備的包封siRNA納米粒具有約30至約150nm的平均直徑。在其它實(shí)施方案中，顆粒具有約30至約40nm的平均直徑。在其它實(shí)施方案中，顆粒具有約40至約70nm的平均直徑。在其它實(shí)施方案中，顆粒具有約65至約80nm的平均直徑。在其它實(shí)施方案中，顆粒具有約50至約80nm的Z-均值和/或約40至約80nm的數(shù)均值。在其它實(shí)施方案中，顆粒具有約50至約70nm的Z-均值和/或約40至約65nm的數(shù)均值。在其它實(shí)施方案中，顆粒具有約70至約80nm的Z-均值和/或約60至約80nm的數(shù)均值。在其它實(shí)施方案中，通過(guò)本發(fā)明的方法制備的包封siRNA納米?？梢跃哂屑s30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75或約80nm的平均直徑。使用動(dòng)態(tài)光散射(例如MalvernZetasizerNanoZS)，多分散指數(shù)(PDI)的范圍可以為0至1.0。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，PDI為小于約0.2。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，PDI為小于約0.1。本發(fā)明的方法可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)將具有預(yù)期pKa范圍的陽(yáng)離子脂質(zhì)、隱形脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)和中性脂質(zhì)合并成制劑而進(jìn)一步優(yōu)化，所述制劑包括例如脂質(zhì)體制劑、脂質(zhì)納米粒(LNP)制劑等，用于遞送至體內(nèi)特定的細(xì)胞和組織。在一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)一步優(yōu)化可以通過(guò)調(diào)節(jié)這些各種類(lèi)型的脂質(zhì)之間的脂質(zhì)摩爾比而獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)一步優(yōu)化可以通過(guò)調(diào)節(jié)預(yù)期粒度、N/P比例和/或加工參數(shù)中的一者或多者而獲得。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的有關(guān)上述實(shí)施方案的各種優(yōu)化技術(shù)被視為是本發(fā)明的一部分。5.0將核酸包封在脂質(zhì)納米粒主體中的方法下述方法可用于制備本發(fā)明的脂質(zhì)納米粒。為了獲得粒度減小和/或增加顆粒中的尺寸均勻性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用下文給出的方法步驟，采用不同組合進(jìn)行試驗(yàn)。另外，技術(shù)人員可以采用超聲處理、過(guò)濾或脂質(zhì)體制劑中使用的其它改變尺寸的技術(shù)。用于制備本發(fā)明的組合物的方法通常包括：提供在第一個(gè)儲(chǔ)器中的包含核酸的水性溶液如檸檬酸鹽緩沖液，提供包含脂質(zhì)的有機(jī)溶液、例如有機(jī)醇如乙醇的第二個(gè)儲(chǔ)器，然后將水性溶液與有機(jī)脂質(zhì)溶液混合。第一個(gè)儲(chǔ)器任選地是與第二個(gè)儲(chǔ)器流體連通的?；旌喜襟E任選地繼之以培養(yǎng)步驟、過(guò)濾或透析步驟以及稀釋和/或濃縮步驟。培養(yǎng)步驟包括使來(lái)自混合步驟的溶液在大約室溫下在容器中靜置約0至約24小時(shí)(優(yōu)選約1小時(shí))，并任選避光保護(hù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，稀釋步驟在培養(yǎng)步驟之后。稀釋步驟可以包括用水性緩沖液(例如檸檬酸鹽緩沖液或純凈水)稀釋?zhuān)缡褂帽醚b置(例如蠕動(dòng)泵)。過(guò)濾步驟可以是超濾或透析。超濾包括濃縮稀釋液，隨后是透濾，例如使用適宜的泵系統(tǒng)(例如泵裝置，如蠕動(dòng)泵或其等同物)連同適宜的超濾膜(例如GEHollow纖維濾芯或其等同物)。透析包括經(jīng)由適宜膜(例如10,000mwc蛇皮膜)的溶劑(緩沖液)交換。在一個(gè)實(shí)施方案中，混合步驟提供了澄清的單相。在一個(gè)實(shí)施方案中，在混合步驟之后，將有機(jī)溶劑除去以提供顆粒的混懸液，其中核酸被脂質(zhì)包封。有機(jī)溶劑的選擇通常將包括考慮溶劑極性以及在顆粒形成后期溶劑除去的容易性。有機(jī)溶劑(也可以用作增溶劑)的量?jī)?yōu)選足以提供核酸和脂質(zhì)的澄清單相混合物。適宜的有機(jī)溶劑包括Strickley,PharmaceuticalRes.(2004),21,201-230所述的用作可注射制劑的助溶劑的那些。例如，有機(jī)溶劑可以選自乙醇、丙二醇、聚乙二醇300、聚乙二醇400、甘油、二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)和二甲亞砜(DMSO)中的一或多種(例如兩種)。優(yōu)選地，有機(jī)溶劑為乙醇。本文公開(kāi)了用于制備本發(fā)明的組合物的儀器。所述儀器通常包括至少一個(gè)容納包含核酸的水性溶液的儲(chǔ)器和另外一個(gè)或多個(gè)容納有機(jī)脂質(zhì)溶液的儲(chǔ)器。所述儀器通常還包括裝配用于將水性溶液和有機(jī)脂質(zhì)溶液泵送到混合區(qū)或混合室中的泵裝置。在某些實(shí)施方案中，所述混合區(qū)或混合室包括交叉連接或其等同物，其使得水性流體流和有機(jī)流體流當(dāng)進(jìn)入交叉連接器時(shí)合并和使得所得的合并的水性溶液和有機(jī)溶液排出交叉連接器進(jìn)入收集儲(chǔ)器或其等同物中。在某些實(shí)施方案中，混合區(qū)或混合室包括T形連接或其等同物，其使得水性流體流和有機(jī)流體流當(dāng)進(jìn)入T形連接器時(shí)合并和使得所得的合并的水性溶液和有機(jī)溶液排出T形連接器進(jìn)入收集儲(chǔ)器或其等同物中。可以通過(guò)參照?qǐng)D2更好地理解本發(fā)明的方法，圖2圖解了在形成包封核酸納米粒的示例性方法中使用的系統(tǒng)。儀器1含有交叉器16，交叉器16具有通道12、22和32，用于分別接收第一核酸流10、第二核酸流20和脂質(zhì)流30。通過(guò)從一個(gè)或多個(gè)含有核酸溶液的儲(chǔ)器和一個(gè)或多個(gè)含有脂質(zhì)溶液的儲(chǔ)器經(jīng)由適宜的管道泵送各個(gè)流，可以將流10、20和30遞送至通道12、22和32(管道和儲(chǔ)器未顯示)。圖2中的通道12、22和32具有近似相等的內(nèi)徑。流10、20和30在交匯點(diǎn)14交匯，形成合并流40。由于交叉器16的幾何形狀，脂質(zhì)流30沿著與核酸流10和20垂直的方向流動(dòng)，所述核酸流10和20以對(duì)著交匯點(diǎn)14彼此相對(duì)約180°的相反方向流動(dòng)。合并流40流過(guò)通道42進(jìn)入加工室70，其本體(72)可以具有比通道42大的直徑。加工室70也可以具有不同長(zhǎng)度。例如，加工室70的長(zhǎng)度可以是通道12、22和32的直徑的約100-2000倍，直徑可以是通道12、22和32的直徑的約4倍。在圖2的實(shí)施方案中，合并流40與通過(guò)通道52進(jìn)入的稀釋流50相交。稀釋流50可以通過(guò)管道從含有稀釋溶液的稀釋儲(chǔ)器遞送。在圖2中，通道52具有與通道12、22和32相比約2倍大的直徑。合并流40和稀釋流50在T形室54中交匯。合并流40和稀釋流50交匯得到的流是含有包封核酸納米粒的第一出口溶液60。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)核酸流中的核酸濃度為約0.1至約1.5mg/mL，并且一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)流中的脂質(zhì)濃度為約10至約25mg/mL。在其它實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)核酸流中的核酸濃度為約0.2至約0.9mg/mL，并且一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)流中的脂質(zhì)濃度為約15至約20mg/mL。在其它實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)核酸流中的核酸濃度為約0.225、0.3、0.33或0.45至約0.675mg/mL，并且一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)流中的脂質(zhì)濃度為約16-18mg/mL。在其它實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)核酸流中的核酸濃度為約0.225、0.3、0.33、0.45或0.675mg/mL，并且一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)流中的脂質(zhì)濃度為約16.7mg/mL。脂質(zhì)流包含一種或多種脂質(zhì)在有機(jī)溶劑中的混合物。一種或多種脂質(zhì)可以是陽(yáng)離子脂質(zhì)、中性脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)和隱形脂質(zhì)的混合物，其各自可以以大約與上文對(duì)最終包封核酸納米粒所述相同的相對(duì)量存在。脂質(zhì)流中所用的有機(jī)溶劑是能夠增溶脂質(zhì)并且與水性介質(zhì)可溶混的有機(jī)溶劑。適宜的有機(jī)溶劑包括乙醇、丙二醇、聚乙二醇300、聚乙二醇400、甘油、二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)和二甲亞砜(DMSO)。優(yōu)選地，有機(jī)溶劑包含約80％或更多的乙醇。優(yōu)選地，有機(jī)溶劑包含約90％或更多的乙醇。更優(yōu)選地，有機(jī)溶劑為乙醇。在一些實(shí)施方案中，脂質(zhì)流包含任選的緩沖溶液，例如檸檬酸鈉緩沖溶液(例如25mm)。核酸流包含適宜核酸在第一水性溶液中的混合物。第一水性溶液可以不包括鹽或可以包括至少一種鹽。例如，第一水性溶液可以包括在沒(méi)有添加鹽的去離子水或蒸餾水中的適宜核酸。在一些實(shí)施方案中，第一水性溶液是包括至少一種鹽如氯化鈉和/或檸檬酸鈉的第一緩沖溶液。在第一水性溶液中，氯化鈉存在的濃度范圍可以為約0至約300mm。在某些實(shí)施方案中，氯化鈉的濃度為約50、66、75、100或150mm。第一水性溶液可以包括濃度為約0mM至約100mm的檸檬酸鈉。第一緩沖溶液優(yōu)選具有約4至約6.5、更優(yōu)選約4.5-5.5的pH。在某些實(shí)施方案中，第一緩沖溶液的pH為約5，并且檸檬酸鈉的濃度為約25mm。在其它實(shí)施方案中，第一緩沖溶液的pH為約6，并且檸檬酸鈉的濃度為約100mm。優(yōu)選地，第一緩沖溶液具有小于陽(yáng)離子脂質(zhì)的pKa的pH。對(duì)于在水性溶液中不包括鹽的本發(fā)明的實(shí)施方案，脂質(zhì)流包括任選的緩沖溶液。在核酸流或脂質(zhì)流中不存在鹽(例如檸檬酸鈉)的情況下，不會(huì)出現(xiàn)包封。其它可能的緩沖液包括但不限于乙酸鈉/乙酸、Na2HPO4/檸檬酸、鄰苯二甲酸氫鉀/氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫二鈉/正磷酸二氫鈉、鄰苯二甲酸氫二鉀/正磷酸二氫鉀、正磷酸二氫鉀/氫氧化鈉。在一些實(shí)施方案中，有機(jī)溶劑包含乙醇，并且第一出口溶液包含約20-25％乙醇、約0.15-0.25mg/mL核酸和約3-4.5mg/mL脂質(zhì)。在其它實(shí)施方案中，有機(jī)溶劑包含乙醇，并且第一出口溶液包含約20％乙醇、約0.15-0.2mg/mL核酸和約3-3.5mg/mL脂質(zhì)。在其它實(shí)施方案中，有機(jī)溶劑包含乙醇，并且第一出口溶液包含約20％乙醇、約0.18mg/mL核酸和約3.3mg/mL脂質(zhì)。在其它實(shí)施方案中，有機(jī)溶劑包含乙醇，并且第一出口溶液包含約25％乙醇、約0.2-0.25mg/mL核酸和約4-4.5mg/mL脂質(zhì)。在其它實(shí)施方案中，有機(jī)溶劑包含乙醇，并且第一出口溶液包含約25％乙醇、約0.23mg/mL核酸和約4.2mg/mL脂質(zhì)。在圖2的一些實(shí)施方案中，核酸流10和20具有約3至約8米/秒的復(fù)合線速度，脂質(zhì)流30具有約1.5至約4.5米/秒的線速度，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約15-20:1，出口溶液60中的有機(jī)溶劑濃度小于33％。在特定實(shí)施方案中，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約15-20:1或約17-19:1，出口溶液60中的有機(jī)溶劑濃度為約20-25％。在其它特定實(shí)施方案中，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約18.5:1，出口溶液60中的有機(jī)溶劑濃度為約25％。應(yīng)當(dāng)理解，從上述范圍中選擇核酸流和脂質(zhì)流的線速度受限于保持如本文定義的脂質(zhì)與核酸比例的要求。因此，為了獲得脂質(zhì)與核酸的目標(biāo)比例，可能有必要調(diào)節(jié)其它參數(shù)(例如核酸濃度(mg/mL))、流速((mL/min)。在圖2的一些實(shí)施方案中，核酸流10和20具有約6至約8米/秒的復(fù)合線速度，脂質(zhì)流30具有約3至約4米/秒的線速度，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約15-20:1，出口溶液60中的有機(jī)溶劑濃度小于33％。在特定實(shí)施方案中，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約15-20:1或約17-19:1，出口溶液60中的有機(jī)溶劑濃度為約20-25％。在其它特定實(shí)施方案中，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約18.5:1，出口溶液60中的有機(jī)溶劑濃度為約25％。在圖2的一些實(shí)施方案中，核酸流10和20具有約6.8米/秒的復(fù)合線速度，脂質(zhì)流30具有約3.4米/秒的線速度，流10/20/30/50各自具有大約相同的流速(mL/min)，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約15-20:1，出口溶液60中的有機(jī)溶劑濃度為約25％。通過(guò)提供大約相同體積的兩個(gè)核酸流、一個(gè)脂質(zhì)流和一個(gè)稀釋流，第一出口溶液中來(lái)自脂質(zhì)流(脂質(zhì)在100％有機(jī)溶劑中)的有機(jī)溶劑的總濃度為約25％。在特定實(shí)施方案中，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約17-19:1。在其它特定實(shí)施方案中，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約18.5:1。在本發(fā)明的典型實(shí)施方案中，核酸流10/20各自可以具有約0.45mg/mL的核酸濃度和3.4米/秒的線速度，脂質(zhì)流30可以具有約16.7mg/mL的總脂質(zhì)濃度和約3.4米/秒的線速度，各個(gè)流的流速大約相等。例如，通道12、22和32可以具有0.5mm的內(nèi)徑，流10、20和30各自具有約40mL/min的流速和約3.4米/秒的相應(yīng)線速度?；蛘撸ǖ?2、22和32可以具有1.0mm的內(nèi)徑，流10、20和30各自具有約160mL/min的流速，同時(shí)相應(yīng)的線速度保持為約3.4米/秒。在進(jìn)一步的供選方案中，通道12、22和32可以具有約2.0mm的內(nèi)徑，流10、20和30各自具有約640mL/min的流速，同時(shí)線速度保持為約3.4米/秒。如前述實(shí)例中顯而易見(jiàn)的，為了保持恒定的線速度，通路和流的直徑增加兩倍要求流速增加4倍。在這些實(shí)例中，稀釋流50具有與物流10、20和30相同的流速，雖然通道52的2倍大的直徑導(dǎo)致在每個(gè)加工規(guī)模下稀釋流的線速度下降50％。已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的方法可以如上所述規(guī)?；瑫r(shí)保持了相同的高的核酸包封度和小且均勻的粒度。合并的核酸流10/20相對(duì)于脂質(zhì)流30的線速度與各個(gè)流中核酸和脂質(zhì)的濃度以及各個(gè)流、包括稀釋流50的流速(mL/min)有關(guān)。然而，核酸和脂質(zhì)的濃度不限于上述給出的特定值，并且可以上調(diào)或下調(diào)，條件是酌情相應(yīng)地調(diào)節(jié)流速以通常保持脂質(zhì):核酸的比例為約15-20:1。例如，為了保持核酸的總遞送恒定，核酸濃度從0.45mg/mL至0.405mg/mL的10％降低將需要流速(mL/min)增加約1.11倍。在保持核酸流的直徑恒定的情況下，流速(mL/min)增加1.11倍也導(dǎo)致線速度(米/秒)增加1.11倍。同樣在保持稀釋流的流速恒定的情況下，出口溶液60中的來(lái)自脂質(zhì)流的有機(jī)溶劑總濃度將降低約23.5％。當(dāng)然，稀釋流50的流速同樣可以降低，以保持有機(jī)溶劑濃度為約25％，如果期望如此的話。最后，核酸濃度足夠地降低且核酸流流速相應(yīng)地增加可以避免需要稀釋流50以保持第一出口溶液60中的有機(jī)溶劑濃度為約25％。相反，可以增加核酸濃度(例如增加至0.9mg/mL)。然而，為了保持有機(jī)溶劑濃度為約25％和脂質(zhì):核酸比例為約15-20:1，這種兩倍增加將需要相應(yīng)地降低核酸流的流速和增加稀釋流的流速。流10、20、30和50的核酸或脂質(zhì)濃度、流速或線速度的進(jìn)一步變化可以根據(jù)前述原理進(jìn)行。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，核酸流10/20和脂質(zhì)流30的流速和/或線速度可以均降低或升高。因此，在保持每個(gè)流的直徑和濃度恒定的情況下，合并的核酸流的線速度可以降低至3.4米/秒且脂質(zhì)流的線速度可以降低至1.7米/秒。在其它實(shí)施方案中，合并的核酸流的速度可以降低至約3米/秒，脂質(zhì)流的速度可以降低至約1.5米/秒。同樣，合并的核酸流的速度可以升高至約14米/秒，且脂質(zhì)流的速度可以升高至約7米/秒。通常，速度范圍的上限僅受到用于泵送流的裝置的機(jī)械限制。非常高的流速/速度可導(dǎo)致引起裝置故障的回壓。通常，圖2的合并的核酸流的速度范圍可以為約3米/秒至約14米/秒，對(duì)于脂質(zhì)流可以為1.5至約4.5米/秒。優(yōu)選地，合并的核酸流的速度為約6-8米/秒，對(duì)于脂質(zhì)流為約3-4米/秒。在一些實(shí)施方案中，合并的核酸流的復(fù)合速度為約6.8米/秒，對(duì)于脂質(zhì)流為約3.4米/秒。在本發(fā)明的的某些實(shí)施方案中，核酸和脂質(zhì)的濃度可以均降低或升高。例如，雖然為了更有效的方法通常期望保持濃度盡可能高，但是降低核酸濃度至約0.045mg/mL和降低脂質(zhì)濃度至約1.67mg/mL是可能的。然而，在更低的濃度下，顆粒聚集往往增加。在圖2的一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)核酸流中的核酸濃度為約0.1至約1.5mg/mL，并且一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)流中的脂質(zhì)濃度為約10至約25mg/mL。在其它實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)核酸流中的核酸濃度為約0.2至約0.9mg/mL，并且一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)流中的脂質(zhì)濃度為約15至約20mg/mL。在其它實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)核酸流中的核酸濃度為約0.225、0.3、0.33或0.45至約0.675mg/mL，并且一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)流中的脂質(zhì)濃度為約16-18mg/mL。在其它實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)核酸流中的核酸濃度為約0.225、0.3、0.33、0.45或0.675mg/mL，并且一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)流中的脂質(zhì)濃度為約16.7mg/mL。通常，較高的核酸濃度需要相應(yīng)地增加來(lái)自稀釋流50的稀釋水平以保持第一出口流60中的核酸濃度處于優(yōu)選范圍(例如，約0.15-0.25mg/mL)。在其它實(shí)施方案中，圖2中的T形連接器可以被交叉器54a(圖2a)替代，從而兩個(gè)稀釋流50a和50b可以與合并流(例如流40)交匯。稀釋流50a和50b通過(guò)交叉器54a的通道52a和52b進(jìn)入。使用兩個(gè)稀釋流而不是單一稀釋流使得合并流40的稀釋因數(shù)更大。所得到的第一出口流60的更大稀釋可以提供稍微更小的粒度。例如，使用上文關(guān)于圖2所述的核酸流/脂質(zhì)流的流速和速度，但是替換以圖2a的交叉器54a，可以使稀釋溶劑的體積加倍。所得到的第一合并流40的更大稀釋產(chǎn)生了具有較低濃度的來(lái)自脂質(zhì)流的有機(jī)溶劑(例如乙醇)的第一出口流60。例如，使用交叉器54a，第一出口溶液中的有機(jī)溶劑濃度可以降低至約20％。在其它方面，采用交叉器54a，與有關(guān)圖2中所述相同，可以改變核酸濃度、脂質(zhì)濃度、流速、速度等。或者，來(lái)自前述實(shí)施方案任一個(gè)的合并流可以在含有與稀釋流50、50a或50b所提供相等的體積的稀釋溶劑的稀釋池中簡(jiǎn)單稀釋。在供選實(shí)施方案中，圖2中的交叉器16可以被如圖3a所示的T-形室86代替。使用室86的方法具有兩個(gè)進(jìn)入通道82和92，用于一個(gè)核酸流80和一個(gè)脂質(zhì)流90。在使用混合室86的方法中，核酸流和脂質(zhì)流具有彼此相對(duì)約180°的相反流向。采用室86，單個(gè)核酸流的流速和速度可以是脂質(zhì)流的兩倍，以保持采用交叉器16(利用兩個(gè)核酸流)可以獲得的相同的脂質(zhì):核酸比例。例如，在采用T形室86(例如0.5mm直徑的通道82和92)的一個(gè)實(shí)施方案中，具有約0.45mg/mL核酸的核酸流可以具有約80mL/min的流速和6.8米/秒的線速度，脂質(zhì)流可以具有約16.7mg/mL的濃度和3.4米/秒的線速度。在采用室86的方法中如圖2所示采用流速為40mL/min的稀釋流50導(dǎo)致第一出口溶液中的有機(jī)溶劑濃度為約25％。令人驚奇地，采用T形室86可以獲得與采用交叉器16相同的小粒度和均勻性的有益性質(zhì)。與圖2中單個(gè)核酸流的流速相比，采用T形室86的區(qū)別是核酸流的流速加倍。對(duì)于兩種方法而言，整體的核酸流流速保持相同，因此產(chǎn)生了具有基本等同性質(zhì)的納米粒。在使用T形室86和稀釋流50的一些實(shí)施方案中，核酸流80具有約3至約8米/秒的線速度，脂質(zhì)流90具有約1.5至約4.5米/秒的線速度，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約15-20:1，出口溶液中的有機(jī)溶劑濃度小于33％。在特定實(shí)施方案中，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約15-20:1或約17-19:1，出口溶液中的有機(jī)溶劑濃度為約20-25％。在其它特定實(shí)施方案中，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約18.5:1，出口溶液中的有機(jī)溶劑濃度為約25％。在使用T形室86和稀釋流50的其它實(shí)施方案中，核酸流80具有約6至約8米/秒的線速度，脂質(zhì)流90具有約3至約4米/秒的線速度，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約15-20:1，出口溶液中的有機(jī)溶劑濃度小于33％。在特定實(shí)施方案中，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約15-20:1或約17-19:1，出口溶液中的有機(jī)溶劑濃度為約20-25％。在其它特定實(shí)施方案中，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約18.5:1，出口溶液中的有機(jī)溶劑濃度為約25％。在使用T形室86和稀釋流50的一個(gè)實(shí)施方案中，核酸流80具有約6.8米/秒的線速度，脂質(zhì)流90具有約3.4米/秒的線速度，流80的流速(mL/min)是流90和稀釋流50的兩倍，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約15-20:1，出口溶液中的有機(jī)溶劑濃度為約25％。在特定實(shí)施方案中，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約17-19:1。在其它特定實(shí)施方案中，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約18.5:1。在使用T形室86而沒(méi)有稀釋流50的一些實(shí)施方案中，核酸流80具有約8至約14米/秒的線速度，脂質(zhì)流90具有約1.5至約4.5米/秒的線速度，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約15-20:1，出口溶液中的有機(jī)溶劑濃度小于33％。在特定實(shí)施方案中，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約15-20:1或約17-19:1，出口溶液中的有機(jī)溶劑濃度為約20-25％。在其它特定實(shí)施方案中，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約18.5:1，出口溶液中的有機(jī)溶劑濃度為約20或25％。在使用T形室86沒(méi)有稀釋流50的其它實(shí)施方案中，核酸流80具有約9至約11米/秒的線速度，脂質(zhì)流90具有約3至約4米/秒的線速度，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約15-20:1，出口溶液中的有機(jī)溶劑濃度小于33％。在特定實(shí)施方案中，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約15-20:1或約17-19:1，出口溶液中的有機(jī)溶劑濃度為約20-25％。在其它特定實(shí)施方案中，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約18.5:1，出口溶液中的有機(jī)溶劑濃度為約25％。在使用T形室86而沒(méi)有稀釋流50的一個(gè)實(shí)施方案中，核酸流80具有約10.2米/秒的線速度，脂質(zhì)流90具有約3.4米/秒的線速度，流80的流速(mL/min)為流90的三倍，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約15-20:1，出口溶液中的有機(jī)溶劑濃度為約25％。在特定實(shí)施方案中，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約17-19:1。在其它特定實(shí)施方案中，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約18.5:1。在使用T形室86而沒(méi)有稀釋流50的其它實(shí)施方案中，核酸流80具有約11至約14米/秒的線速度，脂質(zhì)流90具有約3至約4米/秒的線速度，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約15-20:1，出口溶液中的有機(jī)溶劑濃度小于33％。在特定實(shí)施方案中，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約15-20:1或約17-19:1，出口溶液中的有機(jī)溶劑濃度為約20-20％。在其它特定實(shí)施方案中，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約18.5:1，出口溶液中的有機(jī)溶劑濃度為約20％。在使用T形室86而沒(méi)有稀釋流50的一個(gè)實(shí)施方案中，核酸流80具有約13.6米/秒的線速度，脂質(zhì)流90具有約3.4米/秒的線速度，流80的流速(mL/min)是流90的四倍，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約15-20:1，出口溶液中的有機(jī)溶劑濃度為約20％。在特定實(shí)施方案中，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約17-19:1。在其它特定實(shí)施方案中，脂質(zhì):核酸的質(zhì)量比為約18.5:1。如上文關(guān)于圖2所述，采用T形室86，核酸流80和脂質(zhì)物流90的比例、濃度、流速和線速度可以類(lèi)似地變化。特別地，上文關(guān)于圖2所述的核酸濃度、脂質(zhì)濃度和乙醇濃度也可用于采用T形室86的本發(fā)明的實(shí)施方案。在一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，核酸濃度可以減小三分之一(例如從0.45減小至0.3mg/mL)，并且核酸流的流速增加50％(例如從80mL/min增加至120mL/min)，以保持相同的核酸總遞送(約36mg/min)。線速度將類(lèi)似地增加至約10.2米/秒。由于核酸流的更大稀釋?zhuān)跊](méi)有使用補(bǔ)充性稀釋流的情況下可以獲得出口溶液中約25％的有機(jī)溶劑濃度。通過(guò)進(jìn)一步增加核酸流流速至160mL/min(對(duì)于0.5mm流，速度為13.6米/秒)，出口溶液中的有機(jī)溶劑濃度減小至約20％。在后一方法中，核酸流的速度可以減小至約6.8米/秒，并且脂質(zhì)流的速度減小至約1.7米/秒，粒度和均勻性沒(méi)有顯著變化。雖然圖2和3以及上文概述的各種核酸、脂質(zhì)和稀釋流以直角或正面交匯，但是這些角度不是重要的。例如，圖3中的T形室86可以被Y-形室84(圖3b)替代?；蛘?，T形室的方向可以如室94(圖3c)所示進(jìn)行旋轉(zhuǎn)。雖然圖3c顯示核酸流80與脂質(zhì)流90的順流交匯，但是在圖3c中核酸和脂質(zhì)流的位置可以反過(guò)來(lái)。在其它實(shí)施方案中，核酸和脂質(zhì)流的數(shù)量可以進(jìn)一步改變，同時(shí)適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)濃度和流速。例如，采用適宜的裝置，2、3或4個(gè)脂質(zhì)流可以與1、2、3或4個(gè)核酸流合并。本文所述的本發(fā)明的方法提供了高的核酸包封率。通常，包封率>70％。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，75％或更多的核酸被包封。在其它實(shí)施方案中，80％或85％的核酸被包封。在其它的實(shí)施方案中，90％或更多的核酸被包封。在其它實(shí)施方案中，約91、約92、約93、約94、約95、約96、約97、約98、約99或約100的核酸被包封。在如本文所述形成包封核酸納米粒之后，可以在室溫下培養(yǎng)第一出口溶液約60分鐘。在培養(yǎng)后，可以將該溶液與第二稀釋溶劑混合，以將第一出口溶液稀釋約2倍，得到第二出口溶液。第二稀釋溶劑可以是第三種緩沖溶液或水。稀釋步驟可以通過(guò)在T連接器如圖3a中的T形室86中將經(jīng)培養(yǎng)的第一出口溶液與第二稀釋溶劑(水)混合來(lái)進(jìn)行。經(jīng)培養(yǎng)的第一出口溶液和第二稀釋溶劑可以以任何適宜的流速或速度、例如約0.5至1米/秒供應(yīng)給T連接器。在稀釋步驟之后，相對(duì)于第一出口溶液，第二出口溶液中的有機(jī)溶劑濃度降低了一半。因此，在某些實(shí)施方案中，第二出口溶液的有機(jī)溶劑(例如乙醇)濃度小于16.5％。在其它實(shí)施方案中，第二出口溶液中的有機(jī)溶劑(例如乙醇)濃度為約10-15％、約10-12.5％、約12.5％或約10％。第二出口溶液可以通過(guò)切向流過(guò)濾進(jìn)行濃縮，并用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)進(jìn)行15X透濾以除去起始緩沖液和乙醇，它們被PBS所替換。在切向流過(guò)濾之后，可以收集濃縮的在PBS中的包封核酸納米粒池，如下述實(shí)施例中更詳細(xì)描述的那樣進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾。通過(guò)前述的額外方法步驟制備的制劑中存在的包封核酸納米?？梢杂?℃穩(wěn)定存儲(chǔ)6個(gè)月以上。根據(jù)本文公開(kāi)的每個(gè)實(shí)施方案，進(jìn)一步的實(shí)施方案是其中核酸為siRNA的實(shí)施方案。例如，根據(jù)本文描述的實(shí)施方案，進(jìn)一步的實(shí)施方案是其中核酸流為包含在緩沖溶液中的一種或多種siRNA分子的混合物且具有本文所公開(kāi)的線速度的siRNA流。6.0方法實(shí)施例6.1siRNA脂質(zhì)制劑通過(guò)圖2-3b概括顯示和上文概述的系統(tǒng)和儀器，通過(guò)將溶于乙醇中的脂質(zhì)溶液與溶于檸檬酸鹽緩沖液中的siRNA混合形成了包封siRNA脂質(zhì)納米粒。使用具有內(nèi)徑為0.5、1.0或2.0mm的通道的混合室。加工室具有50mm至1000mm的長(zhǎng)度。稀釋室的通道的內(nèi)徑等于或至少是約0.5或1.0或2.0或4.0mm的混合室的內(nèi)徑的兩倍。脂質(zhì)溶液含有陽(yáng)離子脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)(膽固醇)、中性脂質(zhì)(DSPC)和隱形脂質(zhì)?？傊|(zhì)濃度為16.7mg/mL或25mg/mL。對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)，總脂質(zhì):siRNA的比例為約18.3:1。siRNA溶液的濃度為在檸檬酸鈉:氯化鈉緩沖液(pH5)中0.225、0.3、0.3375或0.45mg/mL。NaCl的濃度為50mm、66mm、75mm或100mm。流速和線速度如下所述變化。對(duì)于siRNA包封實(shí)驗(yàn)，所用的陽(yáng)離子脂質(zhì)和隱形脂質(zhì)(即PEG脂質(zhì))顯示在下表中。表2這些實(shí)驗(yàn)使用的siRNA具有如下表所示的序列和SEQIDNO.。表36.2方法實(shí)施例1siRNA的包封6.2.1在乙醇中的脂質(zhì)混合物的制備下述是以4.5:1的陽(yáng)離子脂質(zhì)胺比siRNA磷酸鹽(N:P)的摩爾比包封siRNA的實(shí)例。將表4所示量的脂質(zhì)(陽(yáng)離子脂質(zhì)、DSPC、膽固醇和脂質(zhì)化PEG)溶于150mL乙醇中。脂質(zhì)的摩爾比分別為45:9:44:2。將混合物簡(jiǎn)單超聲，然后輕輕振蕩5分鐘，隨后于37℃保持備用。表4脂質(zhì)混合物組分試劑量(mg)MW最終濃度(mM)陽(yáng)離子脂質(zhì)A11315.9732.1512DSPC284790.162.4膽固醇679.5386.6711.7PEG脂質(zhì)B1226.628370.536.2.2siRNASEQIDNO.1在檸檬酸鹽緩沖液中的制備用于siRNA流的緩沖液為pH5的100mm氯化鈉和25mm檸檬酸鈉。檸檬酸鹽緩沖液的pH最初證實(shí)為pH5.00。如果不是，則在進(jìn)行操作之前調(diào)節(jié)pH。將足量的用于包封的在水中的siRNA從-80℃貯存下解凍。將siRNASEQIDNO.1加入到檸檬酸鹽緩沖溶液中，通過(guò)在UV分光光度計(jì)中以260nm的光密度測(cè)量溶解的siRNA的濃度。在無(wú)菌PETG瓶中在150ml檸檬酸鹽緩沖液中將siRNA的終濃度調(diào)節(jié)為0.45mg/mL，于室溫儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?.2.3siRNA在脂質(zhì)納米粒中的包封使用如圖2概括顯示的系統(tǒng)進(jìn)行siRNA包封。向無(wú)菌注射器中裝載相同體積(25ml)的在乙醇中的脂質(zhì)(注射器(a))、在檸檬酸鹽緩沖液中的siRNA(注射器(b1)和(b2))和單獨(dú)的水(注射器(c))。將從在含有16.7mg/mL脂質(zhì)的注射器(a)上的Luer裝置引出的管道連接至具有0.5mm內(nèi)徑的交叉連接器的中心輸入口。將從在含有0.45mg/mLsiRNA的注射器(b1)和(b2)上的Luer裝置引出的管道連接至交叉連接器的側(cè)面輸入口。管道是具有1.55mm內(nèi)徑的氟化乙烯丙烯(FEP)管道。注射器(a)、(b1)和(b2)安裝在注射器泵A上。從脂質(zhì)輸入對(duì)面的交叉器中心輸入引出的管道與具有1mm內(nèi)徑的T形連接器(參見(jiàn)例如圖2，T形連接器54)連接。從在含有單獨(dú)的水的注射器(c)上的Luer裝置引出的管道與T形連接器連接，以能夠在線稀釋siRNA脂質(zhì)納米粒，注射器(c)安裝在注射器泵B上。將來(lái)自T形連接器的輸出線放置在無(wú)菌PETG瓶上用于收集稀釋的siRNA脂質(zhì)納米粒。重要的是確保所有裝置都緊緊地在注射器上。將注射器泵設(shè)置為適當(dāng)?shù)淖⑸淦髦圃焐毯统叽缂?0ml/分鐘的流速。同時(shí)啟動(dòng)兩個(gè)泵，在約0.5秒后開(kāi)始收集材料。收集約90ml的包封siRNA脂質(zhì)納米粒，其含有按體積計(jì)25％的乙醇、0.23mg/mL的siRNA、4.2mg/mL的脂質(zhì)和50mm的NaCl。在60分鐘的混合后培養(yǎng)期之后，使用MalvernZetasizer測(cè)定粒度。6.2.4siRNA脂質(zhì)納米粒的稀釋設(shè)置1.0mm內(nèi)徑的T形連接器用于進(jìn)一步稀釋siRNA脂質(zhì)納米?；鞈乙骸Ｔ撓♂尣襟E采用在一個(gè)注射器泵上的兩個(gè)注射器進(jìn)行。一個(gè)140mL注射器含有siRNA脂質(zhì)納米粒，第二個(gè)140mL注射器含有水。流速設(shè)置為25ml/分鐘。siRNA流和水流以彼此180度的方向進(jìn)入T形連接器。將稀釋的siRNA脂質(zhì)納米粒混懸液收集到無(wú)菌PETG瓶中。最終體積將為約280ml，乙醇濃度為12.5％。6.2.5通過(guò)切向流過(guò)濾對(duì)siRNA脂質(zhì)納米粒進(jìn)行透析和濃縮對(duì)于每50mg的包封運(yùn)行中的siRNA，使用Vivaflow50柱。對(duì)于100mgsiRNA包封運(yùn)行，使用串聯(lián)連接的2個(gè)Vivaflow50柱。再生纖維素柱必須進(jìn)行沖洗以除去來(lái)自制造商的任何貯存溶液。這通過(guò)用500mlDI水填充空的TFF儲(chǔ)器和用蠕動(dòng)泵以115ml/min的流速再循環(huán)來(lái)進(jìn)行。滲透線不應(yīng)當(dāng)受限制，沖洗過(guò)程在全部500ml水沖過(guò)膜后完成。將siRNA脂質(zhì)納米粒混懸液上樣到MinimateTFF儲(chǔ)器中。將混合物濃縮，同時(shí)保持總壓力為20-25psi。在整個(gè)濃縮步驟中，濾液應(yīng)當(dāng)以約4ml/分鐘洗脫。該速率是采用夾管閥限制滲透線直到獲得適當(dāng)?shù)牧魉賮?lái)獲得的。進(jìn)行濃縮直至儲(chǔ)器中的液面處于15ml刻度。將濃縮的siRNA脂質(zhì)納米粒混懸液對(duì)225ml無(wú)熱原、無(wú)核酸酶的1xPBS進(jìn)行透濾。增加流速至80ml/min。透濾后，重新開(kāi)始濃縮該物質(zhì)直至TFF系統(tǒng)的滯留體積。從儲(chǔ)器收集siRNA脂質(zhì)納米?；鞈乙?。能夠用另外2ml1xPBS沖洗TFF系統(tǒng)和收集含有稀釋的siRNA脂質(zhì)納米粒混懸液的該清洗液，但是該清洗液應(yīng)當(dāng)與濃縮的siRNA脂質(zhì)納米粒混懸液分別收集。將物質(zhì)于4℃儲(chǔ)存待分析。6.2.6無(wú)菌過(guò)濾步驟通過(guò)在被置于預(yù)熱至50℃的鋁塊加熱器中10min的玻璃小瓶中加熱約10ml混懸液將siRNA脂質(zhì)納米粒進(jìn)行過(guò)濾。然后，移開(kāi)小瓶，用注射器移出溶液，經(jīng)0.22μmPES針筒式過(guò)濾器直接過(guò)濾入無(wú)菌小瓶中。將最終產(chǎn)品于4℃貯存。6.2.7包封百分比的測(cè)定(SYBRGOLD)為了測(cè)定siRNA配制成脂質(zhì)納米粒的效率，可以通過(guò)測(cè)量sybrgold熒光來(lái)測(cè)定siRNA的包封百分比。當(dāng)與siRNA結(jié)合時(shí)，sybrgold發(fā)出熒光。sybrgold的熒光強(qiáng)度與siRNA的量是成比例的。在PBS中制備約0.9mg/mL的siRNA儲(chǔ)備液的標(biāo)準(zhǔn)溶液。通過(guò)UV測(cè)量檢驗(yàn)siRNA儲(chǔ)備液的濃度。用PBS將siRNA儲(chǔ)備液稀釋至8μg/mL。進(jìn)行系列稀釋以制備4、2、1、0.5和0.25μg/mL的siRNA溶液。通過(guò)將等體積的8μg/mL和4μg/mL溶液混合制備6μg/mL的siRNA。為了制備試驗(yàn)樣品，將10μLsiRNA脂質(zhì)納米?；鞈乙河?90μLPBS稀釋(現(xiàn)在，這是溶液A)。注意：該第一稀釋步驟用于具有～3.6mg/mL或更小的預(yù)期siRNA濃度的制劑。如果該濃度高于～3.6mg/mL，則稀釋?xiě)?yīng)當(dāng)更大。將40uL溶液A用160μLPBS稀釋(現(xiàn)在，這是溶液1)。為了測(cè)量制劑中的游離siRNA，制備sybrgold在PBS中的0.02％溶液(例如3μLsybrgold在15mlPBS中)(溶液2)。在96孔黑色透明底板中，將10μL溶液1與190μL溶液2混合，得到樣品混合物1。在該混合物中，sybrgold僅僅結(jié)合未包封的(即游離的)siRNA。它將不能接近脂質(zhì)體中包封的siRNA。為了測(cè)量制劑中的總siRNA，制備了0.02％sybrgold和0.2％triton-x在PBS中的溶液(例如，3μLsybrgold在15mL0.2％triton在PBS中)(溶液3)。在96孔黑色透明底板中，將10μL溶液1與190μL溶液3混合，得到樣品混合物2。在該混合物中，triton-x破壞了脂質(zhì)體，并使之前被包封的siRNA暴露于sybrgold結(jié)合。因此，sybrgold將結(jié)合未包封的(即游離的)siRNA和所有新暴露出的siRNA。游離的siRNA+新暴露的siRNA＝總siRNA。將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液(各10μL)與190μL溶液2混合以得到標(biāo)準(zhǔn)混合物1，或者與190μL溶液3混合以得到標(biāo)準(zhǔn)混合物2。在SpectraMaxM5分光光度計(jì)上、使用軟件SoftMaxpro5.2及下述參數(shù)測(cè)量了所有混合物的熒光：λex＝485nmλex＝530nm讀數(shù)模式:熒光，頂讀波長(zhǎng):Ex485nm，Em530nm,自動(dòng)切斷開(kāi)啟530nm靈敏度:6個(gè)讀數(shù),PMT:自動(dòng)自動(dòng)混合:之前:關(guān)自動(dòng)校準(zhǔn)：開(kāi)分析板類(lèi)型：96孔costarblk/clrbtm讀取孔：讀取全部板穩(wěn)定時(shí)間:關(guān)列波長(zhǎng)優(yōu)先：列優(yōu)先運(yùn)輸速度:正常自動(dòng)讀數(shù):關(guān)使用從標(biāo)準(zhǔn)混合物1得到的熒光強(qiáng)度值建立游離siRNA的校正曲線。然后，將樣品1混合物的熒光強(qiáng)度代入通過(guò)游離siRNA的校正曲線提供的方程式中。然后，將樣品的實(shí)測(cè)濃度乘以稀釋值，得到脂質(zhì)納米粒制劑中的游離siRNA。使用從標(biāo)準(zhǔn)混合物2得到的熒光強(qiáng)度值建立總siRNA的校正曲線。然后，將樣品2混合物的熒光強(qiáng)度代入通過(guò)總siRNA的校正曲線提供的方程式。然后，將樣品的實(shí)測(cè)濃度乘以稀釋值，得到脂質(zhì)納米粒制劑中的總siRNA。通過(guò)下式計(jì)算包封的siRNA：[(總siRNA-游離siRNA)/(總siRNA)]x100％。6.2.8使用尺寸排阻色譜法(SEC)測(cè)定包封百分比由于游離siRNA的尺寸(5nm)與脂質(zhì)體的尺寸(50-200nm)不同，因此它們?cè)诔叽缗抛柚袑⒃诓煌瑫r(shí)間洗脫。游離siRNA在脂質(zhì)體之后洗脫出。siRNA的保留時(shí)間為～17分鐘，而脂質(zhì)體的保留時(shí)間為～10分鐘。經(jīng)UV檢測(cè)器，在設(shè)定為260nm的吸收波長(zhǎng)進(jìn)行洗脫的siRNA的檢測(cè)。在PBS中制備約0.9mg/mL的siRNA儲(chǔ)備液。向200μL等分試樣的的儲(chǔ)備液中加入10μLTRITONX-100。通過(guò)UV測(cè)量檢驗(yàn)siRNA儲(chǔ)備液的濃度。進(jìn)行系列稀釋以制備siRNA儲(chǔ)備液的1/2、1/4、1/8、1/16和1/32濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將10μLTRITONX-100加入到200μL的各標(biāo)準(zhǔn)溶液中。通過(guò)UV測(cè)量驗(yàn)證各標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度。在HPLC小瓶中，將25μL納米粒制劑加入到185μL1XPBS(10XPBS(FISHER,BP399)用去離子水稀釋至1X)中。將該分散液輕輕渦旋至均勻(分散液1)。在另一個(gè)HPLC小瓶中，將25μL脂質(zhì)納米粒制劑加入到185μL20％TRITONX中。將分散液輕輕渦旋至澄清且均勻(分散液2)。在AGILENT1200HPLC上，使用EMPOWERPRO軟件進(jìn)行尺寸排阻色譜法。參數(shù)為：柱溫:30℃流動(dòng)相流速：:1ml/min，30分鐘UV檢測(cè)器波長(zhǎng):260nm進(jìn)樣體積::20uL進(jìn)樣數(shù)：2將20μL標(biāo)準(zhǔn)溶液和分散液進(jìn)樣到尺寸排阻柱上，流動(dòng)相1xPBS，pH調(diào)節(jié)為7.7，以1mL/min流動(dòng)30分鐘。采用UV檢測(cè)器，用260nm吸收波長(zhǎng)檢測(cè)洗脫的物質(zhì)。對(duì)于siRNA標(biāo)準(zhǔn)溶液，～17分鐘的峰代表siRNA。對(duì)于分散液1，～10分鐘的峰代表含有包封的siRNA的脂質(zhì)納米粒，～17分鐘的峰代表未包封的(即游離的)siRNA。在分散液2中，TRITON-X破壞了脂質(zhì)納米粒，使得之前包封的siRNA在17分鐘與已經(jīng)游離的siRNA一起洗脫出?！?0分鐘的峰消失，色譜圖中僅保留了一個(gè)峰，即～17分鐘的峰，其代表未包封的(即游離的)siRNA和新游離的siRNA。游離的siRNA+新游離的siRNA＝總siRNA。使用從siRNA標(biāo)準(zhǔn)溶液獲得的峰面積值建立siRNA濃度校準(zhǔn)曲線。將分散液1的～17分鐘峰的積分面積代入通過(guò)游離siRNA的校正曲線提供的方程式中，得到分散液中的游離siRNA的濃度。然后，將樣品的實(shí)測(cè)濃度乘以稀釋值，得到脂質(zhì)納米粒制劑中的游離siRNA。將分散液2的～17分鐘峰的積分面積代入通過(guò)游離siRNA的校正曲線提供的方程式中，得到分散液中的總siRNA的濃度。然后，將樣品的實(shí)測(cè)濃度乘以稀釋值，得到脂質(zhì)納米粒制劑中的總siRNA。通過(guò)下式計(jì)算包封的siRNA：[(總siRNA-游離siRNA)/(總siRNA)]x100％。6.2.9顆粒分析使用來(lái)自MalvernInstruments的ZetasizerNanoZS分析siRNA脂質(zhì)納米粒的尺寸和多分散性。對(duì)于包封siRNA濃度＞1mg/mL的配制的siRNA，用115μl1xPBS稀釋5μl樣品。加入到小體積的一次性微量比色杯中。將比色杯插入ZetasizerNanoZS中。對(duì)于機(jī)器設(shè)置，將材料設(shè)置為聚苯乙烯膠乳，分散劑設(shè)置為水，池設(shè)置為ZEN040。在沒(méi)有等待時(shí)間的情況下于25℃測(cè)量樣品。記錄Z-均值(設(shè)置為直徑，納米單位)和多分散指數(shù)(PDI)。表5顯示了使用上述方法對(duì)于siRNA和脂質(zhì)納米粒組合獲得的結(jié)果。使用SEC方法測(cè)定包封百分比。表5.siRNA脂質(zhì)納米粒包封結(jié)果6.3方法實(shí)施例2稀釋的影響使用基本上如圖2所示的系統(tǒng)，將具有濃度0.45mg/mL的siRNASEQIDNO:1、pH5的100mMNaCl和25mM檸檬酸鈉的兩個(gè)核酸水性流從相對(duì)方向引入具有內(nèi)徑0.5mm通道的十字形混合室中，各自流速為40mL/min。同時(shí)，將脂質(zhì)流從與兩個(gè)核酸流垂直的方向引入十字形混合室中，流速為40mL/min。脂質(zhì)流由45％陽(yáng)離子脂質(zhì)A1、44％膽固醇、9％DSPC和2％PEG-脂質(zhì)B1在乙醇中制成。脂質(zhì)的總濃度為16.7mg/mL。在一個(gè)運(yùn)行中，使用類(lèi)似于圖2中的室54的T-形室(內(nèi)徑1.0mm)使來(lái)自十字形混合室的合并流進(jìn)行水稀釋步驟。以40mL/min的速度將水引入到T-形室中。收集得到的溶液，分析包封核酸納米粒的尺寸和均勻性，結(jié)果顯示在表6的項(xiàng)目1中。從項(xiàng)目1獲得的溶液包括按體積計(jì)25％的乙醇、0.23mg/mL的siRNA、4.2mg/mL的脂質(zhì)和50mm的NaCl。在使用相同濃度、流速和初始十字形混合室的單獨(dú)試驗(yàn)中，將來(lái)自混合室的合并流稀釋在與項(xiàng)目1中所用相同的稀釋體積的水中。這些結(jié)果顯示在表6的項(xiàng)目2中。所收集溶液的濃度與項(xiàng)目1中相同。為了對(duì)比，在相同操作條件下進(jìn)行另一次試驗(yàn)，但是沒(méi)有任何稀釋步驟。這些結(jié)果顯示在表6的項(xiàng)目3中。在沒(méi)有任何稀釋步驟下，項(xiàng)目3中的所收集溶液包括33％的乙醇、0.3mg/mL的siRNA、5.6mg/mL的脂質(zhì)和66mM的NaCl。項(xiàng)目1和2的Z-均值、#-均值和PDI小于沒(méi)有進(jìn)行稀釋步驟的項(xiàng)目3。表中的Z-均值、#-均值和PDI是在混合后60分鐘時(shí)測(cè)定的。表6使用如表6項(xiàng)目1所述相同的方法和脂質(zhì)混合物，但是采用siRNASEQIDNO.3，制備了均勻尺寸的脂質(zhì)納米粒，顯示在圖4a中。用圖3a的T-形混合室(內(nèi)徑0.5mm)代替十字形混合室，同時(shí)在流速40mg/mL下升高siRNAID.NO.3的濃度至0.9mg/mL(在一半體積中的相同總量的siRNA)，得到了尺寸較不均勻的脂質(zhì)納米粒，顯示在圖4b中。使用T-形混合室和0.9mg/mL的siRNA的類(lèi)似方法描述在方法實(shí)施例4中。6.4方法實(shí)施例3流速、速度和溶液濃度的影響在使用類(lèi)似于圖3a所示且具有0.5mm內(nèi)徑的T-形混合室的一系列實(shí)驗(yàn)中，將單個(gè)核酸流和單個(gè)脂質(zhì)流以各種流速/速度和濃度混合。核酸和脂質(zhì)流包括如上文方法實(shí)施例2中所述的相同組分。在這些實(shí)施例中沒(méi)有使用任何稀釋步驟，因?yàn)檎{(diào)節(jié)了初始siRNA濃度以獲得與表6項(xiàng)目1相同的最終溶液濃度。在這些實(shí)驗(yàn)中，脂質(zhì)在乙醇中的濃度為16.7mg/mL(1x)或25mg/mL(1.5x)。結(jié)果顯示在下表7中，Z-均值、#-均值和PDI在混合60分鐘后測(cè)定。表76.5方法實(shí)施例4流速和速度的影響在使用類(lèi)似于圖3a(內(nèi)徑0.5mm)中所示和方法實(shí)施例3中使用的T-形混合室的一系列實(shí)驗(yàn)中，將單個(gè)核酸流和單個(gè)脂質(zhì)流以各種流速/線速度從相對(duì)方向混合，然后用水以1mm內(nèi)徑稀釋T形器(如圖2中概述)稀釋。在方法實(shí)施例4中使用上述量的siRNASEQIDNO.4、陽(yáng)離子脂質(zhì)A1、PEG脂質(zhì)B1、膽固醇和DSPC。乙醇流中的脂質(zhì)總濃度為16.7mg/mL。核酸流中的siRNA濃度為0.9mg/mL。表8中的結(jié)果表明，線速度增加減小了粒度和PDI。表86.6方法實(shí)施例5T-形混合室方向的影響表9顯示了使用類(lèi)似于圖3c所示的供選混合室(內(nèi)徑0.5mm)的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。項(xiàng)目1顯示了其中siRNA從支路進(jìn)入獲得的結(jié)果，項(xiàng)目2顯示了其中脂質(zhì)從支路進(jìn)入獲得的結(jié)果。對(duì)于兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，siRNA和脂質(zhì)與上文方法實(shí)施例2中所述的那些相同。siRNA流的流速為120mL/min，脂質(zhì)流的流速為40mL/min。在含有66mMNaCl的緩沖溶液中，siRNA濃度為0.3mg/mL。脂質(zhì)濃度為16.7mg/mL。Z-均值、#-均值和PDI在混合后60分鐘時(shí)測(cè)定。表96.7方法實(shí)施例6混合室配置的影響使用具有不同的核酸和脂質(zhì)流配置的混合室進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)，流的總數(shù)為3至6個(gè)。在每種情況下，混合室具有1mm內(nèi)徑的室，調(diào)節(jié)流速以保持siRNA流的復(fù)合流速為240mL/min和脂質(zhì)流的復(fù)合流速為80mL/min。在這些實(shí)驗(yàn)中，siRNA的濃度為0.3mg/mL，脂質(zhì)的濃度為16.7mg/mL。合并的siRNA流的線速度為5.1米/秒。合并的脂質(zhì)流的線速度為1.7米/秒。當(dāng)流的數(shù)量允許一種以上的流排列時(shí)，表10指出了脂質(zhì)或siRNA流之間的角度。例如，在三個(gè)脂質(zhì)流和三個(gè)siRNA流的情況下，每個(gè)脂質(zhì)流與下一個(gè)脂質(zhì)流間隔60度(即3個(gè)相鄰的脂質(zhì)流)或120度(即脂質(zhì)流間隔120度，介于其間的siRNA流也間隔120度)。對(duì)于表10中概括的試驗(yàn)結(jié)果，使用了siRNASEQIDNO.5與比例為45:9:44:2的陽(yáng)離子脂質(zhì)A4、DSPC、膽固醇和PEG脂質(zhì)B1。表10中顯示的結(jié)果表明，當(dāng)總流速/速度保持恒定時(shí)，不同的混合配置得到了基本相同的結(jié)果。表10.6.8方法實(shí)施例7mRNA的包封6.8.1材料和試劑表11用于瘦蛋白mRNA在脂質(zhì)納米粒中包封的通用材料和試劑TEV-h瘦蛋白-GAopt-2xhBG-120A(SEQIDNO:6)序列特征:煙草蝕紋病毒(TobaccoEtchVirus,TEV)5’UTR:14-154最佳Kozak序列：155-163蛋白質(zhì)登記號(hào)#_NP_000221的編碼人瘦蛋白的氨基酸1-167，由GeneArt優(yōu)化的序列密碼子：164-6642個(gè)終止密碼子：665-670人β-珠蛋白3’UTR的2個(gè)拷貝：689-954120個(gè)核苷酸聚A尾：961-1080GGGAGACGCGUGUUAAAUAACAAAUCUCAACACAACAUAUACAAAACAAACGAAUCUCAAGCAAUCAAGCAUUCUACUUCUAUUGCAGCAAUUUAAAUCAUUUCUUUUAAAGCAAAAGCAAUUUUCUGAAAAUUUUCACCAUUUACGAACGAUAGCCGCCACCAUGCACUGGGGAACCCUGUGCGGAUUCCUGUGGCUGUGGCCCUACCUGUUCUAUGUGCAAGCCGUGCCCAUCCAGAAGGUGCAGGACGACACCAAGACCCUGAUCAAGACCAUCGUGACCCGGAUCAACGACAUCAGCCACACCCAGAGCGUGUCCAGCAAGCAGAAAGUGACCGGCCUGGACUUCAUCCCCGGCCUGCACCCUAUCCUGACCCUGUCCAAGAUGGACCAGACCCUGGCCGUGUACCAGCAGAUCCUGACCAGCAUGCCCAGCCGGAACGUGAUCCAGAUCAGCAACGACCUGGAAAACCUGCGGGACCUGCUGCACGUGCUGGCCUUCAGCAAGAGCUGCCAUCUGCCUUGGGCCAGCGGCCUGGAAACCCUGGAUUCUCUGGGCGGAGUGCUGGAAGCCAGCGGCUACUCUACAGAGGUGGUGGCCCUGAGCAGACUGCAGGGCAGCCUGCAGGAUAUGCUGUGGCAGCUGGAUCUGAGCCCCGGCUGCUAAUAGCGGACCGGCGAUAGAUGAAGCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCCUUUGUUCCCUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUUGAGCAUCUGGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCAGCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCCUUUGUUCCCUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUUGAGCAUCUGGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCGGCCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA.6.8.2在乙醇中的脂質(zhì)混合物的制備下述為以陽(yáng)離子脂質(zhì)胺比mRNA磷酸鹽(N∶P)摩爾比為4∶1包封mRNA的實(shí)例。將脂質(zhì)(陽(yáng)離子脂質(zhì)、DSPC、膽固醇和脂質(zhì)化PEG)溶于乙醇中。脂質(zhì)的摩爾比各自為40:10:48:2。例如，表12是所有組分在脂質(zhì)在乙醇中的63ml體積溶液中的量和最終濃度。63ml體積代表所需提及的1.05x以確?？色@得目標(biāo)體積用于裝載到注射器中。將混合物稱(chēng)重，放入聚乙烯對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(polyethyleneterephthalateglycol,PETG)改性的無(wú)菌125ml瓶中，加入乙醇。將混合物簡(jiǎn)單超聲，然后輕微振蕩5分鐘，隨后保持在37℃?zhèn)溆?。?2脂質(zhì)混合物組分6.8.3mRNA在檸檬酸鹽緩沖液中的制劑首先證實(shí)檸檬酸鹽緩沖液的pH為pH6.00。如果不是，則在進(jìn)行操作之前調(diào)節(jié)pH。將足量的用于包封的在水中的mRNA從-80℃貯存下解凍，通過(guò)使用AmiconUltra-15離心濃縮器從水中交換到檸檬酸鹽緩沖液pH6.0中。每個(gè)濃縮器可以裝入10-12mg的mRNA，將其于4℃以4,000rpm離心5分鐘。通過(guò)加入檸檬酸鹽緩沖液pH6.0使體積增加。為了獲得期望的緩沖條件，推薦用≥10體積的檸檬酸鹽緩沖液pH6.0交換。通過(guò)UV分光光度計(jì)在260nm的光密度測(cè)量mRNA的濃度。在無(wú)菌250mlPETG瓶中，在126ml檸檬酸鹽緩沖液中將mRNA的最終濃度調(diào)節(jié)為0.25mg/mL，于室溫保持備用。126ml體積代表1.05x的所需體積以確?？色@得目標(biāo)體積用于裝入注射器中。6.8.4mRNA在脂質(zhì)納米粒中的包封使用如圖2概括顯示的系統(tǒng)進(jìn)行mRNA包封。向60ml無(wú)菌注射器中裝載相同體積(60ml)的在乙醇中的脂質(zhì)(注射器(a))、在檸檬酸鹽緩沖液中的mRNA(注射器(b1)和(b2))和單獨(dú)的檸檬酸鹽緩沖液(注射器(c))。將從在含有脂質(zhì)的注射器(a)上的Luer裝置引出的管道連接至具有0.5mm內(nèi)徑的交叉連接器的中心輸入口。將從在含有0.25mg/mlmRNA的注射器(b1)和(b2)上的Luer裝置引出的管道連接至交叉連接器的側(cè)面輸入口。管道是具有0.8mm內(nèi)徑的PTFE管道。注射器(a)、(b1)和(b2)安裝在注射器泵A上。從脂質(zhì)輸入對(duì)面的交叉器中心輸入引出的管道與T形連接器(參見(jiàn)例如圖2，T形連接器54)連接。從在含有單獨(dú)的檸檬酸鹽緩沖液的注射器(c)上的Luer裝置引出的管道與T形連接器連接，以能夠在線稀釋mRNA脂質(zhì)納米粒，注射器(c)安裝在注射器泵B上。將來(lái)自T形連接器的輸出線放置在500ml無(wú)菌PETG瓶上用于收集稀釋的mRNA脂質(zhì)納米粒。重要的是確保所有裝置都緊緊地在注射器上。在該尚未優(yōu)化的中間試驗(yàn)中，將注射器泵設(shè)置為適當(dāng)?shù)淖⑸淦髦圃焐毯统叽?BD,Plastipak,60ml)及至多16ml/分鐘的流速。同時(shí)啟動(dòng)兩個(gè)泵，在約0.5秒后開(kāi)始收集材料。將收集約220-230ml的包封mRNA脂質(zhì)納米粒。6.8.5mRNA脂質(zhì)納米粒的稀釋使用140ml注射器抽出135ml的mRNA脂質(zhì)納米?；鞈乙?。將剩余的85-95ml轉(zhuǎn)移到第二個(gè)140ml注射器中。準(zhǔn)備含有相同體積的檸檬酸鹽緩沖液的140ml注射器。將另一個(gè)T形連接器設(shè)置用于mRNA脂質(zhì)納米?；鞈乙旱牧硪淮蜗♂尅Ｔ撓♂尣襟E采用在僅一個(gè)注射器泵上的兩個(gè)注射器進(jìn)行。首先運(yùn)行具有135ml體積的140ml注射器(一個(gè)含有脂質(zhì)納米粒，另一個(gè)含有檸檬酸鹽緩沖液)，其次運(yùn)行具有較小體積的140ml注射器。重要的是確認(rèn)所有裝置都緊緊地在注射器上。對(duì)于第一個(gè)運(yùn)行，改變注射器泵的設(shè)置以校正尺寸和制造商(140ml,Sherwood-Monoject)。流速設(shè)置為25ml/分鐘。將稀釋的mRNA脂質(zhì)納米?；鞈乙菏占?00ml無(wú)菌PETG瓶中。最終體積將為約440-460ml。6.8.6通過(guò)切向流過(guò)濾對(duì)mRNA脂質(zhì)納米粒進(jìn)行透析和濃縮對(duì)于每15mg的包封運(yùn)行中的mRNA，使用Vivaflow50柱。對(duì)于30mgmRNA包封運(yùn)行，使用串聯(lián)連接的2個(gè)Vivaflow50柱。再生纖維素柱必須首先使之無(wú)熱原。該操作應(yīng)當(dāng)在包封前一天開(kāi)始。使用MinimateTFF系統(tǒng)，建立兩個(gè)串聯(lián)的Vivaflow50柱，連接管。將500ml無(wú)熱原、無(wú)核酸酶的水裝入儲(chǔ)器中，以20psi壓力使其通過(guò)柱。將100ml0.1MNaOH/1.0MNaCl裝入儲(chǔ)器，使50ml通過(guò)柱。使其余50ml在柱中靜置過(guò)夜。第二天早晨使剩余的50ml以20psi通過(guò)柱。再將無(wú)熱原、無(wú)核酸酶的水裝入儲(chǔ)器中，使50ml通過(guò)柱。再重復(fù)水洗滌兩次。測(cè)試最后一次水沖洗液等分試樣的內(nèi)毒素，以確保內(nèi)毒素低于可檢測(cè)量。將mRNA脂質(zhì)納米?；鞈乙荷蠘拥組inimateTFF儲(chǔ)器中。將混合物濃縮，同時(shí)保持總壓力為20-25psi。濾液應(yīng)當(dāng)以約4ml/分鐘開(kāi)始洗脫，但是將會(huì)減慢。進(jìn)行濃縮直至儲(chǔ)器中的液面處于40ml刻度。將濃縮的mRNA脂質(zhì)納米粒混懸液對(duì)300ml無(wú)熱原、無(wú)核酸酶的1xPBS進(jìn)行透濾。保持壓力為20-25psi。透濾后，重新開(kāi)始濃縮該物質(zhì)直至恰好低于儲(chǔ)器上的10ml刻度標(biāo)記。從儲(chǔ)器收集mRNA脂質(zhì)納米?；鞈乙?。能夠用另外5ml1xPBS沖洗TFF系統(tǒng)和收集含有稀釋的mRNA脂質(zhì)納米粒混懸液的該清洗液，但是該清洗液應(yīng)當(dāng)與濃縮的mRNA脂質(zhì)納米?；鞈乙悍謩e收集。將物質(zhì)于4℃儲(chǔ)存待分析。6.8.7以384孔板分析測(cè)定包封百分比為了測(cè)定mRNA配制成脂質(zhì)納米粒的效率，使用來(lái)自LifeTechnologies的Quant-ITribogreenRNA分析試劑盒測(cè)量mRNA的包封百分比。將mRNA脂質(zhì)納米?；鞈乙涸跓o(wú)核酸酶的TE緩沖液中分析以測(cè)定脂質(zhì)納米粒外的mRNA的濃度，以及在TE緩沖液+0.75％TritonX-100洗滌劑中分析以分裂脂質(zhì)納米粒和測(cè)定整個(gè)脂質(zhì)納米?；鞈乙褐械膍RNA濃度。使用兩個(gè)濃度的關(guān)系計(jì)算包封百分比。在TE緩沖液和TE緩沖液+0.75％TritonX-100洗滌劑中，由試劑盒中提供的100μg/mL儲(chǔ)備液標(biāo)準(zhǔn)RNA制備了RNA的1000ng/mL溶液。根據(jù)表13，采用該儲(chǔ)備液產(chǎn)生了在TE緩沖液和TE緩沖液+0.75％TritonX-100洗滌劑中的標(biāo)準(zhǔn)曲線。表13用于Quant-ITribogreen分析試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線使用400-2,000倍范圍的稀釋度，小心地制備在TE緩沖液和TE緩沖液+0.75％TritonX-100洗滌劑中的mRNA脂質(zhì)納米粒樣品。對(duì)于兩步稀釋?zhuān)_保在PBS中、而不是在TE或TE+Triton中進(jìn)行第一步。對(duì)于每種緩沖條件下的每種樣品，制備兩組稀釋系列，一式三份測(cè)定每組稀釋系列，對(duì)于每個(gè)緩沖條件每種mRNA脂質(zhì)納米粒樣品總共6個(gè)孔。在96-孔深孔板中制備標(biāo)準(zhǔn)曲線和稀釋的mRNA脂質(zhì)納米粒樣品，確保樣品如它們被制備時(shí)那樣充分混合。可以制備較大體積的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并于4℃在密封96-孔深孔板中貯存至多3天備用。向黑色384孔測(cè)定板(Costar,未經(jīng)處理，#_3573)加入40μl標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品。使用250μl自動(dòng)化多道移液管以抽出85μl標(biāo)準(zhǔn)曲線，將40μl分配到分析板的兩個(gè)孔中。抽出125μl各個(gè)稀釋的mRNA脂質(zhì)納米粒樣品，將40μl分配到分析板的三個(gè)孔中。將試劑盒中的ribogreen試劑以240倍稀釋在TE緩沖液中，向分析板的各孔中加入60μl。使用125μl自動(dòng)化多道移液管以抽出125μl稀釋的ribogreen試劑，將60μl分配在標(biāo)準(zhǔn)曲線的各孔中，使得你改變你在TE和TE+洗滌劑標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品之間的tips。改變每個(gè)稀釋的mRNA脂質(zhì)納米粒樣品之間的tips。通過(guò)上下抽吸混合各孔中的樣品。這可以例如通過(guò)將黑色384-孔分析板放在BiomekFX機(jī)器人上并使用30μlXLtips來(lái)進(jìn)行。在混合后，使用激發(fā)波長(zhǎng)480nm和發(fā)射波長(zhǎng)520nm的熒光微板讀數(shù)器測(cè)量熒光。從每個(gè)RNA樣品的熒光值中減去試劑空白的熒光值，得到TE和TE+TritonX-100條件的熒光相對(duì)于RNA濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。從每個(gè)樣品的熒光值中減去試劑空白的熒光值，然后由適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)曲線確定每個(gè)樣品的RNA濃度。通過(guò)在TE+TritonX-100中的樣品和在單獨(dú)的TE緩沖液中的樣品之間的濃度差除以在TE+TritonX-100洗滌劑中樣品的濃度，確定了樣品的包封百分比。6.8.8顆粒分析使用來(lái)自MalvernInstruments的ZetasizerNanoZS分析mRNA脂質(zhì)納米粒的尺寸和多分散性。對(duì)于包封mRNA濃度＞1mg/mL的配制的mRNA，用115μl1xPBS稀釋5μl樣品。加入到小體積的一次性微量比色杯(Brand，#759200)中。將比色杯插入ZetasizerNanoZS中。對(duì)于機(jī)器設(shè)置，將材料設(shè)置為聚苯乙烯膠乳，分散劑設(shè)置為水，池設(shè)置為ZEN040。在沒(méi)有等待時(shí)間的情況下于25℃測(cè)量樣品。記錄Z-均值(設(shè)置為直徑，納米單位)和多分散指數(shù)(PDI)。表14瘦蛋白mRNA在雙(十八碳-9,12-二烯酸)(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2-(((1,3-二甲基吡咯烷-3-羰基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯中包封的結(jié)果本發(fā)明的實(shí)施例和實(shí)施方案的上述描述在性質(zhì)上僅僅是示例性的，因此，其變化不被認(rèn)為是背離本發(fā)明的宗旨和范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3