本申請要求于2014年7月17日提交的美國臨時專利申請第62/025,844號、于2014年10月3日提交的第62/059,463號以及于2015年1月13日提交的第62/103,002號的優(yōu)先權。依據(jù)35 U.S.C.§119要求優(yōu)先權。通過引證將上述專利申請并入本文，如同在本文中完全闡述一樣。

技術領域

本技術領域總體上涉及傷口治療的領域，并且特別地涉及微凝膠顆粒(microgel particle)和包含該顆粒的支架(scaffold)用于治療和密封傷口以及用于組織填料應用的用途。

背景技術：

與組織的產(chǎn)生和再生有關的中心原理是集體細胞遷移(一種整個細胞網(wǎng)絡一起移動至發(fā)育區(qū)域以促進功能組織形成的過程)。研究人員尋求研發(fā)傷口愈合劑；然而，這些材料表現(xiàn)出批次與批次間的變化性并且表現(xiàn)出降解速率，這限制了對于生長組織的延長的結(jié)構(gòu)支持。合成材料相比天然材料是更加可調(diào)節(jié)的，并且它們的機械性能已設計為允許與廣泛的組織類型一起使用。然而，盡管具有這種可調(diào)節(jié)性，但是合成的可注射生物材料被限制為無孔或納米孔支架(需要物理降解用于細胞通過材料遷移)。含有預形成的微尺度(microscale)的相互連接孔的多孔合成水凝膠允許更大的細胞遷移率而不需要降解，避免了在細胞遷移率和無孔支架固有的材料穩(wěn)定性之間的權衡。孔形成的典型模式包括致去除孔劑的毒性，或包封的微顆粒的降解，這需要這些構(gòu)建體離體澆鑄，防止它們像可注射生物材料一樣與周圍組織無縫整合或需要長期體內(nèi)發(fā)展以解決多孔結(jié)構(gòu)。例如，Healionics公司開發(fā)了自身描述為球形模板神經(jīng)再生(STAR)的技術，其中STAR支架通過將可控尺寸的填充珠(packed bead)陣列燒結(jié)在一起，將聚合物澆鑄到珠之間的間隙空間(interstitial space)中以及溶解掉珠以產(chǎn)生相互連接的球形空隙的孔網(wǎng)絡而形成。然而，如上所述，這些常規(guī)方法需要對致孔劑進行毒性去除。

技術實現(xiàn)要素：

人類皮膚傷口是對于公眾健康和經(jīng)濟的不斷增長的威脅，并且非常難以治療。醫(yī)生在治療皮膚傷口時，設法保持該區(qū)域濕潤，因為干燥傷口愈合比濕潤傷口慢得多。為實現(xiàn)該目的，醫(yī)生經(jīng)常使用軟膏填充傷口，就像用新的瀝青填充坑洞一樣。然而，這些和其他常規(guī)的傷口愈合的方法不能提供使新組織生長的最佳支架。結(jié)果，新的組織生長(如果有的話)相對緩慢和脆弱，導致更長的愈合時間，達到及時的愈合僅是可能的程度。

在工程化組織愈合的背景下，本發(fā)明人已經(jīng)確定相互連接的微孔支架發(fā)展的黃金標準對于與周圍組織的本體整合(大量整合，bulk integration)是必需的，該微孔支架允許相互連接的細胞網(wǎng)絡和集體遷移，而不需要支架降解或侵入性的程序用于植入。事實上，為了最有效，本發(fā)明人已經(jīng)確定這些材料應當促進集體細胞遷移，其介導再生，同時提供促進傷口愈合和小生境識別(niche recognition)的分子線索。此外，本發(fā)明人還確定了這些材料必須能夠通過遷移細胞和天然基質(zhì)無縫替換，提供替換前的穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)支持，并且易于被遞送至損傷部位并順應損傷部位以使纖維化和炎癥反應最小化。

本文提供了實施這些原理的系統(tǒng)、組合物、方法和裝置并且提供了促進組織的快速再生同時維持傷口周圍組織的結(jié)構(gòu)支持的生物材料。實際上，在組織工程領域中，本發(fā)明人已經(jīng)使用可流動或可注射的基于微凝膠、定制材料化學和均勻球形構(gòu)建塊(building block)(包括例如，人類頭發(fā)寬度的構(gòu)建塊)的微流體制造，實現(xiàn)了對長期和未滿足的醫(yī)療需求的解決方案。

本文所描述的技術利用化學來產(chǎn)生微小微凝膠，其可以被組裝成大單元，同時保留用于細胞浸潤的路徑。結(jié)果是微觀合成聚合物體(例如，球體)的填充簇附著在它們表面，類似于粘在一起的一罐口香糖。該填充簇產(chǎn)生填充在傷口中的微孔退火顆粒的支架(例如，多孔凝膠支架)。新組織快速生長至微凝膠顆粒之間的空隙中，并且隨著微凝膠顆粒降解進入體內(nèi)，新生長的組織的基質(zhì)留在傷口曾經(jīng)存在的地方。新組織繼續(xù)生長，直到傷口完全愈合。

本文所描述的微凝膠體系代表了對常規(guī)產(chǎn)品的實質(zhì)性改進。例如，本文中所描述的技術不需要添加生長因子以將細胞吸引到材料中。所描述的微凝膠網(wǎng)絡的幾何形狀誘導細胞遷移到微凝膠中。

本發(fā)明人已經(jīng)證明，所描述的微凝膠可以以先前未見的速率促進新細胞的生長和連接的細胞網(wǎng)絡的形成。例如，在體內(nèi)研究期間，在第一個48小時觀察到顯著的組織再生，與如今所使用的常規(guī)材料相比，在五天內(nèi)具有更多的愈合。

本文所描述的技術可用于廣泛的應用。例如，所公開的微凝膠技術可用于傷口應用，包括急性損傷，如撕裂和手術傷口閉合，以及更多慢性應用，如糖尿病性潰瘍和大面積燒傷傷口。本文中所描述的水凝膠支架也可用于創(chuàng)傷情形，如戰(zhàn)場或急診室。

在某些方面，本文描述了包含微孔凝膠(microporous gel)的系統(tǒng)、組合物、方法和裝置，該微孔凝膠包含含有多個微凝膠顆粒和交聯(lián)劑(crosslinker)的水性溶液，該交聯(lián)劑包括，例如可生物降解交聯(lián)劑。本文所描述的微孔凝膠是可流動的和/或可注射的，并且可以以多種不同的方式施加，包括，例如局部施加，或者通過注射。注射和/或可流動的微孔凝膠可以經(jīng)皮插入或插入至深部組織中?？闪鲃拥奈⒖啄z也可局部給予至真皮和其它組織。

在一方面，當將退火劑(annealing agent)施加至多個微凝膠顆粒時，微凝膠顆粒形成其中具有間隙空間的微凝膠顆粒的共價穩(wěn)定的支架。在某些應用中，系統(tǒng)、組合物、方法和裝置被特別設計用于生物醫(yī)學應用。在一些實施方式中，微孔凝膠顆粒進一步包含交聯(lián)劑，其中該交聯(lián)劑包括基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotease)(MMP)-可降解交聯(lián)劑。在一種或多種實施方式中，退火劑包含因子XIIIa。在進一步的或另外的實施方式中，退火劑包含曙紅Y、自由基轉(zhuǎn)移劑或它們的組合。

在一些實施方式中，微凝膠系統(tǒng)、組合物、方法和裝置進一步包括被配置為照射多個微凝膠顆粒和退火劑的混合物的光源。在一種或多種實施方式中，微孔凝膠顆粒包含暴露至它們的表面上的細胞粘附肽(cell adhesive peptide)。在一些實施方式中，微孔凝膠顆粒包含K-肽。在進一步或另外的實施方式中，微孔凝膠顆粒包含K肽，其含有因子XIIIa識別的賴氨酸基團。在一些實施方式中，微孔凝膠顆粒包含Q-肽。在一些實施方式中，Q肽包含因子XIIIa識別的谷氨酰胺基團。在某些實施方式中，微孔凝膠顆粒包含可降解交聯(lián)劑。在某些實施方式中，微孔凝膠顆粒包含間隙空間，其包含顯示負凹度(negative concavity)的邊界表面。在一種或多種實施方式中，微凝膠顆粒的共價穩(wěn)定的支架具有約10％至約50％的空隙體積(孔隙體積，void volume)。

在一種實施方式中，用于生物醫(yī)學應用的微孔凝膠體系包括含有由可生物降解交聯(lián)劑，如基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-可降解交聯(lián)劑形成的多個微凝膠顆粒的水性溶液以及退火劑，當將該退火劑應用于多個微凝膠顆粒時，導致微凝膠顆粒形成其中具有間隙空間的微凝膠顆粒的共價穩(wěn)定的支架。

在另一種實施方式中，微孔凝膠系統(tǒng)包括遞送裝置和包含在水性溶液中并存儲在遞送裝置中的可生物降解微凝膠顆粒的集合。退火劑或退火劑前體(annealing agent precursor)也存儲在遞送裝置中。取決于所采用的具體實施方式，遞送裝置可以包含單個或多個隔室(compartment)。

在另一種實施方式中，治療組織的方法包括向組織遞送包含用細胞粘附肽修飾的多個微凝膠顆粒的水基溶液(aqueous-based solution)，其中微凝膠顆粒由可生物降解交聯(lián)劑，如基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-可降解交聯(lián)劑形成。將多個微凝膠顆粒暴露至退火劑，該退火劑使微凝膠顆粒退火以形成其中具有間隙空間的微凝膠顆粒的共價穩(wěn)定的支架。

在另一實施方式中，用于生物醫(yī)學應用的微孔凝膠系統(tǒng)包括通過以下各項的反應所形成的微凝膠顆粒的集合：具有一個或多個細胞附著部分(cell attachement moiety)的主鏈聚合物、一種或多種退火組分和可生物降解網(wǎng)絡交聯(lián)劑組分。微孔凝膠系統(tǒng)包括內(nèi)源性或外源性退火劑，其通過退火組分將微凝膠顆粒原位連接在一起，以形成其中具有間隙空間的微凝膠顆粒的共價穩(wěn)定的支架。

在另一方面，本文描述了包括遞送裝置或機構(gòu)和微孔凝膠的系統(tǒng)、組合物、方法和裝置。在某些實施方式中，遞送裝置包含含有多個微凝膠顆粒的水性溶液和退火劑或退火劑前體。在一種或多種實施方式中，遞送裝置包括單隔室遞送裝置(compartment delivery device)，其包含水性溶液(包含多個微凝膠顆粒)和退火劑。在一種或多種實施方式中，遞送裝置包括多個(例如，雙)隔室的遞送裝置，其中一個隔室包含含有多個微凝膠顆粒的水性溶液和第一退火劑前體，并且第二隔室包含含有多個微凝膠顆粒的水性溶液和第二退火劑前體。在某些實施方式中，微孔凝膠進一步包含含有至少一個D-氨基酸的(MMP)-可降解交聯(lián)劑。在進一步或另外的實施方式中，微凝膠顆粒包含含有多個D-氨基酸的(MMP)-可降解交聯(lián)劑。

在又一方面，本文描述了一種微孔凝膠系統(tǒng)，包括：遞送裝置；多個可生物降解微凝膠顆粒，其包含在水性溶液中并存儲在遞送裝置中；和存儲在遞送裝置中的退火劑或退火劑前體。在一種或多種實施方式中，微孔凝膠顆粒進一步包含兩種或更多種類型的可生物降解微凝膠顆粒的集合，其包含在水性溶液中并存儲在遞送裝置中。在某些實施方式中，遞送裝置包括兩個隔室，可生物降解微凝膠顆粒存儲在兩個隔室中的每一個中，并且第一退火劑前體存儲在一個隔室中，以及第二退火劑前體存儲在另一隔室中，其中退火劑是通過存在的第一和第二退火劑前體形成。在一種或多種實施方式中，遞送裝置包括單隔室，并且可生物降解微凝膠顆粒的集合和退火劑都存儲在單隔室中。在又進一步或另外的實施方式中，退火劑包含存儲在單隔室中的光引發(fā)劑和自由基轉(zhuǎn)移劑。在進一步或另外的實施方式中，微孔凝膠系統(tǒng)進一步包含發(fā)光裝置，其配置為照射可生物降解微凝膠顆粒的集合和退火劑的混合物。在某些實施方式中，微凝膠顆粒包含基本上單分散的球體。在一種或多種實施方式中，基本上單分散的球體具有約30微米至約150微米的范圍內(nèi)的直徑。在進一步或另外的實施方式中，微凝膠顆粒在退火后與另一微凝膠顆粒共價連接。

在另一方面，提供了一種治療組織的方法，包括：向組織遞送包含多個微凝膠顆粒的水基溶液；以及將多個微凝膠顆粒暴露至退火劑，該退火劑將微凝膠顆粒退火以形成其中具有間隙空間的微凝膠顆粒的共價穩(wěn)定的支架。在一些實施方式中，多個微凝膠顆粒用細胞粘附肽修飾，并且其中微凝膠顆粒由基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-可降解交聯(lián)劑形成。在一種或多種實施方式中，退火劑被遞送至組織。在一些實施方式中，退火劑存在于組織內(nèi)。在另外的實施方式中，該方法進一步包括通過暴露至光而引發(fā)微凝膠顆粒的退火。在一些實施方式中，光的波長是在可見范圍內(nèi)。在一些實施方式中，光的波長是在紅外范圍內(nèi)。在一種或多種實施方式中，水基溶液和退火劑同時遞送。在一些實施方式中，水基溶液和退火劑順序遞送。在又進一步的或另外的實施方式中，微凝膠顆粒包含治療活性(therapeutically active)的化學化合物(chemical compound)。在某些實施方式中，微凝膠顆粒將該化學化合物暴露或洗脫至組織。在一種或多種實施方式中，該組織包括美容重建的部位、慢性傷口發(fā)展、急性組織損傷或由手術切口引起的組織間隙。在又一另外的實施方式中，(MMP)-可降解交聯(lián)劑包含D-氨基酸。

在另一方面，提供了微孔凝膠系統(tǒng)或裝置，包括微凝膠顆粒的集合，其包含具有一種或多個細胞附著部分的主鏈聚合物、一種或多種退火組分以及一種或多種可生物降解網(wǎng)絡交聯(lián)劑組分；以及內(nèi)源性或外源性退火劑，其通過退火組分將微凝膠顆粒原位連接在一起，以形成其中具有間隙空間的微凝膠顆粒的共價穩(wěn)定的支架。在某些實施方式中，主鏈聚合物包括聚(乙二醇)乙烯基砜。在一種或多種實施方式中，一個或多個細胞附著部分包含RGD肽或其片段、纖連蛋白(fibronectin)或其片段、膠原蛋白或其片段、或者層粘連蛋白(laminin)或其片段。在一些實施方式中，一個或多個細胞附著部分包含RGD肽或其片段。在一種實施方式中，一個或多個細胞附著部分包含SEQ ID NO：3或其片段。在進一步的或另外的實施方式中，一種或多種退火組分包含K-肽和Q-肽。在某些實施方式中，K-肽包含因子XIIIa識別的賴氨酸基團，并且Q-肽包含因子XIIIa識別的谷氨酰胺基團。在一些實施方式中，可生物降解網(wǎng)絡交聯(lián)劑組分包含基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)可降解交聯(lián)劑。在一種或多種實施方式中，(MMP)-可降解交聯(lián)劑包含D-氨基酸。在某些實施方式中，微凝膠顆粒的集合包括兩種或更多種類型的微凝膠顆粒。在一種或多種實施方式中，第一類型的微凝膠顆粒包含含有D-氨基酸的(MMP)-可降解交聯(lián)劑，并且第二類型的微凝膠顆粒包含僅含有L-氨基酸的(MMP)-可降解交聯(lián)劑。在一種或多種實施方式中，系統(tǒng)或裝置包括含有微凝膠顆粒的集合和退火劑的單隔室遞送裝置。在一種或更多種實施方式中，系統(tǒng)或裝置進一步包括雙隔室遞送裝置，其中一個隔室包含含有多個微凝膠顆粒的水性溶液和第一退火劑前體，并且第二隔室包含含有多個微凝膠顆粒的水性溶液和第二退火劑前體，其中退火劑通過存在的第一和第二退火劑前體而形成。

在另一方面，描述了一種治療組織的方法，包括：向組織遞送用細胞粘附肽修飾的微凝膠顆粒的第一層，其中微凝膠顆粒由可生物降解交聯(lián)劑形成；將第一層暴露至退火劑，該退火劑使微凝膠顆粒退火以形成其中具有間隙空間的微凝膠顆粒的共價穩(wěn)定的支架；將用細胞粘附肽修飾的微凝膠顆粒的第二層遞送至組織，其中該微凝膠顆粒由可生物降解交聯(lián)劑形成，并且其中，第二層中的微凝膠顆粒與第一層中的微凝膠顆粒相比，在物理性能或化學組成中的一種上不同；以及將第二層暴露至退火劑，該退火劑退火微凝膠顆粒以形成其中具有間隙空間的微凝膠顆粒的共價穩(wěn)定的支架。在一種或多種實施方式中，第二層中的微凝膠顆粒具有不同的尺寸。在另外的實施方式中，第二層中的微凝膠顆粒具有不同的形狀。在一種或多種實施方式中，第二層中的微凝膠顆粒具有不同的剛度(stiffness)。在某些實施方式中，在第二層中的微凝膠顆粒具有與第一層中的化學組分不同的化學組分。在進一步的或另外的實施方式中，第二層中的微凝膠顆粒具有與第一層中的相同化學組分的不同濃度的化學組分。

在另一方面，提供了治療組織的方法，包括：向組織遞送包含用細胞粘附肽修飾的多個微凝膠顆粒的水基溶液，其中該微凝膠顆粒由可生物降解交聯(lián)劑形成；將該多個微凝膠顆粒暴露至退火劑，該退火劑退火微凝膠顆粒以形成在其中具有間隙空間的微凝膠顆粒的共價穩(wěn)定的支架。

在另一實施方式中，治療組織的方法包括，向組織遞送用細胞粘附肽修飾的微凝膠顆粒的第一層，其中微凝膠顆粒由可生物降解交聯(lián)劑形成。將第一層暴露至退火劑，該退火劑將微凝膠顆粒退火以形成其中具有間隙空間的微凝膠顆粒的共價穩(wěn)定的支架。將用細胞粘附肽修飾的微凝膠顆粒的第二層遞送至組織，其中微凝膠顆粒由可生物降解交聯(lián)劑形成，并且其中第二層中的微凝膠顆粒與第一層中的微凝膠顆粒相比，在物理性質(zhì)或化學組成中的一種上不同。將第二層暴露至退火劑，該退火劑將微凝膠顆粒退火以形成其中具有間隙空間的微凝膠顆粒的共價穩(wěn)定的支架。

在另一實施方式中，治療組織的方法包括，向組織遞送含有用細胞粘附肽修飾的多個微凝膠顆粒的水基溶液，其中微凝膠顆粒由可生物降解交聯(lián)劑形成。將多個微凝膠顆粒暴露至退火劑，該退火劑將微凝膠顆粒退火以形成其中具有間隙空間的微凝膠顆粒的共價穩(wěn)定的支架。

在又另一方面，描述了制備微凝膠顆粒的方法，包括：提供油包水液滴生成微流體裝置(water-in-oil droplet generating microfluidic device)，其具有通向共用通道的多個輸入通道以及與共用通道在下游位置相交的一對油擠壓通道(捏油通道，油捏壓通道，oil-pinching channel)，使含有用寡肽修飾的聚合物主鏈的第一預聚物溶液流入至第一輸入通道；使含有可生物降解交聯(lián)劑的第二溶液流入至第二輸入通道；使油和表面活性劑流入至一對油擠壓通道以形成包含第一預聚物溶液和第二溶液的液滴；以及收集通過該液滴的交聯(lián)形成的微凝膠顆粒。在另一實施方式中，該方法進一步地包括插在第一輸入通道和第二輸入通道之間的第三輸入通道，其中含有預聚物的第三惰性溶液流入至第三輸入通道。在一種或多種實施方式中，該方法進一步包括，用位于該對油擠壓通道與共用通道相交的位置的下游的另外一對包覆通道(sheathing channel)包覆(sheathe)所產(chǎn)生的液滴，其中另外一對包覆通道攜帶油和濃度高于上游的一對油擠壓通道中所包含的表面活性劑的表面活性劑。在一種實施方式中，該方法進一步包括離心所收集的微凝膠顆粒。在另一方面，該方法包括降低離心的微凝膠顆粒的自由水體積含量。在一種或多種實施方式中，該方法包括將所收集的微凝膠顆粒存儲延長的時間段(例如，數(shù)月至數(shù)年)。

在另一種實施方式中，制備微凝膠顆粒的方法包括，提供油包水液滴生成微流體裝置，其具有通向共用通道的多個輸入通道和與共用通道在下游位置相交的一對油擠壓通道。使包含用寡肽修飾的聚合物主鏈的第一預聚物溶液流入至第一輸入通道。使包含可生物降解交聯(lián)劑的第二溶液流入至第二輸入通道。油和表面活性劑流入至該對油擠壓通道中以形成包含第一預聚物溶液和第二溶液的液滴。微凝膠顆粒通過液滴的交聯(lián)形成，然后收集液滴。

從以下詳細描述中，本公開的其他目的、特征和優(yōu)點對于本領域技術人員將變得顯而易見。然而，應當理解，具體實施方式和具體實施例(在示出本公開的一些實施方式的同時)是通過舉例說明而非限制性的方式給出的。在不脫離本公開的精神的情況下，可以在本公開的范圍內(nèi)進行多種改變和修改，并且本公開包括所有這些修改。此外，一種實施方式的方面可以被用于其他的不同的實施方式中。

附圖說明

使用附加權利要求中的特性闡述了本公開的新的性質(zhì)。通過參考說明示例性的實施方式的以下詳細描述(其中使用了本公開的原理)以及以下附圖，將獲得本公開的性質(zhì)和優(yōu)點的更佳理解：

圖1示出了由多個退火的微凝膠顆粒形成的部分支架。

圖2A示出了將微凝膠顆粒注射至傷口部位用于其愈合的示例性的方法。

圖2B示意性示出了不同的微凝膠顆粒(通過微凝膠顆粒表面上的連接基加強的)之間的示例性的退火反應。

圖2C示出了組織浸潤至組織上的遞送部位內(nèi)形成的支架中的示例性的方法，其中，組織和微凝膠之間的邊界表示它們之間的任何界面，其中細胞可以穿過該界面，由組織向內(nèi)移動或者由微凝膠向外移動向組織。

圖3A示出了根據(jù)一種實施方式的微流體裝置的由頂向下的視圖，該裝置用于產(chǎn)生作為微孔凝膠系統(tǒng)的一部分的多個微凝膠顆粒。

圖3B示出了液滴產(chǎn)生區(qū)域和下游的油/表面活性劑擠壓區(qū)域的放大視圖(參見圖3A中的方框區(qū)域)。

圖3C示出了在圖3A中示出的兩個分支通道的放大的透視圖。

圖3D示出了根據(jù)一種實施方式的圖3A的微流體裝置的側(cè)視圖。

圖3E示出了圖3B中所示的方案的實施的簡化的截圖(photograph taken of a reduction)，其中左側(cè)的熒光溶液含有交聯(lián)劑，右側(cè)的熒光溶液含有聚合物和反應緩沖液，并且中間流含有惰性液體溶液以防止在液滴分割之前左溶液和右溶液的混合。中間和右側(cè)流之間的明亮熒光示出了由于反應緩沖液的擴散導致的中間流中的pH變化。

圖3F示出了圖3B和圖3E中所示的方案的實施簡化圖，同時還示出了在引入擠壓的油流之后液滴分割的發(fā)光的微觀圖。

圖4A示出了根據(jù)另一種實施方式的微流體裝置的由頂向下的視圖，該裝置用于產(chǎn)生作為微孔凝膠系統(tǒng)的一部分的多個微凝膠顆粒。

圖4B示出了在液滴分割區(qū)域中，具有0.25％80的礦物油擠壓和分段的PEG預凝膠，以及下游的礦物油中的5％80溶液混合并且防止微凝膠在完全膠凝化之前在下游聚結(jié)。

圖4C示出了液滴在溫育期間在分流區(qū)沒有重新結(jié)合，并且離開微通道進入收集孔。

圖5示出了根據(jù)一種實施方式的可以用于產(chǎn)生微凝膠液滴的示例性的微流體T型接頭。

圖6A示出了根據(jù)一種實施方式的雙筒注射器的形式的示例性的分配裝置。

圖6B示出了根據(jù)另一種實施方式的單筒注射器的形式的示例性的分配裝置。

圖6C示出了根據(jù)一種實施方式的以保持微凝膠顆粒的管的形式的示例性的分配裝置。

圖7A示出了對于注射二十四(24)小時后的用支架(微孔退火顆?；颉癕AP”支架)以及無孔對照注射的組織，在SKH1-Hr^hr小鼠中的組織切片的蘇木精和伊紅染色(H&E染色)。

圖7B示出了作為注射后天數(shù)的函數(shù)的傷口閉合(％)的圖。該圖示出了，與無孔雙側(cè)對照(N＝5)相比，在五(5)天的時間段內(nèi)，使用支架的傷口閉合率有統(tǒng)計學顯著的改善。

圖7C示出了在SKH1-Hr^hr小鼠中，5天期間，比較凝膠支架(左圖)與無孔PEG凝膠對照(右圖)的體內(nèi)傷口愈合模型期間傷口閉合的代表性圖像。

圖7D示出了在7天的體內(nèi)BALB/c實驗期間傷口閉合的代表性圖像。在體內(nèi)7天后，與未治療對照、缺少K和Q肽的凝膠、無孔PEG凝膠相比，支架促進明顯更快的傷口愈合，并且支架比預制的多孔凝膠(precast porous gel)促進更快的傷口愈合。使用規(guī)范的、基于致孔劑的澆鑄方法(casting method)，體外生產(chǎn)的精確匹配傷口形狀的多孔凝膠示出了可觀的傷口愈合率，與支架相當，但缺乏可注射性(N≥5)。

圖7E是示出對于對應于圖7D的每種治療類別，來自BALB/c體內(nèi)傷口愈合的傷口閉合定量數(shù)據(jù)的條形圖。所有數(shù)據(jù)表示為平均值+/-SEM。使用標準的雙尾t檢驗進行統(tǒng)計學顯著性(*：p<0.05；**p<0.01)。

圖7F示出了對于對應于圖7D和圖7E的每種治療類型，在體內(nèi)7天期間傷口床閉合的痕跡。

圖7G示出了如何可以使用類似于圖6A或6B的注射器裝置(例如，25Gauge注射器)將含微凝膠顆粒的溶液或漿料注射至治療部位中，其中微凝膠符合注射部位的形狀(例如，在這種情況下為星形的激光切割的丙烯酸類模具)，并且隨后將支架退火成星形形狀。

圖8A和8B示出了在小鼠模型中，在皮膚切除和凝膠應用二十一(21)天后，用微凝膠支架(圖8A)和未治療或“假手術”(圖8B)治療的受損組織(即，傷口部位)的染色顯微鏡圖像?？梢郧宄卦趫D8A中看到由微凝膠支架實現(xiàn)的疤痕減少。正方形表示在凝膠應用于傷口后的重組組織中的毛囊和油腺(皮脂腺)。圓圈表示在重組組織中剩余的微凝膠顆粒。

圖8C示出了顯示用假手術治療的組織以及用凝膠支架治療的組織的表皮厚度的圖。

圖8D示出了顯示用假手術治療的組織以及用凝膠支架治療的組織的皮脂腺數(shù)目的圖。

圖8E示出了顯示用假手術治療的組織以及用凝膠支架治療的組織的毛囊數(shù)目的圖。

圖8F示出了顯示用假手術治療的組織以及用凝膠支架治療的組織的疤痕寬度(scar width)的圖。

圖8G示出了顯示用假手術治療的組織以及用凝膠支架治療的組織的乳房囊腫(milial cysts)的數(shù)量的圖。

圖9A示出了儲能模量(作為不同凝膠化動力學(pH和溫度)的混合后時間的函數(shù))的圖。在25攝氏度的pH 8.25由圖中的底線表示；在25攝氏度的pH 8.8由圖中的頂線表示；以及在37攝氏度下的pH 8.25由圖中的中間線表示。

圖9B示出了在x軸上不同的水凝膠重量百分數(shù)用于產(chǎn)生不同剛度的材料。該圖示出了各種水凝膠重量百分數(shù)的儲能模量(Pa)。

圖9C示出了在x軸上的不同交聯(lián)劑化學計量，用于在所得凝膠中產(chǎn)生不同剛度值。該圖示出了作為PEG分子上的自由交聯(lián)劑末端(-SH)與乙烯基(-VS)的r比值的函數(shù)的儲能模量(Pa)。

圖9D示出了對于無孔對照(圖的底線)以及本文所描述的多孔凝膠(圖的頂線)，作為時間的函數(shù)的％降解的圖。

圖9E示出了在200μm(上圖)或100μm(下圖)處，用FXIIIa退火的支架的SEM圖像。

圖9F示出了在200μm(上圖)或100μm(下圖)處，未用FXIIIa的微凝膠顆粒的SEM圖像。未退火的微凝膠顆粒見于圖9F。

圖10示出了使用所描述的技術制造的微凝膠，其中通過使用膦-疊氮化物'點擊'化學，用熒光牛血清白蛋白(BSA)蛋白(外周)補充微凝膠的表面。此外，在微流體制造期間，納米顆粒(500nm)嵌入于微凝膠內(nèi)。

圖11示出了使用本文所描述的微孔凝膠系統(tǒng)治療損傷組織的示例性方法。施加微凝膠顆粒(上圖)，可選地，使用施用器(第二圖)，開始微凝膠顆粒的退火以形成支架(第三圖)，以及觀察到改善的傷口愈合(下圖)。

圖12A示出了顯示在體外多孔凝膠支架中培養(yǎng)六天期間以及在6天后的無孔凝膠中的3D細胞網(wǎng)絡形成的熒光圖像。(350Pa：與多孔凝膠支架相同的體積模量，600Pa：與單個微凝膠匹配的微尺度模量)。

圖12B示出了在代表不同的人類組織類型的三種細胞系中，退火后二十四(24)小時的細胞存活率大于93％的圖。HDF：人真皮成纖維細胞，AhMSC：脂肪來源的人間充質(zhì)干細胞，BMhMSC：骨髓來源的人間充質(zhì)干細胞。

圖13A示出了用于在退火之前，將活細胞與預先形成的微凝膠顆粒組合的示例性方法。微凝膠顆粒彼此退火，將活細胞截留在微凝膠退火后產(chǎn)生的相互連接的微孔網(wǎng)絡內(nèi)。

圖13B-D是示出了以下的照片圖像：將與活細胞組合的微凝膠顆粒溶液可模制成大規(guī)模形狀(macro-scale shape)，并且可以被注射以形成在退火后保持的復雜形狀。圖13B示出了示例性的體外注射器注射。圖13C示出了示例性的體外形狀模制。圖13D示出了示例性的體外退火的支架。圖13E示出了微凝膠顆粒可模制成大規(guī)模形狀，并且可以在活細胞(由指向熒光HEK-293T細胞的箭頭指示)的存在下進行。

圖14A示出了顯示在示例性的實施方式中，可以在生產(chǎn)頻率的范圍內(nèi)合成不同尺寸的微凝膠顆粒的圖。

圖14B示出了在另一示例性實施方式中，向每個溶液入口(其中油入口超過30Psi)提供高入口壓力使得能夠提高生產(chǎn)頻率。

圖14C示出了顯示高精度制造的微凝膠構(gòu)建塊(允許產(chǎn)生限定的凝膠支架)的圖。不同的構(gòu)建塊尺寸允許確定性控制所得的微孔網(wǎng)絡特性，這在本文中呈現(xiàn)為中值孔徑+/-標準偏差(SD)。

具體實施方式

在優(yōu)選的實施方式的描述中，參考形成實施方式的一部分的附圖，其中通過舉例說明的方式示出具體實施方式，其中可以實踐本文描述的主題的。應當理解，在不脫離本文所描述的本發(fā)明主題的范圍和精神的情況下，可以使用其他的實施方式并且可以進行結(jié)構(gòu)改變。此外，在不脫離本發(fā)明的范圍的情況下，不同實施方式的各個方面可以與本文中所描述的其它實施方式一起使用。

在本文描述的主題的一個方面，公開了用于生物醫(yī)學應用，如傷口愈合的固體微凝膠支架，當多個微凝膠顆粒在退火反應中彼此退火時，形成該固體微凝膠支架。在本文描述的主題的一個方面，退火反應在相鄰的微凝膠顆粒之間形成共價鍵。例如，在退火后的狀態(tài)下，支架形成符合應用部位或遞送的部位的三維結(jié)構(gòu)。由于微凝膠顆粒的不完全填充，由顆粒形成的退火支架包括在其中形成的間隙空間，其中細胞可以遷移、結(jié)合和生長。形成的支架結(jié)構(gòu)在傷口或其他遞送部位退火時是多孔的(與由基于纖維蛋白的產(chǎn)品提供的無孔固體支架不同)。該孔隙包括以上提及的間隙空間以及可以在顆粒自身中產(chǎn)生或形成的納米級孔。支架結(jié)構(gòu)的微孔隙允許營養(yǎng)物、細胞生長和分化因子的高擴散性，以及細胞遷移、向內(nèi)生長和滲透。因為增強了通過間質(zhì)空間的細胞遷移，同時保持整體支架完整性，支架的微孔性提供了優(yōu)于常規(guī)的纖維蛋白膠、超支化聚合物或具有可降解交聯(lián)劑選擇的聚合物的加速愈合或改善的藥物或藥劑的治療遞送。此外，通過不限制生物材料為天然材料，例如，通過具有更大的可用范圍和更寬陣列的生物信號可以改善降解曲線(degradation profile)和物理性能(例如，剛度、內(nèi)部擴散率等)或者可以將治療活性化學物質(zhì)包含在材料中(例如，可以將抗生素、類固醇、生長因子等裝載于支架中)。此外，在某些實施方式中，通過將期望的生物材料改性，可以調(diào)節(jié)用于引發(fā)或控制生物活性的藥物、化合物或其他材料的釋放或洗脫。在愈合過程期間或者在降解支架時，可以將以上討論的信號化合物或分子暴露至組織。在初始放置支架于遞送部位處之后，也可以將信號化合物或分子釋放或洗脫至受影響區(qū)中。

超過STAR^TM技術的方法的本文所描述的主題的一個優(yōu)點是支架的形成發(fā)生在體內(nèi)，允許其完全地填充期望的空間并且調(diào)節(jié)以(化學地或其他)結(jié)合至周圍的組織。此外，凝膠顆粒的預遞送形成允許獲得的所形成的支架的受控的機械可調(diào)節(jié)性以匹配周圍組織的性能。這些能力導致更好的密封和與組織的全部整合。較大的整合導致材料損壞的可能性降低以及長期再生增強。這還幫助防止受環(huán)境的污染。而且，退火支架的微孔屬性有益于響應于支架的免疫異物的減少。

圖1示出了由多個退火的微凝膠顆粒12形成的成形的三維支架10的一部分。支架10包括其中的間隙空間14，其是在較大支架10內(nèi)形成微孔的空隙。間隙空間14具有允許細胞的浸潤、結(jié)合和生長的尺寸和幾何輪廓(geometrical profile)。應當理解，本文公開的支架10的微孔屬性涉及位于形成較大支架結(jié)構(gòu)的退火的微凝膠顆粒12之間的間隙空間或空隙14的網(wǎng)絡。在一種實施方式中，在支架10內(nèi)產(chǎn)生的間隙空間或空隙14顯示負凹度(例如，內(nèi)部空隙表面是凸面的)。圖1示出了具有顯示負凹度的空隙壁16的示例性的空隙14。由于在一種優(yōu)選的實施方式中彼此退火的微凝膠顆粒12在形狀上通?；蚧緸榍蛐?，因此產(chǎn)生負凹度。根據(jù)一種實施方式，這允許微凝膠顆粒12的封裝產(chǎn)生約10％至約50％，以及在另一種實施方式中約26％至約36％的低空隙體積分數(shù)(void volume fraction)。盡管空隙體積分數(shù)低，但是在某些實施方式中，在空隙14的網(wǎng)絡內(nèi)顯示的負凹度為空隙體積提供了相對高的表面積用于細胞相互作用。對于給定體積的細胞，它們?nèi)缓笃骄乇┞吨辽踔粮嗪透蟮谋砻?例如，在空隙壁16上)，以在支架10中的空隙網(wǎng)絡內(nèi)相互作用。

重要的是注意到，空隙網(wǎng)絡由其中微凝膠表面非常接近的區(qū)域(例如，鄰近的相鄰的退火微凝膠顆粒12)組成，導致用于細胞粘附和快速遷移通過的高表面積的粘附區(qū)域，同時進一步在微凝膠顆粒12之間的間隙中的鄰近區(qū)域具有更大的空隙空間，其可以使細胞和組織在該空間中生長。因此，與全部的小空隙或全部的更大的空隙相比，鄰近的緊密空隙區(qū)和更寬敞的空隙間隙的組合預期對組織向內(nèi)生長和再生長具有有益的效果。

注意到，在以上描述的實施方式中，由于微凝膠顆粒12的球形形狀導致負凹度。在其他的實施方式中，微凝膠顆粒12可能不是球形的。在支架10中仍然可以使用其它的非球形形狀。仍然參考圖1，支架10由微凝膠顆粒12形成，該微凝膠顆粒12經(jīng)由退火表面17彼此固定。如本文所解釋的，在將微凝膠顆粒12施加至預期的遞送部位期間或之后，形成退火表面17。

支架10可以用于各種應用，包括各種醫(yī)學應用，如軍事現(xiàn)場醫(yī)療、醫(yī)學創(chuàng)傷治療、手術后閉合、燒傷、炎癥和遺傳性和自身免疫性起泡病等。在一種或更多種實施方式中，支架10用作組織密封劑(例如，急性傷口愈合物質(zhì)，手術密封劑，用于以下的局部藥劑(topical agent)：局部厚度、全厚度或隧道傷口，壓力性潰瘍，靜脈性潰瘍，糖尿病性潰瘍，慢性血管潰瘍，供體皮膚移植部位，莫氏手術后，激光手術后，足部傷口，傷口開裂，擦傷，撕裂，二度或三度燒傷，放射性損傷，皮膚撕裂和引流傷口等)。圖2A-2C示出了一種實施方式，其中支架10用于治療在哺乳動物的組織102中形成的傷口部位100。在某些實施方式中，支架10用于立即治療急性傷口。在急性傷口中，支架10提供了多種益處，包括密封傷口100、防止經(jīng)表皮的水分流失、提供細胞或藥物以及增強皮膚傷口(例如，手術部位、燒傷傷口、潰瘍)愈合的快速方法，以提供更多的天然組織發(fā)育(例如，避免疤痕組織的形成)。支架10的一個特別的益處是支架10減少或最小化疤痕組織形成的能力。支架10提供了對組織膠(tissue glue)和其它目前可注射的組織填料和粘合劑的更有效的替代。

如圖2A所示，將微凝膠顆粒12遞送至傷口部位100，隨后開始退火反應，以使微凝膠顆粒12彼此退火，從而形成支架10。如圖2A所示，傷口部位100由支架10密封，并且隨著時間的推移，傷口部位100愈合成正常組織(還參見圖11)。圖2B示出了相鄰的微凝膠顆粒12(顆粒A和顆粒B)如何經(jīng)歷退火反應的化學或酶促引發(fā)，以在微凝膠顆粒12之間形成退火表面17。圖2C示出了放大的視圖，其舉例說明支架10如何作為結(jié)構(gòu)支持還允許由于支架10的多孔屬性導致的組織浸潤和生物材料再吸收。示出了細胞106浸潤在支架10內(nèi)形成的間隙空間。

支架10還可以以再生能力使用，例如，施用至燒傷、急性和慢性傷口等的組織。在一種實施方式中，支架10用于慢性傷口。在慢性傷口中，在正常的愈合過程被抑制的情況下，支架10不僅可以用于密封傷口，而且可以用于去除多余的水分，并且應用藥物，包括可以有助于促進正常傷口愈合過程的細胞療法。在用于體積損失(與老化、脂肪萎縮、脂肪營養(yǎng)不良、皮膚疤痕或者表面或深部皮膚(deep rhytide)相關)的組織填料施加的情況下，可以使用微凝膠顆粒12經(jīng)由針或套管直接注射至真皮中以改善組織輪廓、組織損失或組織位移。因為在再生醫(yī)學中使用的細胞可以在微凝膠顆粒12內(nèi)生長，所以可以包括細胞(例如，間充質(zhì)干細胞，成纖維細胞等)作為療法(通過在組織中原位退火之前，在微凝膠顆粒內(nèi)初始聚合細胞(1-20個細胞)，或者可以將細胞初始粘附至微凝膠顆粒上，或者可以用微凝膠顆粒溶液(非粘附的)引入細胞)。

也可以將支架10用于體外組織生長、用于生物科學研究的三維(3D)基質(zhì)以及化妝品和皮膚病的應用。例如，對于更多的生理學相關的藥物檢驗，可以將癌細胞與微凝膠前體一起接種，并且一旦退火可以允許腫瘤球體快速的3D生長，而不需要如同其他的3D培養(yǎng)凝膠體(例如，)所需要的基質(zhì)降解。期望的是，形成退火凝膠的3D基質(zhì)中的細胞之間的快速形成接觸的能力將增強來自單個細胞類型或多種細胞類型的微組織的生長和形成，該微組織可以用于篩選藥物或者檢測化妝品。表皮層可以在支架10的表面上形成，相比于動物模型，這可以允許在更多的類似皮膚的替代物上檢測藥物或化妝品。先前的3D培養(yǎng)材料可以使凝膠內(nèi)的細胞接種均勻地遍布體積，但是由于缺乏孔隙而不能維持細胞-細胞接觸，或者不能產(chǎn)生孔隙，而是需要在制備后接種細胞并遷移到支架中。

如本文解釋的，在退火的支架10大體上形成限定的結(jié)構(gòu)時，在最終退火之前，前體材料是可流動的，并且可以作為糊劑、漿料遞送，或者甚至注射至研究中的遞送部位。其他的可注射的水凝膠可以提供支架用于原位組織再生長和再生，然而這些注射的材料要求在組織再形成之前凝膠降解，限制它們的提供物理載體的能力。本文中所描述的可注射的微孔凝膠系統(tǒng)通過提供相互連接的微孔網(wǎng)絡用于同時的組織再形成和材料降解規(guī)避了這種挑戰(zhàn)。

微流體形成使得基本上單分散的微凝膠顆粒12形成相互連接的微孔退火的顆粒支架10(在本文描述的主題的一個方面)，從而使得微凝膠顆粒12(例如，構(gòu)建塊)的受控的化學、物理和幾何性能，以提供組裝的支架10的物理和化學性能的下游控制。在體外，在支架10形成期間結(jié)合的細胞在四十八(48)小時內(nèi)增殖并形成廣泛的三維網(wǎng)絡。在體內(nèi)，形成支架10的可注射的凝膠系統(tǒng)促進細胞遷移，導致在五(5)天內(nèi)快速的皮膚組織再生和組織結(jié)構(gòu)形成。使用支架10實現(xiàn)的微孔性和可注射性的組合對于體內(nèi)組織再生和新的組織生成提供了新的途徑。

圖2A示出了在傷口部位100內(nèi)形成的支架10。用于組織再生的成功材料受益于材料降解速率與組織發(fā)育的精確匹配。如果降解發(fā)生得太快，則支架保留不足以支持組織向內(nèi)生長。相反，太慢的速率將阻止適當?shù)慕M織發(fā)育，并且可以促進纖維化和/或免疫排斥。已經(jīng)使用水解和酶促可降解材料來進行基于局部環(huán)境的降解速率的調(diào)節(jié)。然而，材料機械穩(wěn)定性與細胞浸潤的去耦損失(decoupling loss)已證明是非常具有挑戰(zhàn)性的。也可以使用輕度交聯(lián)的基質(zhì)促進細胞向材料的浸潤，然而這常常導致與周圍組織的機械不匹配和差的材料穩(wěn)定性。可替代地，可以通過改變聚合物主鏈同一性或交聯(lián)密度，使降解速率和組織形成匹配來調(diào)節(jié)水凝膠降解速率。雖然可以調(diào)整這些技術以解決可注射水凝膠的具體應用，但是它們不提供堅實的途徑來實現(xiàn)不依賴于材料穩(wěn)定性損失的本體組織整合。

每個傷口部位在其對于功能性組織再生的物理的、化學的和降解要求方面是獨特的，需要對各種挑戰(zhàn)性環(huán)境穩(wěn)健的材料策略。如本文所描述的產(chǎn)生的微孔凝膠系統(tǒng)和獲得的支架10通過提供用于細胞遷移和與周圍組織的本體整合的微孔的穩(wěn)定連接的相互連接的網(wǎng)絡，規(guī)避了在組織向內(nèi)生長之前對材料降解的需要。根據(jù)一種實施方式，微孔凝膠體系通過使用自組裝的微凝膠顆粒12作為“構(gòu)建塊”或“亞單元”(由微流體的油包水液滴分割形成)來實現(xiàn)這些有利的特征。根據(jù)一種實施方式，以這種方式形成的微凝膠顆粒12基本上是單分散的。微凝膠顆粒12可以被注射和模制成任何期望的形狀。然后微凝膠顆粒12的晶格通過表面官能團彼此退火以形成相互連接的微孔支架10(具有或不具有存在于相互連接的多孔網(wǎng)絡中的細胞)。在一種實施方式中，支架10優(yōu)選包括共價連接的微凝膠顆粒12，其形成用于組織再生和向內(nèi)生長的三維支架10。

通過將可注射性和微孔性組合，微孔凝膠系統(tǒng)提供了理想的生物材料支架用于體外的有效的細胞網(wǎng)絡形成和體內(nèi)的本體組織整合。模塊化微孔凝膠系統(tǒng)還為快速細胞遷移、指導細胞粘附的分子線索和組織再生期間和之后的再吸收提供了機械支持。通過微流體制造，可以可預測地和均勻地調(diào)節(jié)微凝膠顆粒12的化學的、物理的和幾何性能，允許出現(xiàn)的支架10的性能的下游控制。新的基于構(gòu)建塊(building block)的方法(其中穩(wěn)健實現(xiàn)的不完美的自組裝是合乎需要的以實現(xiàn)微孔性)，從根本上改變了作為組織模擬構(gòu)建體的水凝膠的使用和實施，提供了用于本體組織整合的可注射支架的途徑的哲學變化(philosophical change)。

在本文所描述的主題的一個方面，微孔凝膠系統(tǒng)使用直徑尺寸在約5μm至約1,000μm范圍內(nèi)的微凝膠顆粒12。微凝膠顆粒12可以由親水性聚合物、兩親性聚合物、合成的或天然聚合物(例如，聚(乙二醇)(PEG)、聚(丙二醇)、聚(甲基丙烯酸羥乙酯)、透明質(zhì)酸(HA)、明膠、纖維蛋白、殼聚糖、肝素、類肝素和合成形式的HA、明膠、纖維蛋白、殼聚糖、肝素或類肝素)。在一種實施方式中，微凝膠顆粒12由能夠形成水凝膠的任何天然(例如，修飾的HA)或合成的聚合物(例如，PEG)制成。在一種或多種實施方式中，可以使用能夠形成固體水凝膠構(gòu)建體的聚合物網(wǎng)絡和/或任何其它的支持網(wǎng)絡。用于大多數(shù)組織工程/再生醫(yī)學應用的合適的支持材料通常是生物相容的并且優(yōu)選是可生物降解的。合適的生物相容性和可生物降解的載體的實例包括：天然聚合物碳水化合物及其合成改性的、交聯(lián)的或取代的衍生物，如明膠、瓊脂、瓊脂糖、交聯(lián)海藻酸、殼多糖、取代和交聯(lián)的瓜爾膠、纖維素酯(特別是用亞硝酸和羧酸取代和交聯(lián))、混合的纖維素酯和纖維素醚；含氮的天然聚合物，如蛋白質(zhì)和衍生物，包括交聯(lián)的或改性的明膠和角蛋白；乙烯基聚合物(如，聚(乙二醇)丙烯酸酯/甲基丙烯酸酯/乙烯基砜/馬來酰亞胺/降冰片烯/烯丙基)、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、上述縮聚物的共聚物和三元共聚物，如聚酯，聚酰胺以及其它的聚合物，如聚氨酯；以及上述類型的混合物或共聚物，如通過在預先存在的天然聚合物上起始合成聚合物的聚合而獲得的接枝共聚物。多種生物相容的和可生物降解的聚合物可用于治療應用的用途；實例包括：聚己內(nèi)酯、聚乙交酯、聚丙交酯、聚(乳酸-共-乙醇酸)(poly(lactic-co-glycolic acid))(PLGA)和聚-3-羥基丁酸酯。由這種材料制備網(wǎng)絡的方法是熟知的。

在一種或多種實施方式中，微凝膠顆粒12進一步包括共價附著的化學物質(zhì)或分子，其作用為在微凝膠顆粒12形成期間形成的信號修飾。信號修飾包括添加，例如粘附肽，細胞外基質(zhì)(ECM)蛋白等。也可以通過共價方法或非共價相互作用(例如，靜電電荷-電荷相互作用或擴散限制性螯合)在微凝膠顆粒12形成之后，將官能團和/或連接體添加至微凝膠顆粒12中。根據(jù)所需的降解特性選擇交聯(lián)劑。例如，微凝膠顆粒12的交聯(lián)劑可以被水解地、酶促地、光解地等降解。在一種特別優(yōu)選的實施方式中，交聯(lián)劑是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-可降解交聯(lián)劑。

這些交聯(lián)劑的實例是合成制備的或天然分離的肽，其具有對應于MMP-1靶底物、MMP-2靶底物、MMP-9靶底物、隨機序列、Omi靶序列、熱休克蛋白靶序列的序列，以及任何這些列出的序列全部具有或具有一些D手性或L手性的氨基酸。在另一實施方式中，交聯(lián)劑序列是由以上列出的相同的主鏈組成的水解可降解的天然的和合成的聚合物(例如，肝素、藻酸鹽、聚(乙二醇)、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯，所列縮聚物的共聚物和三元共聚物，如聚酯、聚酰胺和其它聚合物，如聚氨酯)。

在另一種實施方式中，交聯(lián)劑是具有對應于以下序列的合成制備的或天然分離的DNA寡核苷酸：限制性酶識別序列、CpG基序、鋅指基序、CRISPR或Cas-9序列、Talon識別序列和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。來自所列的實施方式的任何交聯(lián)劑在每一端被反應性基團活化，該反應性基團被定義為允許交聯(lián)劑參與交聯(lián)反應以形成聚合物網(wǎng)絡或凝膠的化學基團，其中這些官能團可以包括：半胱氨酸氨基酸、合成的和天然存在的含硫醇的分子、含碳烯基團、活化酯、丙烯酸酯、降冰片烯、伯胺、酰肼、膦酸、疊氮化物、含環(huán)氧基團、含SANPAH的基團和含重氮基的基團。

在一種實施方式中，用于產(chǎn)生微凝膠顆粒12的化學物質(zhì)(chemistry)允許隨后的退火以及通過自由基引發(fā)的聚合形成支架10。這包括與四甲基乙二胺結(jié)合的化學引發(fā)劑(如過硫酸銨)。可替代地，可以將光引發(fā)劑，如2959或曙紅Y與自由基轉(zhuǎn)移劑，如游離巰基(以10μM至1mM范圍內(nèi)的濃度使用)一起與光源組合使用，該光源是用于引發(fā)如本文所描述的反應。游離巰基的一個實例可包括，例如，本文所描述的氨基酸半胱氨酸。當然，也可以使用包含游離半胱氨酸的肽或者包含游離硫醇的小分子。自由基轉(zhuǎn)移劑的另一個實例包括N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)。

可替代地，親核基團(例如，硫醇、胺、氨氧基)上的邁克爾和假邁克爾加成反應(Michael and pseudo-Michael addition reaction)(包括α,β-不飽和羰基(例如，丙烯酸酯、乙烯基砜、馬來酰亞胺等)可以用于使微凝膠顆粒12退火以形成支架10。在另一可替代的實施方式中，微凝膠顆粒12形成化學(formation chemistry)允許通過包括纖維蛋白原到纖維蛋白的引發(fā)的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變(通過加入催化性酶凝血酶)形成網(wǎng)絡。

允許顆粒-顆粒退火的官能團包含在微凝膠顆粒12的形成期間或之后。在一種或多種實施方式中，這些官能團包括α,β-不飽和羰基，其可以通過任一自由基引發(fā)的與鄰近顆粒上的α，β-不飽和羰基的反應，或者與親核官能團的邁克爾和假邁克爾加成反應而活化用于退火，該親核官能團作為顆粒之間的多官能連接體或作為存在于相鄰顆粒上的官能團外源地呈現(xiàn)。該方法可以使用多種微凝膠顆粒12群體類型(population type)，當混合時形成支架10。例如，呈現(xiàn)出，例如親核表面基團的X型微凝膠顆粒12可以與呈現(xiàn)例如α,β-不飽和羰基的微凝膠顆粒12型Y一起使用。在另一實施方式中，可以包括參與點擊化學(click chemistry)的官能團，允許直接附著到呈現(xiàn)互補點擊功能的相鄰微凝膠顆粒12上，或者通過參與或引發(fā)(例如，銅)點擊反應的外源呈現(xiàn)的多功能分子附著。

退火官能團可以包括任何先前討論的用于微凝膠交聯(lián)的官能團，該功能團與初始交聯(lián)反應相比在其引發(fā)條件(例如，溫度、光、pH)方面是正交的或相似的(如果潛在的反應性基團保留)。例如，如果初始交聯(lián)反應由溫度依賴的邁克爾加成反應組成，則隨后的退火官能團可以通過溫度或光引發(fā)(例如，曙紅Y，)來引發(fā)。作為另一實施例，初始微凝膠可以在一波長的光(例如，用的紫外線的)下光聚合，并且微凝膠顆粒12的退火發(fā)生在相同的或另一波長的光(例如，用曙紅Y的可見的)下，反之亦然。除了用共價偶聯(lián)反應退火之外，退火部分可以包括非共價疏水的，客體/主體相互作用(例如，環(huán)糊精)，在鄰接的微凝膠顆粒12上的互補核酸序列或核酸模擬物(例如，蛋白質(zhì)核酸)之間的雜交，或離子相互作用。離子相互作用的實例將由與Ca²⁺退火的微凝膠顆粒表面上的藻酸鹽官能團組成。所謂的“A+B”反應也可以用于退火微凝膠顆粒12。在該實施方式中，兩種分開的微凝膠類型(A型和B型)以各種比例(在0.01:1至1:100A:B之間)混合，并且A型的表面官能團與B型反應(反之亦然)以引發(fā)退火。這些反應類型可以屬于本文列出的任何機制。

在一種實施方式中，微凝膠顆粒12使用微流體方法(微流控方法，microfluidic method)或毫流體方法(毫流控方法，millifluidic method)制造，產(chǎn)生具有小變異性和高通量(例如，大于10個顆粒/秒的頻率)的確定性的微凝膠顆粒長度尺度。微凝膠顆粒12長度尺度(例如，直徑)的變化的系數(shù)(coefficient of variation)可以在平均長度尺度的35％以內(nèi)、或更優(yōu)選在15％以內(nèi)、甚至更優(yōu)選在5％以內(nèi)。毫流體或微流體允許均勻的、預定的、簡明的材料性質(zhì)被包括在微凝膠顆粒12的形成之前、形成中和形成后。此外，微流體/毫流體生產(chǎn)機制允許容易按比例放大生產(chǎn)，以及對微凝膠顆粒12的化學組成和物理特性的良好的質(zhì)量控制。用于微凝膠顆粒12產(chǎn)生的毫流體和/或微流體技術是容易規(guī)?；倪^程，以產(chǎn)生用于商業(yè)需要的大量材料，同時保持微凝膠顆粒12特征的高準確度與精密度。此外，與涉及靜電紡絲或大規(guī)模纖維蛋白純化的其它技術相比，均以低成本將其實現(xiàn)。

在一種實施方式中，微凝膠顆粒12是使用依賴于油包水乳劑產(chǎn)生的自動化流體方法形成的。這包括微流體或毫流體方法，該方法使用玻璃/PDMS、PDMS/PDMS、玻璃/玻璃，或者模制的/鑄造的/壓印的塑料芯片以生成具有小于35％的粒度分布變化的油包水液滴。

圖3A-3F示出了用于生成微凝膠顆粒12的微流體裝置20的一種實施方式。微流體裝置20在，如PDMS的基底材料22中形成，其可以包括粘合基底22的另一基底材料24(例如，玻璃)。在該實施方式中，微流體裝置20包括第一入口26、第二入口28和第三入口30。如圖3A中所示，第三入口30插入在第一入口26和第二入口28之間。在該實施方式中，第一入口26連接至包含4-臂(arm)聚(乙二醇)乙烯基砜(PEG-VS)主鏈(20kDa)的溶液(已經(jīng)用用于細胞粘附性能的寡肽(例如，RGD)和表面/組織退火官能團(例如，K和Q肽)預先修飾)。PEG-VS主鏈可以被500μM K-肽(Ac-FKGGERCG-NH₂[SEQ ID NO:1])(Genscript)、500μM Q肽(Ac-NQEQVSPLGGERCG-NH₂[SEQ ID NO:2])和1mM RGD(Ac-RGDSPGERCG-NH₂[SEQ ID NO:3])(Genscript)預官能化。輸入到第一入口26的溶液可以含有約5％(基于重量)的修飾的PEG-VS，其包含在0.3M三乙醇胺(Sigma)，pH 8.25的緩沖液中。第二入口28連接至含有交聯(lián)劑的溶液，該交聯(lián)劑在一種實施方式中是12mM的二半胱氨酸修飾的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)(Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH₂[SEQ ID NO:4])底物(Genscript)。在使用熒光成像進行的實驗中，MMP底物與10μM Alexa-fluor 647-馬來酰亞胺(Life Technologies)預反應。當然，在實際應用中，不需要使用熒光探針。所有溶液可以通過在Luer-Lock注射器過濾器中的0.2μm聚醚砜(PES)膜無菌過濾。

如本文中所使用的，K-肽是指其中含有因子XIIIa識別的賴氨酸基團的那些肽。如本文中所使用的，Q-肽是指其中含有因子XIIIa識別的谷氨酰胺基團的那些肽。因此，可以使用超出以上具體提及的肽序列。這種肽序列適用于以上列出的RGD肽序列。

第三入口30連接至含有按重量計5％的PEG-VS(未被K、Q或RGD肽修飾)的水性溶液。PEG-VS水性溶液優(yōu)選地與通過第一入口26引入的PEG-VS溶液粘度匹配，并且可以用于控制交聯(lián)劑溶液的pH以及抑制交聯(lián)直到液滴形成。通過使第三入口30插入于第一入口26和第二入口28之間，PEG-VS水性溶液用作防止液滴產(chǎn)生區(qū)域上游的反應性溶液的任何材料擴散性混合的屏障。這顯著增加了裝置在污染發(fā)生之前的壽命。圖3E和3F示出了惰性液體溶液如何防止在液滴分割之前左溶液和右溶液的混合。注意到，制備微凝膠顆粒12的方法也將省略第三入口30并相應地調(diào)節(jié)肽/交聯(lián)劑濃度，但是裝置的壽命不長。

參照圖3A、3B和3C，第一入口26、第二入口28和第三入口30分別連接至通道32、34、36。通道在接頭38相交并且在共用通道40中攜帶。第四入口42設置在裝置中并且連接至至含有表面活性劑(例如，按體積計80，盡管可以使用其他表面活性劑)的油相。第四入口42連接至在共用通道40的下游區(qū)域處的接頭(junction)48處相交的兩個通道44、46。裝置20中的接頭48是形成包含PEG-VS組分和交聯(lián)劑的水基液滴的位置。液滴的內(nèi)容物經(jīng)歷混合，并且在凝膠化時形成微凝膠顆粒12，在本實施方式中，該凝膠顆粒是環(huán)境溫度和流逝時間的函數(shù)。在該裝置中，提供了第五入口50，其與含有表面活性劑的另一油相連接至，該油相的體積百分數(shù)高于連接至第四入口42的體積百分數(shù)。例如，第五入口50可連接至含有按體積計80的油相。同樣，也可以使用除了80之外的其它表面活性劑。第五入口50連接至兩個通道52、54，其在如圖所示的擠壓方向(pinching orientation)上在接頭56處相交。

共用通道40延長到一系列逐漸分支的分支通道58。分支通道58允許微凝膠顆粒12通過單獨的平行通道的連續(xù)流動，其中可以可選地控制局部環(huán)境條件。例如，可以控制各個分支通道58的溫度以調(diào)節(jié)微凝膠顆粒12的交聯(lián)條件。同樣，可以用光照射分支通道58以控制光活化反應。微凝膠顆粒12可以使用出口59從裝置20移除。然而，應當理解，由于當裝置在環(huán)境溫度或其附近操作時，交聯(lián)反應可以僅僅通過時間的流逝而發(fā)生，因此分支通道58的溫度的調(diào)節(jié)或光活化的使用是完全可選的。

如在圖3D中最佳地看到的，第一入口26、第二入口28、第三入口30、第四入口42和第五入口50分別連接至流體線路26’、28’、30’、42’和50’，它們均連接至泵送裝置51或?qū)⑾鄳黧w泵送至相應連接的入口28、28、30、42、50中的多個泵送裝置51。泵送裝置51可以包括連接到每種不同流體的單獨的泵?？梢员皇褂玫谋妙愋偷膶嵗ㄗ⑸淦鞅没蛲ǔＥc微流體裝置結(jié)合使用的其他泵。在一個方面，泵送裝置51使用流體貯存器上方的調(diào)節(jié)的加壓氣體來以期望的流速泵送流體通過該裝置。

圖4A-4C示出了用于產(chǎn)生微凝膠顆粒12的微流體裝置60的可替代的實施方式。在該可替代的實施方式中，與圖3A-3C的實施方式不同，沒有攜帶用于在液滴產(chǎn)生之前分離PEG和交聯(lián)組分的水性溶液的第三入口30。相反，在該實施方式中，微流體裝置60包括第一入口62、第二入口64、第三入口66和第四入口68。第一入口62連接至如以上描述的改性的PEG-VS源。第二入口64連接至交聯(lián)劑。第三入口66連接至含有油和表面活性劑的源。第四入口68連接至含有油和表面活性劑的源，該源濃度高于連接至第三入口66的源的濃度。在該實施方式中，第一入口62和第二入口64連接至通向共用通道74的相應的通道70、72。第三入口66連接至在其中產(chǎn)生液滴(液滴將在反應時形成微凝膠顆粒12)的接頭80(在圖4B中最佳地示出)處與共用通道74相交的一對通道76、78。第四入口68連接至一對通道82、84，該對通道在相對于接頭80的下游位置86(在圖4B中最佳地示出)處與共用通道74相交。如在圖4A中所示，裝置60包括一系列逐漸分支的分支通道88，其類似于在圖3A-3C的實施方式的上下文中描述的那些。通過分支通道88的微凝膠顆粒12可以收集在收集室90(其可以從裝置60移除)等中。使用如前面在圖3A-3C的實施方式的上下文中描述的流體管線和泵送裝置將流體遞送到裝置60。

在一種實施方式中，導致微凝膠顆粒12形成的流體條件包括基于PEG的和基于交聯(lián)劑的水性溶液的在芯片上的混合，其中一部分含有基礎聚合物，并且另一部分含有交聯(lián)劑或引發(fā)劑。當然，在圖3A-3C的實施方式中，存在三輸入混合(three-input mixing)，其包括上述組分加上添加水基惰性流。這些PEG和交聯(lián)劑溶液以1:1體積比或高達至1:100的另一可控比(由進入裝置的相對流速控制)混合?？刂朴秃涂偹魉俾实谋戎狄源_定特定尺寸的微凝膠顆粒12，其中這些比值可以為4:1(含水部分(aqueous)：油)至1:10(含水部分：油)的范圍。

如以上解釋的，在圖3A-3D的實施方式中，芯片裝置20被設計成具有三種水基溶液合并以形成微凝膠顆粒12，其中，通過液滴發(fā)生器上游的非反應性溶液將基礎聚合物和交聯(lián)劑/引發(fā)劑分離，以預防溶液反應以及在液滴產(chǎn)生的上游區(qū)域中隨著時間的芯片結(jié)垢(fouling)。在該構(gòu)造中，非反應性溶液的部分應當?shù)扔诨蛐∮诨A和交聯(lián)劑溶液(其它溶液的體積速率的1至0.05倍)。因此，該實施方式可以改善用于微凝膠產(chǎn)生的芯片的可靠性和壽命。此外，在該實施方式或先前的實施方式中，可以將細胞引入至兩種或三種引入的水性溶液中的任一種，以使得能夠?qū)⑦@些細胞(每個顆粒的單個細胞或2-20個細胞的簇)封裝在微凝膠顆粒12內(nèi)，使得封裝的細胞可以產(chǎn)生促進傷口愈合或細胞向內(nèi)生長的因子。

盡管圖3A-3D和4A-4C示出了可用于產(chǎn)生微凝膠顆粒12的微流體裝置20、60的不同實施方式，但是在可替代的實施方式中，微流體流動路徑可包括如圖5示出的“T型接頭”結(jié)構(gòu)。在該實施方式中，微流體裝置92包括在攜帶含水相的第一通道94與包括油相的第二通道96之間形成的接頭。液滴97形成并經(jīng)由出口通道98(其可以與第一或第二通道94、96相同)運輸?？商娲?，可以使用不同的液滴形成構(gòu)造來產(chǎn)生微凝膠顆粒12。例如，由于非平行的頂壁和底壁，該裝置可以使用限制的梯度來產(chǎn)生液滴97，如在Dangla et al.,Droplet microfluidics driven by gradient of confinement，Proc Natl Acad Sci USA，110(3)：853-858(2013)中公開的那些，通過引證將其并入本文。

在以上描述的微流體裝置中，通道表面應當被改性，使得含水相是非潤濕的，其可以包括表面的氟化，或者通過基于共價硅烷的處理或另一種基于非特異性吸附的方法將表面轉(zhuǎn)化為疏水的或親氟的?？商娲?，含有親氟基團的塑料聚合物包含芯片材料，并且可與先前提及的表面涂層組合或者不與表面涂層組合。此外，在優(yōu)選的實施方式中，使用的油應該是補充有非離子表面活性劑的礦物油(石蠟油)、補充有離子表面活性劑的植物油或補充有氟化表面活性劑的氟化油(或這些兩種油/表面活性劑體系的任意組合)。這些微流體或毫流體方法以等于或超過10Hz的速率產(chǎn)生微凝膠顆粒12的單分散(變化的系數(shù)小于35％)，其中手工地(手動地)或使用自動化流體處理系統(tǒng)完成收集。為了防止微凝膠顆粒12在交聯(lián)反應完成之前聚結(jié)，需要足夠的表面活性劑來穩(wěn)定預凝膠液滴，然而，高水平的表面活性劑也使液滴產(chǎn)生過程不穩(wěn)定。因此，用于微凝膠顆粒12產(chǎn)生的微流體系統(tǒng)的優(yōu)選實施方式包括在產(chǎn)生液滴的初始擠壓油流(initial pinching oil flow)中的低濃度的表面活性劑(1％或更少)，隨后從單獨的入口添加油+表面活性劑溶液，其與形成的液滴和油溶液合并且含有較高水平的表面活性劑(比初始表面活性劑高達至10倍或甚至50倍)。這示出在，例如圖3A-3D和4A-4C的實施方式中。

在另一可替代的實施方式中，兩種油擠壓流具有相同濃度的表面活性劑。在又一實施方式中，不是第二擠壓油流，而是只有流動聚焦油(flow-focusing oil)流動以產(chǎn)生液滴。此外，如以上解釋的，在一些可替代的實施方式中，沒有第二擠壓油流，并且僅使用t型接頭油流來產(chǎn)生液滴。當然，t型接頭液滴接頭可以可選地與具有相等或更大表面活性劑濃度的第二富集油(focusing oil)入口組合。

在形成之后，使用通過含水相的離心或者通過固體膜過濾裝置的過濾，從油相中提取微凝膠顆粒12。例如，過濾可以用于降低固定微凝膠顆粒12的自由水性溶液的體積(自由體積)。在一種實施方式中，含水的自由體積小于總體積的約35％。在另一實施方式中，為了產(chǎn)生有意多分散群體，在毫流體或微流體平臺中進行微凝膠顆粒產(chǎn)生，產(chǎn)生相對單分散微凝膠顆粒12的存料(stock)，該存料隨后以期望比值混合以獲得微凝膠顆粒12尺寸的確定性分布和比值。用1:1、10:1或超過100:1的化學計量比，可以精確地控制微凝膠顆粒12尺寸的比值以控制在最終退火支架10中的孔結(jié)構(gòu)或化學性能。

可替代地，也可以使用聲波混合法或旋轉(zhuǎn)渦流進行經(jīng)由油包水系統(tǒng)的微凝膠顆粒12的產(chǎn)生。這些后者方法產(chǎn)生具有100納米至500微米范圍的尺寸的微凝膠顆粒12的多分散群體(polydisperse population)。隨后，可以使用多孔過濾、微流體過濾或本領域已知的其他技術過濾這些顆粒以獲得較窄粒徑分布的微凝膠顆粒12(例如，小于50％的變化的系數(shù))。作為另一替代，可以通過形狀限定掩模，使用停止流動光刻(stop flow lithography)、連續(xù)流動光刻和其他方法來制造不同形狀的組分微凝膠顆粒12，來產(chǎn)生依賴于成形流(與UV引發(fā)的聚合結(jié)合)的成形顆粒(參見Amini等人，國際公開號WO/2013/049404，通過引證將其并入本文)。在這種情況下，微凝膠顆粒12是具有可以在5至1000微米之間變化的長和短尺寸的非球形。也可以通過在油包水乳液中產(chǎn)生球形顆粒，然后通過微制造的壓縮物擠出所述顆粒來制造成形顆粒，該微制造的壓縮物具有小于顆粒的直徑的長度尺度。先前的球形顆粒隨著它們轉(zhuǎn)變成凝膠而采用壓縮的形狀，并且當它們通過以上列出的任何交聯(lián)劑反應在壓縮中成為凝膠時保持該形狀。凝膠在離開微制造的結(jié)構(gòu)之后保持該形狀。成形顆粒可以允許對在最終支架(由微凝膠顆粒12退火形成的)內(nèi)的孔、總孔隙率、孔的彎曲度和改善的粘附性的另外控制。

在一種或多種實施方式中，微凝膠顆粒12被共價地或非共價地修飾(例如，通過擴散包含在空間內(nèi))以提供生物活性分子(例如，小分子藥物、抗生素、肽、蛋白質(zhì)、類固醇、基質(zhì)聚合物、生長因子、抗原、抗體等)。在微凝膠顆粒12形成之后包含信號分子可以通過被動擴散、表面固定(永久或臨時)和/或本體固定(永久或臨時)來實現(xiàn)。

在另一實施方式中，納米顆粒被包括在初始預聚物溶液中，并在初始聚合或凝膠化期間合并于微凝膠顆粒12中，并且納米顆?？砂ㄓ糜诔掷m(xù)或快速釋放和遞送的生物活性分子。在另一實施方式中，含有游離伯胺(作為含賴氨酸的寡肽的一部分被包含)的微凝膠顆粒12可以用NHS-疊氮化物修飾?？梢韵蜻@組微凝膠顆粒12添加用NHS-膦修飾的蛋白質(zhì)，導致微凝膠顆粒12的表面包被(surface-coating)具有修飾的蛋白質(zhì)。圖10示出了這樣的實施方式，其中微凝膠顆粒12具有嵌入其中的納米顆粒和使用點擊化學，用蛋白質(zhì)修飾的表面。

在生產(chǎn)和可選的改性后，可以將微凝膠顆粒12(其可以是均勻的或非均勻的混合物)施加到所需位置(體外，原位，體內(nèi))。哺乳動物組織102上的期望位置可以包括，例如傷口部位100或受損組織的其他部位?？梢詥为毜貙⑽⒛z顆粒12引入于等滲鹽水性溶液或漿液(優(yōu)選30-99％體積分數(shù)，且次優(yōu)選1-30％體積分數(shù)的微凝膠顆粒12)?？商娲?，微凝膠顆粒12可以與作為單細胞或細胞的聚集體一起以10：1的細胞與顆粒的比例引入以在最終退火的支架10內(nèi)產(chǎn)生致密的細胞網(wǎng)絡，或者以1：100或甚至1：1000產(chǎn)生稀疏接種的支架10以及產(chǎn)生可用于再生的可溶性因子的細胞。在另一種實施方式中，微凝膠顆粒12可以與以小體積分數(shù)顆粒(<10％)的細胞一起，在細胞容許的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間，以促進對單個微凝膠顆粒12的粘附。這些復合細胞粘附的微凝膠顆粒12可以作為活性組分(退火以形成微孔細胞接種的支架10)引入，這可有益于增強再生活性的速度。引入微凝膠顆粒12的期望的體外位置包括孔板(例如，6孔、96孔、384孔)或微流體裝置，以在退火后形成用于細胞的3D微孔培養(yǎng)環(huán)境，并且能夠進行后續(xù)的生物測定或具有更多生理學相關的3D或多細胞條件的高通量篩選測定。為了在體外引入，可以將微凝膠顆粒12溶液移液到孔中或通過注射器注射引入，隨后引入退火溶液或觸發(fā)光化學退火?？商娲?，微凝膠顆粒12溶液的溶液可以，在遞送前與緩慢作用的退火溶液(在10-30分鐘內(nèi)發(fā)生退火)混合。原位位置包括外部傷口部位(例如，切口、水皰、瘡、壓瘡、靜脈潰瘍、糖尿病性潰瘍、慢性血管潰瘍、供體皮膚移植部位、莫氏手術后部位、激光手術后部位、足部傷口、傷口裂開、擦傷、撕裂、二度或三度燒傷、放射性損傷、皮膚撕裂和引流傷口等)。由于表皮是上皮結(jié)構(gòu)，微凝膠顆粒溶液可以用于治療其他上皮表面(即，泌尿道上皮的(膀胱和腎)，呼吸消化的(肺，胃腸)，類似于皮膚上皮(即，胃或十二指腸潰瘍；以及穿透至肺、膀胱、或腸瘺等的外傷)。因此，微凝膠顆粒溶液可以通過導管或插管施用于其它組織，如神經(jīng)組織和心臟組織，其中組織向內(nèi)生長將有利于防止疤痕形成，以及促進損傷后，如脊髓損傷、腦梗塞/中風和心肌梗死后的再生愈合。

為了原位引入，含有微凝膠顆粒的溶液可與退火溶液分開存儲，并在引入期間混合(類似于環(huán)氧粘合劑的方法)，以防止在進入傷口部位100之前過早引發(fā)退火反應。

在另一實施方式中，兩種溶液可以存儲在具有兩個相等或不相等直徑的筒的注射器或擠壓管施用器中，使得當注射器的柱塞被壓下或擠壓管被壓縮時，其同時地以正確的化學計量遞送微凝膠顆粒12和退火溶液。圖6A示出了遞送裝置110的一種這樣的實施方式，其包括第一筒112、第二筒114以及用于從每個筒112、114分配含微凝膠顆粒12的溶液的柱塞116。例如，第一筒112包含濃度范圍為0.1至5U/ml的微凝膠顆粒12和凝血酶，并且第二筒114包含濃度為0.1至1000U/ml的微凝膠顆粒12和FXIII。在兩個筒112、114中，存在1比1體積分數(shù)的含K肽和Q肽的微凝膠顆粒12，其中微凝膠顆粒12中的K肽和Q肽的濃度范圍為10-1,000μM。在該實施方式中，在混合后，凝血酶激活FXIII(形成FXIIIa)，并且獲得的FXIIIa負責在相鄰微凝膠顆粒12上的K肽和Q肽的表面退火和連接。

可替代地，兩個筒112、114可含有兩種單獨的微凝膠顆粒12類型，其具有需要組合以引發(fā)交聯(lián)的退火部分?？商娲拇鎯瓦f送方法將是在如圖6B所示的單筒注射器110中，或如圖6C所示的多用途或一次性可壓縮管(例如，類似于牙膏或抗生素軟膏)，其中微凝膠顆粒漿料可以被擠出到所需體積并鋪展在傷口部位100上，然后通過暴露至光而退火，其中用于光化學的活性劑是濃度為100μM的曙紅Y，盡管濃度在10μM-1mM的范圍內(nèi)也會起作用。優(yōu)選地，曙紅Y伴有自由基轉(zhuǎn)移劑，其可以是，例如具有游離巰基的化學物質(zhì)。一種這樣的自由基轉(zhuǎn)移劑的實例，包括半胱氨酸，或者包括本文所描述的半胱氨酸的肽(例如，以500μM的濃度使用)。光應通過寬光譜白光(白熾燈或LED)或者綠色或藍色LED燈發(fā)出。手電筒、光棒(wand)、燈或甚至環(huán)境光可以用于供應白光。曝光應該在0.1秒至1000秒之間發(fā)生，并且光的強度應該在退火部位處在0.01mW/cm²至100mW/cm²的范圍之間。在另一實施方式中，光介導的退火可以使用UV光(波長在300-450nm之間)實現(xiàn)，其中光化學試劑是濃度為0.01％w/v至10％w/v的2959。曝光時間應在0.1秒至100秒之間，其中在退火部位處的光強度為0.1mW/cm²至100mW/cm²。對于其中使用光引發(fā)退火的實施方式，微凝膠前體12在使用之前將被存儲在不透明的(相對于引發(fā)退火的波長范圍是不透明的)注射器或擠壓管110容器中。期望的原位位置包括內(nèi)部切口和組織間隙(例如，來自手術切口或切除)，燒傷傷口、放射傷口和潰瘍、或在整容手術應用中填充組織位置并促進組織向內(nèi)生長和再生，而不是現(xiàn)有的可注射物導致的普遍的纖維化過程。

使用雙筒或單筒注射器的遞送也適合于該指示，并且使用光活化和可插入至手術部位的UV或白光源退火。對于原位和體內(nèi)應用，可以使用無菌施用器將微凝膠顆粒漿料鋪展成與傷口齊平或埋設在傷口部位100內(nèi)和其附近(在傷口內(nèi)和超過原始傷口范圍的2mm至1cm)以產(chǎn)生延伸超出傷口部位100或組織缺損的退火支架，以提供另外的保護、水分和結(jié)構(gòu)以支持組織再生。

通過施加刺激(例如，自由基引發(fā)劑、酶、邁克爾加成等)或通過與已經(jīng)存在于微凝膠顆粒12的施加部位處的刺激物相互作用來引發(fā)退火過程，該刺激物與微凝膠顆粒12的表面上的官能團互相作用，形成由退火(連接)微凝膠顆粒12形成的固體的連續(xù)的高度多孔的支架10。如果用于組織中，退火過程可允許支架10與周圍環(huán)境組織融合，提供有效的密封，局部藥物和/或細胞遞送裝置，用于體內(nèi)感測的血管化支架以及更好的組織再生路徑。退火過程允許現(xiàn)場(on-site)/按需(on-demand)的凝膠形成(其對于體外和體內(nèi)應用是理想的)，例如通過小切口遞送到微創(chuàng)外科手術部位，或通過針注射或通過導管或套管。支架12可以包括微凝膠顆粒12的均質(zhì)或異質(zhì)群體。如所討論的，微凝膠顆粒12的異質(zhì)群體可以在物理方面(例如，在尺寸、形狀或剛度上)變化或者在以下化學組成方面變化(例如，可降解的連接劑的改變的降解速率，或者改變降解速率的L-或D-氨基酸，不同的退火部分，細胞粘附部分、或具有生物活性分子或納米顆粒的微凝膠12的負載)。最終的退火支架10的異質(zhì)組成可以是隨機的，或者是均勻組成的層狀結(jié)構(gòu)，以在微孔結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生梯度(例如，通過改變層中的微凝膠顆粒12尺寸)或化學組合物的梯度(通過具有不同組合物或生物活性分子負載的微凝膠顆粒12層)。梯度可用于指導體內(nèi)的細胞向內(nèi)生長和組織再生，或體外的組織結(jié)構(gòu)的發(fā)育?？梢酝ㄟ^遞送單一組合物的凝膠的順序漿料，然后退火，且隨后遞送第二組合物的下一凝膠，接著退火來實現(xiàn)微凝膠顆粒12組合物中的梯度，該退火將新的微凝膠層連接到前一層，直到已經(jīng)累積了期望數(shù)量的層?？梢允褂米⑸涞臐{料的體積和注射部位的面積來控制每個層的厚度。實現(xiàn)梯度的可替代的實施方式是裝載多筒注射器施加器，如在圖6A中所示的在每個筒中具有不同的微凝膠組合物。同時地將每個筒壓縮并以分層的片供給到噴嘴120。注射器施用器的噴嘴120自身可以是非圓形或者是矩形的，以產(chǎn)生注入至帶狀結(jié)構(gòu)中的部位的多種組合物的分層漿料，其然后可以在該布置中退火?？梢酝ㄟ^自由基、酶促或化學的(例如，點擊化學)方法實現(xiàn)結(jié)構(gòu)連續(xù)的退火支架10的形成。

在一種或多種實施方式中，一旦準備將微凝膠顆粒12置于遞送部位，那么通過微凝膠顆粒12之間的表面化學相互作用進行退火。在一種實施方式中，該方法通過經(jīng)由表面可聚合基團的自由基引發(fā)的退火(例如，通過光敏自由基引發(fā)劑的自由基引發(fā)等)進行。在另一實施方式中，該過程通過經(jīng)由表面呈遞的酶促活化的底物(例如，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，如因子XIIIa)的酶促化學發(fā)生。在另一實施方式中，該過程通過經(jīng)由邁克爾和假邁克爾加成反應的共價偶聯(lián)發(fā)生。該方法可以使用當混合時形成固體支架10的多種微凝膠顆粒群體類型(例如，呈現(xiàn)例如親核表面基團的微凝膠顆粒12A型，和呈現(xiàn)例如α,β-不飽和羰基的微凝膠顆粒12B型)。在另一實施方式中，該過程通過點擊化學(click chemistry)粘著發(fā)生。類似地，該方法可以使用當混合時形成固體微孔凝膠的異質(zhì)微凝膠顆粒12群體。在另一實施方式中，可以使用光(例如，白光或UV光)實現(xiàn)退火，以引發(fā)凝膠表面上分子之間的化學反應，該化學反應由在本文描述的微凝膠中和其周圍(或直接共價地連接至其)的溶液中的光活化分子介導。

在一種優(yōu)選的實施方式中，微凝膠顆粒12包括與酶促可降解交聯(lián)劑結(jié)合的基于PEG的聚合物主鏈以允許生物再吸收性。在某些實施方式中，基于PEG的聚合物主鏈是用于細胞粘附性能(例如，RGD)和表面退火官能性(例如，K和Q肽)的寡肽預修飾的4-臂聚(乙二醇)乙烯基砜(PEG-VS)主鏈，并且交聯(lián)劑是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-可降解交聯(lián)劑。

在一種或多種實施方式中，微凝膠顆粒12由油包水乳劑(乳液，emulsion)形成。在PEG溶液與交聯(lián)劑溶液組合后(緊接著在完成凝膠化之前分配到微凝膠液滴中)，發(fā)生微凝膠顆粒12的凝膠化?？梢赃M一步地添加包括肽配體的多種底物以增強生物活性。在一種實施方式中，通過向純化的微凝膠顆粒12添加和活化自由基光引發(fā)劑以誘導化學交聯(lián)來實現(xiàn)支架形成。在另一種實施方式中，通過對純化的微凝膠顆粒12使用和/或活化內(nèi)源性存在的或外源性施加的谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶因子XIII以誘導酶促的交聯(lián)來實現(xiàn)支架形成，該微凝膠顆粒12在形成之前、形成期間或形成之后已經(jīng)用兩種肽配體修飾。在單獨的實施方式中，使用上述自由基和酶促方法的組合實現(xiàn)支架形成。

由于在體內(nèi)形成完全相互連接的微孔支架的能力，本公開主題的獲得的支架10提供了優(yōu)于當前多孔支架技術的優(yōu)點。通常，由于通過孔的移動自由，多孔支架提供更多的活細胞接近(即，不需要降解以允許像所有當前和先前的無孔和納米多孔支架那樣的穿透)。例如，當在體內(nèi)皮膚傷口中植入并退火支架10時，如在圖7B中看出的，當與相同材料的無孔凝膠相比時，在5天后觀察到顯著增強的細胞侵襲和生長中的組織結(jié)構(gòu)。圖7A示出了對于在注射24小時后，用支架10(標識為MAP支架)以及無孔對照注射的組織，SKH1-Hr^hr小鼠中的組織切片的H&E染色。圖7B示出了作為注射后天數(shù)的函數(shù)的傷口閉合(％)的圖。該圖示出了，當與無孔雙側(cè)對照(N＝5)相比時，在五(5)天的時間段內(nèi)，使用支架10的傷口閉合率存在統(tǒng)計學顯著的改善。圖7C示出了在SKH1-Hr^hr小鼠中，在5天體內(nèi)傷口愈合模型期間，傷口閉合的代表性圖像。圖7D示出了在7天的體內(nèi)BALB/c小鼠實驗期間，傷口閉合的代表性圖像。圖7E示出了來自BALB/c體內(nèi)傷口愈合的傷口閉合定量數(shù)據(jù)。在體內(nèi)7天后，與未治療對照、無孔PEG凝膠和缺少K和Q肽的凝膠相比，支架10促進明顯更快的傷口愈合。使用規(guī)范的、基于致孔劑的鑄造方法，體外生產(chǎn)的精確匹配傷口形狀的多孔凝膠表現(xiàn)出了可觀的傷口愈合率，與支架10相當，但缺乏可注射性(N≥5)。圖7F示出了對應于圖7D的每種治療類型的體內(nèi)7天期間傷口床(wound bed)閉合的痕跡。

此外，施用至微凝膠顆粒12或支架10的治療劑可以緩慢地或快速地釋放，并且取決于預期的治療(例如，如果其用于治療慢性傷口，則使用隨時間緩慢降解的更穩(wěn)定的交聯(lián)劑)，支架10具有在預定時間段內(nèi)通過水解、蛋白水解或酶解而分解的能力。此外，微凝膠支架10的退火質(zhì)量允許支架10作為組織密封劑起作用(例如，急性傷口、手術閉合等)，以及臨床上可用于模擬組織的不同模制形狀的填充。圖7G示出了如何使用類似于圖6A或6B的注射器裝置將包含微凝膠顆粒的溶液或漿料施加至治療部位，其中微凝膠符合注射部位的形狀(例如，在這種情況下為星形部位)，并且隨后將支架10退火成星形。

通過調(diào)節(jié)微凝膠支架10的降解速率，可以改變傷口中的疤痕形成或再生反應。在一種實施方式中，通過在MMP-可降解交聯(lián)劑中使用D-氨基酸而不是L-氨基酸來修飾微凝膠支架10的降解速率。調(diào)節(jié)微凝膠顆粒12與交聯(lián)劑中D-或L-手性的比值，調(diào)節(jié)組織中的降解速率。由D和L交聯(lián)的微凝膠(以1:1的比值)的混合物制成的支架10在注射21天后導致凝膠存在于組織中，然而，在僅有D的凝膠中，在體內(nèi)21天后沒有留下剩余的凝膠。組織愈合和疤痕形成反應還取決于D：L的化學計量，并因此取決于降解速率。圖8A-8G示出了直接與未治療的傷口相比，當使用D：L的1：1混合物時疤痕減少的效果。在1：1的D：L凝膠治療中，皮膚厚度加倍并且疤痕尺寸減少25％。此外，與未治療的情況相比，在凝膠治療的情況下，存在六(6)倍的毛囊和汗腺。

實驗性的

使用微流體的油包水乳液方法將連續(xù)的預凝膠含水相分割成如本文所描述的均勻的支架構(gòu)建塊。在微觀尺度上連續(xù)生成微凝膠顆粒12作為構(gòu)建塊，而不是使用典型的基于渦流和超聲的方法，能夠嚴格控制出現(xiàn)的支架10的形成環(huán)境和最終的材料性能。通過調(diào)節(jié)預凝膠溶液和擠壓油流(pinching oil flow)的流速以及微流體通道的幾何形狀，產(chǎn)生具有低多分散性(low polydispersity)的一系列微凝膠顆粒尺寸。雖然制造方法是連續(xù)的，但其實際上保持高通量屬性，其中生成速率是對于較大顆粒(>100μm)的250Hz至對于小顆粒(約15μm)的約1200Hz的范圍。這對于單個裝置每50分鐘轉(zhuǎn)化為大約100μl的預溶脹的凝膠。這種方法最終導致物理和化學上高度單分散的顆粒。微流體產(chǎn)生微凝膠顆粒“構(gòu)建塊”是容易擴展的過程：對于廣泛采用和使用的實際需求。

獲得的微凝膠顆粒12由以下的完全合成的水凝膠網(wǎng)組成：用細胞粘附肽(RGD[SEQ ID NO：3])和兩個轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶肽底物(K[SEQ ID NO：1]和Q[SEQ ID NO：2])修飾的聚(乙二醇)-乙烯基砜(PEG-VS)主鏈。微凝膠顆粒12通過邁克爾型加成與半胱氨酸封端的基質(zhì)金屬蛋白酶敏感性肽序列交聯(lián)，這允許細胞控制的材料降解和隨后的再吸收。

將微凝膠顆粒12純化至等滲細胞培養(yǎng)基的水性溶液中用于存儲，并且當用于形成凝膠時，微凝膠顆粒12通過活化因子XIII(FXIIIa)介導的K和Q肽之間的非標準的酰胺鍵彼此退火，該活化因子XIII作用為穩(wěn)定血凝塊的天然存在的酶。這種酶介導的退火過程允許將活細胞并入包含相互連接的微孔網(wǎng)絡的動態(tài)形成的支架10中。在添加FXIIIa之后，且在支架退火之前，微凝膠顆粒12的漿料可以通過注射器施加遞送，最終固化成其被注入的腔的形狀。圖9A示出了如何通過調(diào)節(jié)pH和溫度來改變退火動力學。為該實驗選擇的退火環(huán)境為pH 8.25和37℃的溫度。

在向微凝膠顆粒12添加FXIIIa時觀察到導致退火凝膠中儲能模量超過三倍增加的結(jié)構(gòu)變化。通過高真空SEM觀察證實退火被認為是支架形成所必需的，其中在脫水后，支架采用高度拉伸但相互連接的網(wǎng)，而沒有FXIIIa的構(gòu)建塊則分離成單獨的球形珠(圖9E)。

通過調(diào)節(jié)微凝膠粒徑和組成，能夠產(chǎn)生多組組裝的支架10。通過使用直徑為30至150μm的微凝膠顆粒12，實現(xiàn)了中值孔徑范圍為約10至約35μm的網(wǎng)絡)。篩選不同的PEG重量百分數(shù)和交聯(lián)劑化學計量以證明約10至1000Pa(其跨度為對于哺乳動物軟組織模擬物所需的剛度方案)的容易實現(xiàn)的存儲模量的范圍。圖9B示出了不同的水凝膠重量百分數(shù)用于產(chǎn)生不同剛度的材料。圖9C示出了用于在獲得的凝膠中產(chǎn)生不同剛度值的不同交聯(lián)劑化學計量(交聯(lián)劑末端(-SH)與乙烯基基團(-VS)的比值)。圖9D示出了對于無孔對照以及本文所描述的本發(fā)明多孔凝膠的％降解作為時間的函數(shù)的圖。對于體外的體積相等的凝膠，顯示了基于顆粒的多孔凝膠和無孔的降解動力學。由于更高的表面積和體積比以及更快的通過微孔凝膠的傳輸，基于顆粒的多孔凝膠比無孔凝膠降解快。使用1：1000進行降解，導致比傷口床中更高的蛋白酶濃度和更快的降解動力學。圖9E示出了用FXIIIa退火的支架的SEM圖像。圖9F示出了不含F(xiàn)XIIIa的微凝膠顆粒12的SEM圖像。未退火的顆粒見于圖9F中。

為了評估所產(chǎn)生的支架支持細胞生長和網(wǎng)絡形成的能力，開發(fā)了使用三種人細胞系的體外細胞形態(tài)學和增殖模型。這些包括：真皮成纖維細胞(HDF)、脂肪來源的間充質(zhì)干細胞(AhMSC)和骨髓來源的間充質(zhì)干細胞(BMhMSC)。將單細胞懸浮液動態(tài)合并于FXIIIa退火凝膠內(nèi)。在支架內(nèi)培養(yǎng)二十四(24)小時后，三種細胞系表現(xiàn)出高的細胞活力(≥93％)。HDF和AhMSC細胞系在6天培養(yǎng)期間顯示出持續(xù)的增殖，具有分別為1.5天和2天的倍增時間。觀察到BMhMSC也經(jīng)歷增殖，然而具有約12天的延長的計算倍增時間。

合并于支架的細胞在退火開始后90分鐘開始表現(xiàn)出擴散形態(tài)。在培養(yǎng)兩(2)天后，支架內(nèi)的所有觀察到的細胞顯示完全擴展的形態(tài)，這持續(xù)到第六天(6)。重要的是，第二天(2)觀察到所有細胞系的廣泛的網(wǎng)絡形成。細胞網(wǎng)絡在整個實驗中尺寸和復雜性增加。BMhMSC需特別值得注意，由于其廣泛的網(wǎng)絡形成和較慢的增殖速率，表明這些細胞能夠傳播到極長的長度，同時在微孔支架內(nèi)形成高度相互連接的細胞網(wǎng)絡。值得注意的是，在具有相同化學性能(5wt％，G’＝600Pa凝膠)和機械性能(4.5wt％，G’＝350Pa凝膠)的無孔凝膠中生長的細胞維持存活力，但沒有顯示任何可估計的網(wǎng)絡形成，甚至在培養(yǎng)六天后。

假設支架在體外能夠?qū)崿F(xiàn)細胞增殖和有利網(wǎng)絡形成的能力，表明支架能夠支持體內(nèi)細胞遷移，以及在支架內(nèi)的本體組織整合的能力。為了測試這個假設，使用鼠皮膚傷口愈合模型，處理了感興趣組織用于先前植入的多孔生物材料。重要的是，使用了限制組織向內(nèi)生長閉合(停止，closure)的縫合的橡膠夾板來防止傷口收縮，更好地模擬人類的愈合反應。由于基于微凝膠顆粒支架的可注射性，微凝膠顆粒能夠直接遞送到傷口部位，隨后通過外源FXIIIa進行原位退火。這通過同時將微凝膠顆粒“構(gòu)建塊”彼此連接以及與存在于周圍組織中的內(nèi)源性賴氨酸和谷氨酰胺殘基連接而提供了無縫界面。類似地，觀察到化學相同的無孔雙側(cè)對照的無縫界面。如在圖7B中示出的，盡管它們具有相似的界面，當注射到CLR:SKH1-Hr^hr小鼠的傷口中時，所產(chǎn)生的支架導致比無孔對照(在5天后，分別為60％相對于100％的剩余傷口面積)顯著更快的傷口閉合。

傷口閉合率的差異導致了對于以下研究，即對無孔和可注射的可分開類的凝膠的組織反應的差異。使用微凝膠顆粒的支架注射在體內(nèi)五(5)天后導致廣泛的傷口再上皮化。在支架頂端表面上觀察到具有分層鱗狀形態(tài)的角蛋白-5⁺細胞，然而沒有觀察到通過無孔傷口邊緣的細胞(角蛋白-5⁺或其他)。重要的是，支架能夠維持看起來是完整的毛囊的形成，其中傷口床內(nèi)的相鄰皮脂腺類似于未受傷的皮膚中的這些腺體的結(jié)構(gòu)。此外，在包含管狀結(jié)構(gòu)和上皮內(nèi)陷(epithelial invagination)的支架內(nèi)觀察到較大的角蛋白-5⁺組織結(jié)構(gòu)的其它情況。假設一起地，這些結(jié)果示出了對表皮再生有貢獻的更高級的集體遷移(即，一致的多細胞簇的移動)。盡管細胞能夠浸潤無孔雙側(cè)對照(如DAPI染色所示)，但在體內(nèi)五(5)天后沒有發(fā)現(xiàn)再上皮化或皮膚組織形成的跡象。

通過進一步研究，發(fā)現(xiàn)支架通過體內(nèi)復雜的血管網(wǎng)絡形成促進了本體整合。在五(5)天后，內(nèi)皮細胞和支持性周細胞(supporting pericyte)存在于支架內(nèi)，而在無孔雙側(cè)對照中僅存在沒有支持性周細胞的內(nèi)皮細胞的單個分支。共定位的內(nèi)皮細胞和周細胞的存在是成熟血管網(wǎng)絡形成的證據(jù)。據(jù)我們所知，這是在不包括外源性生長因子下，早期(<7天)周細胞遷移到合成的可注射材料或植入的多孔支架的第一個例子。

在研究由可注射支架提供的無縫界面時，在第一天(1)觀察到整體和免疫細胞數(shù)量的差異。在注射后一(1)天，與其無孔雙側(cè)對照相比，支架含有顯著更高數(shù)量的支架內(nèi)的細胞。這證實了先前在我們的體外網(wǎng)絡形成實驗中觀察到的細胞遷移的更大的容易性(ease)。此外，當與相同小鼠的無孔雙側(cè)對照相比時，支架及其周圍組織含有顯著更少數(shù)量的多形核細胞。該結(jié)果示出了在第一天(1)對于支架的總體較低的初始固有免疫應答。在注射后五(5)天后，相對于無孔對照，在周圍組織和支架內(nèi)存在較低分數(shù)的CD11b⁺細胞(活化的白細胞)，表明持續(xù)較低水平的炎癥免疫應答，與在體外構(gòu)建和植入的微孔支架中觀察到的一致。組合地，這兩個結(jié)果支持了當前未充分探究的幾何組分對來自化學相同的可注射生物材料的免疫刺激。

基于退火的微凝膠顆粒的支架代表了一類新型的可注射生物材料，其通過各個構(gòu)建塊的可靠實現(xiàn)的不完全的自組裝(imperfect self-assembly)和退火來引入微尺度的相互連接的孔隙。這種方法允許通過確定性化學組合物和微流體顆粒產(chǎn)生來控制微尺度和分層的宏觀尺度性能。兩種合并的活細胞和周圍的宿主組織能夠立即浸潤支架而不需要材料降解，這是在使用可注射支架之前從未實現(xiàn)的成就。

在體內(nèi)，可注射的微凝膠顆粒完全填充組織空隙，提供與周圍組織的無縫邊界。與可注射的無孔對照相比，獲得的支架的相互連接的微孔性促進了傷口部位的細胞遷移，導致與周圍組織的更大的本體整合，同時引起減少的宿主免疫應答。最終，這導致比類似地包含的可注射無孔凝膠更快的健康組織重塑。

該凝膠系統(tǒng)通過利用晶格形成的負空間促進復雜三維網(wǎng)絡在時間尺度上的發(fā)展，表現(xiàn)出了自底向上模塊化生物材料的方法的根本變化，這在先前的使用現(xiàn)有的水凝膠技術所未見過的。該策略的“即插即用(plug and play)”屬性允許結(jié)合廣泛范圍的已經(jīng)建立的材料(例如，纖維蛋白)、信號(例如，生長因子)和細胞群(例如，干細胞)。具有確定的化學和物理性能的構(gòu)建塊的復雜組合可以使得在不同的生理位置(例如，神經(jīng)、心臟、皮膚等)范圍內(nèi)的組織再生，其中顆粒退火的支架通過它們的構(gòu)建塊性能定制每個小生境。微孔隙率、可注射性和支架所固有的模塊化組裝的獨特組合具有改變體內(nèi)組織再生和組織再生的環(huán)境(landscape)的潛力。

使用如前所述的軟光刻(soft lithography)制造微流體油包水液滴發(fā)生器。簡言之，使用KMPR 1025或1050光致抗蝕劑(Microchem)在機械級硅晶片(University wafer)上制造主模具。根據(jù)制造商的建議，通過以不同速度旋轉(zhuǎn)光致抗蝕劑，獲得不同的通道高度。裝置使用聚(二甲基)硅氧烷184試劑盒(Dow Corning)由母料模制。將基料和交聯(lián)劑以10：1的質(zhì)量比混合，倒在模具上，并脫氣，然后在65℃下固化6小時。通過在50毫托和75W下用氧等離子體處理PDMS模具和玻璃顯微鏡載玻片(VWR)15秒來密封通道。在通道密封后，立即通過注入100μl RAIN-的溶液并在室溫下反應20分鐘，使通道官能化。然后通過空氣干燥通道，隨后干燥過夜。

使用如圖3A-3F和4A-4C所示的微流體油包水分割系統(tǒng)產(chǎn)生液滴。含水相是兩部分的1:1體積混合物：(i)在300mM三乙醇胺(Sigma)，pH 8.25中的10％w/v的4臂(arm)PEG-VS(20kDa)，被500μM的K-肽(Ac-FKGGERCG-NH₂[SEQ ID NO:1])(Genscript)、500μM的Q-肽(Ac-NQEQVSPLGGERCG-NH₂[SEQ ID NO:2])和1mM的RGD(Ac-RGDSPGERCG-NH₂[SEQ ID NO:3])(Genscript)預官能化以及(ii)與10μM的Alexa-fluor 647-馬來酰亞胺(Life Technologies)預先反應的8mM(對于三入口裝置為12mM)的二半胱氨酸修飾的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)(Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2[SEQ ID NO:4])(Genscript)底物。在用于分割系統(tǒng)之前，所有溶液在Leur-Lok注射器式濾器中通過0.2μm的聚醚砜(PES)膜無菌過濾。

在37℃下在用于實時監(jiān)測微凝膠質(zhì)量的溫育的顯微鏡載物臺(Eclipse Ti)上進行生成。輸入的水性溶液沒有明顯混合，直到液滴分割(佩克特數(shù)>10)。油相是補充有0.25％v/v80(Sigma-Aldrich)的重礦物(Fisher)油。在分割區(qū)域的下游，添加具有高濃度的80(5％v/v)的第二油入口，并混合到流動的液滴乳液中。最終，微凝膠-油混合物排出到較大(12mm的直徑，約1mL的體積)孔中，其中微凝膠顆粒在37℃下固化最少1小時。然后通過將油溶液覆蓋在HEPES緩沖鹽水pH 7.4的水性緩沖液中并在臺式離心機中以18000×g離心5分鐘來提取和純化該混合物。在含有10mM的CaCl₂和0.01％w/v的普朗尼克F-127(Sigma)的HEPES緩沖鹽水pH 7.4中洗滌基于微凝膠的顆粒。然后使微凝膠水性溶液溶脹并在37℃下用緩沖液平衡至少2小時。

為了確定液滴分割的操作方案，使用高速照像機(Phantom)實時監(jiān)測裝置操作，隨后圖像分析用于尺寸和多分散性測量(使用ImageJ軟件)以及分割頻率(Phantom PC2)。為了在該平臺上的穩(wěn)定的液滴分割：(i)以5ml/min同時引發(fā)所有的流動(含水流兩者和油流兩者)直到所有空氣已經(jīng)從裝置中沖洗，(ii)將水流速率降低到所需的總體積速率(水流速率在1.5至2μL/分鐘之間，并且油流速率在1至5μL/分鐘之間，持續(xù)5分鐘，(iii)從收集孔中吸出所有積累的液體，以確保收集單分散的微凝膠(μgel)，以及(iv)運行產(chǎn)生。

通過在18000×g下離心五分鐘，將完全腫脹的和平衡的“構(gòu)建塊”微凝膠顆粒造粒，并且通過吸出來去除過量的緩沖液(HEPES pH 7.4+10mM CaCl₂)，并且用無塵擦拭紙(cleanroom wipe)干燥。隨后地，將微凝膠顆粒分成等份，每份包含50ml的濃縮的構(gòu)建塊。將相等體積的HEPES pH7.4+10mM CaCl₂添加到濃縮的構(gòu)建塊溶液。這些中的一半包含2U/ml的最終濃度的凝血酶(Sigma)并且另一半包含10U/ml的最終濃度的FXIII(CSL Behring)。隨后將這些溶液充分混合，并且在18000×g下旋轉(zhuǎn)，隨后用無塵擦拭紙(American Cleanstat)去除過量的液體。

通過使用正位移移液管(Gilson)混合等體積的含有凝血酶和FXIII的構(gòu)建塊溶液起始退火。通過重復上下吸移以及使用移液管吸頭的攪拌來充分混合這些溶液。然后將混合溶液移液至所需位置(模具、孔板、小鼠傷口等)。

為了確定每種微凝膠的凝膠動力學，使用相同的化學組合物產(chǎn)生大規(guī)模(50μL)的無孔凝膠。將溶解在0.3M的TEOA中的30μL的2X PEG-VS+肽(RGD、K和Q肽)的溶液與溶解在水中的30μL的2X MMP-1交聯(lián)劑組合。將混合物快速渦旋，并且將50μL的混合物置于兩個8mm的間距為1mm的流變盤(rheological discs)(Anton Paar Physica MCR301流變儀)之間。然后在20分鐘的時間段內(nèi)，測量儲能模量(2.5Hz，0.1％應變)。

為了確定預退火的微凝膠顆粒和退火后支架的體積儲能模量，進行振幅掃描(0.01-10％應變)以找到各自的線性振幅范圍。選擇在線性范圍內(nèi)的振幅以運行振幅掃描(0.5-5Hz)。對于預退火的微凝膠顆粒，將50μL的微凝膠顆粒(5wt％的PEG-VS 4-臂MW＝20KDa，r＝0.8MMP-1交聯(lián)劑，以及合成肽濃度為250μM的合成K、合成肽濃度為250μM的合成Q和合成肽濃度為500μM的合成RGD)注入兩個8mm的間距為1mm的流變盤之間。對于退火后的支架測量，我們首先將50μL的摻有5U/mL最終濃度的FXIIIa和1U/mL最終濃度的凝血酶的微凝膠顆粒(N＝3)(5wt％的PEG-VS 4-臂MW＝20KDa，r＝0.8的MMP-1交聯(lián)劑，以及合成肽濃度為250μM的合成K、250μM的合成Q、500μM的合成RGD)吸移至兩個載玻片之間。允許將這種混合物在移除頂部載玻片之前部分退火10分鐘，并且置于在37℃的濕潤培育箱中90分鐘。隨后將支架置于HEPES緩沖鹽水(pH 7.4))過夜，以達到平衡。隨后將樣品置于在流變儀上的兩個8mm盤之間，并且與預退火的微凝膠顆粒同樣進行檢測。

為了確定退火的微凝膠支架中的中值孔徑，如上所述的，使用不同尺寸的微凝膠顆粒的儲備溶液(母液，stock solution)以將來自每個(總共9個支架)的三個單獨的支架退火。使用裝備有C2激光LED共聚焦的Nikon Ti eclipse顯微鏡(Nikon Ti eclipse)，在每個凝膠中截取單個切片，在每個切片之間分離50μm(每個凝膠10個切片，每種凝膠類型總共30個切片)。然后使用在中編寫的定制腳本(custome script)分析這些圖像，以識別孔區(qū)域并計算以px²計的每一個的尺寸。然后使用每個單獨的孔尺寸用于計算該凝膠的中值孔徑，并使用從原始顯微鏡圖像(0.31μm/px)的像素至μm的轉(zhuǎn)換將其轉(zhuǎn)換為μm²。然后通過將面積壓成圓形，并計算這些圓的特征直徑，將這些面積轉(zhuǎn)換成特征長度測量。對于30μm的微凝膠顆粒，平均孔徑為約12μm。對于100μm的微凝膠顆粒，平均孔徑為約19μm。對于150μm的微凝膠顆粒，平均孔徑為約37μm。應注意，間隙或空隙是連續(xù)的，并且不類似于通過微顆粒浸出或反蛋白石凝膠(inverse opal gel)制造方法產(chǎn)生的通過圓形孔連接的明確限定的球形開放區(qū)域，然而，參考孔徑可用于簡單地描述空隙空間的長度規(guī)模。

為了確定在添加FXIIIa之后微凝膠顆粒是否共價連接，使用SEM直接觀察支架。用FXIIIa(10U/ml)或僅用緩沖液處理微凝膠顆?；旌衔?。隨后，將構(gòu)建塊溶液置于1×1的硅晶圓片中，并在SEM(Hitachi S4700)高真空室(1×10^-3毫托)中干燥。然后，如圖9D和9F所示的，使用10kV(最大10mA)在200x或500x上觀察具有或不具有FXIIIa的構(gòu)建塊。

在補充有10μg/ml嘌呤霉素的DMEM(Life Technologies)中培養(yǎng)通過慢病毒轉(zhuǎn)染組成性表達GFP的HEK293T細胞。三種細胞用于體外實驗：人真皮成纖維細胞(HDF，Life Technologies)、骨髓來源的人間充質(zhì)干細胞(BMhMSC，Life Technologies)和脂肪來源的人間充質(zhì)干細胞(AhMSC，Life Technologies)。根據(jù)制造商的說明書(在合并至多孔或無孔的凝膠之前和之后)培養(yǎng)所有的細胞系。具體地，對于MSC群體減少的血清，使用基礎培養(yǎng)基(Life Technologies)來培養(yǎng)干細胞。

為了定量細胞增殖和體外多孔支架中網(wǎng)絡形成的可視化，基于顆粒的支架與如上所描述的微凝膠顆粒退火，在退火之前向構(gòu)建塊溶液添加細胞懸浮液。對于每種細胞系，在未補充有血清的相應培養(yǎng)基中制備最終濃度為25×10⁶個細胞/ml的細胞懸浮液。隨后，將2μl的細胞懸浮液添加至50μl的含F(xiàn)XIII的微凝膠顆?；旌衔镏校⑴c50μl的含凝血酶的微凝膠顆?；旌衔?500個細胞/μl的凝膠)合并。將該混合物注入至蓋玻片底部PDMS孔的角落中。用第二蓋玻片覆蓋孔頂部，并允許微凝膠/細胞混合物在37℃下經(jīng)受退火90分鐘。

退火完成后，移除頂蓋玻片，將適當?shù)耐耆囵B(yǎng)基添加至PDMS孔中。對于第0天時間點，將4％的PFA直接添加至PDMS孔中，并允許在4℃下固定過夜。其他細胞在5％的CO₂和37℃下生長指定的時間(2、4和6天)，此時用1×PBS將它們洗滌一次，并在4℃下用4％PFA固定過夜。通過將細胞與微凝膠顆粒(如上所述)混合，并將5μl的混合物吸移至模具的中心，將HEK-293-T細胞結(jié)合至星形模具中。緊接著，將不含細胞的微凝膠顆粒吸移至模具的其余部分中，并如上所述進行退火。

通過在體外培養(yǎng)0、2、4和6天后，計數(shù)存在于基于顆粒的支架構(gòu)建體中的細胞核的數(shù)目來評價增殖。用1×PBS中的2μg/ml DAPI溶液將細胞核染色2小時，隨后使用405nm的LED激光器在Nikon C2上觀察。具體地，通過在150μm的總z高度截取55個z切片并將每5個切片壓縮成最大強度投影(MIP)圖像來對每個支架成像。使用定制的腳本枚舉MIP中的細胞核，計數(shù)細胞的總數(shù)。對于每個時間點，分析了三個單獨的微凝膠支架的z堆疊圖像，其中每個z堆疊圖像測量總體積為1270×1270×150μm³(或約280nL)。90分鐘計數(shù)導致約525個細胞/μl凝膠的計算，與添加的實驗量(500個細胞/μl凝膠)一致。

為了在體外可視化微凝膠支架內(nèi)的細胞網(wǎng)絡形成，如上所述制備、生長和固定構(gòu)建體。用在1X PBS中的1％BSA將支架在室溫封閉1小時，隨后通過鬼筆環(huán)肽的羅丹明-B綴合物(Life Technologies)在室溫下對f-肌動蛋白染色3小時。然后用1X PBS中的1％BSA洗滌支架，隨后在室溫下用1X PBS中的2μg/ml的DAPI溶液復染色1小時。除了使用40倍放大的水浸透鏡之外，與增殖成像一樣進行成像。圖像堆疊的總高度為130μm，切片的總數(shù)為260(體積捕獲約15nL)。

將PEG-VS支架(5wt％的PEG-VS 4-臂MW＝20KDa，r＝0.8的MMP-1交聯(lián)劑，以及合成肽濃度為250μM的合成K[SEQ ID NO:1]、250μM的合成Q[SEQ ID NO:2]，500μM的合成RGD[SEQ ID NO:3])用于封裝細胞(500個細胞/μL)。所用的細胞系與微凝膠支架實驗中的相同。在置于合適的培養(yǎng)基中之前，形成凝膠20分鐘(TEOA 0.3M，pH 8.25)。在預定的時間點(t＝90分鐘、2天、4天和6天)后，使用PFA在4℃下過夜，將凝膠固定，洗滌并存儲在PBS中。將凝膠如在微凝膠支架中的那樣染色。當未成像時，將所有的樣品在4℃下在具有P/S的PBS中保存。使用C2共聚焦進行成像，正如在微凝膠支架體外實驗中的一樣。

用異氟烷(1.5％，10分鐘)麻醉CLR：SKH1-Hrhr小鼠(Charles River實驗室)(每次試驗N＝6)，然后剪斷指甲并注射止痛藥(丁丙諾啡，0.015μg/μL下60μL/20g)。拉緊皮膚并使用4mm活檢穿孔器在小鼠背部產(chǎn)生相同的圓形傷口。使用經(jīng)由7-8針縫合到周圍皮膚的橡膠夾板固定傷口的周邊，以防止通過收縮傷口閉合。將包含10U/ml FXIIIa的無孔或多孔水凝膠注射到傷口床中，允許其進行凝膠化10分鐘，隨后通過彈性紗布包裹物覆蓋傷口以防止動物相互作用。然后將小鼠分開至單獨的籠中。在接下來的48小時中每12小時皮下施用疼痛藥物(對于第1天，在手術后施用一次疼痛抑制劑)。

在第1天，通過異氟烷過量給藥處死小鼠(N＝6)，然后隨后進行脊柱錯位。使用外科剪刀除去背部的皮膚，并通過10mm的活檢穿孔器分離傷口部位。使用4％的甲醛在4℃立即地固定樣品(過夜)，然后轉(zhuǎn)移到乙醇中并將樣品包埋在石蠟塊中。然后將塊用超薄切片機(Leica)切成6μm的厚度，并進行蘇木精和曙紅(H&E)染色。為了量化水凝膠中的細胞浸潤和水凝膠周圍的免疫應答，對每個切片檢查一系列3個隨機高功率(40X)場顯微(high power field)(HPF)。通過計數(shù)注射的水凝膠內(nèi)的任何類型的細胞的總數(shù)(N＝5，其中每個傷口分析3個切片中的細胞總數(shù))來分析樣品的細胞浸潤(至凝膠中>0.1mm)。大于95％的浸潤凝膠的細胞是嗜中性粒細胞。為了測量免疫應答，檢查來自傷口的不同切片的3個HPF的平均值。在傷口邊緣的水凝膠的0.2mm內(nèi)的白細胞/HPF的總數(shù)量被定量并且對于每種傷口類型取平均值。將每個傷口的白細胞計數(shù)與其在相同動物上的雙側(cè)對照進行比較，并將相對差異記錄為每只動物的總免疫應答的分數(shù)。由于每只動物具有一個注射有微凝膠支架的傷口和一個具有無孔對照的傷口，因此這種比較是可能的。

每天對傷口進行成像以跟蹤傷口的閉合。使用高分辨率照相機對每個傷口部位成像。通過將傷口的像素面積與紅色橡膠夾板的10mm中心孔內(nèi)的像素面積進行比較來確定閉合分數(shù)。對于每種小鼠/支架類型，將閉合分數(shù)歸一化為第0天(圖7B)。

在第5天，處死小鼠(N＝6)，并如第1天的小鼠一樣收集組織。將樣品立即浸沒在TISSUE最佳切割溫度(OCT)流體中，并用液氮冷凍成固體塊。然后將塊用冷凍超薄切片機(Leica)冷凍切片為25μm的厚度，并且保持冷凍直至使用。然后將切片在室溫下用多聚甲醛固定30分鐘，用PBS水合，并保持在4℃直至染色。

含有組織切片的載玻片用1X PBS+0.05％吐溫-20(PBST)中的3％正常山羊血清(NGS)封閉，或同時用在1X PBST的3％NGS的X-100封閉和透化僅用抗角蛋白-5染色的切片。然后在1X PBST中3％NGS中洗滌切片。如下在的1X PBST中3％NGS中制備初級抗體稀釋液：

大鼠抗小鼠CD11b(BD Pharmingen)-1:100

大鼠抗小鼠PECAM-1(BD Pharmingen)-1:100

兔抗小鼠NG2(Millipore)-1:100

兔抗小鼠角蛋白5(Covance，Inc.)-1:250

在4℃下用第一抗體將切片染色過夜，隨后用1X PBST中3％NGS洗滌。在1X PBST中3％NGS中以1:100的稀釋度制備第二抗體。將切片在第二抗體中在室溫下溫育1小時，隨后用1X PBST洗滌。用2μg/ml的1X PBST中的DAPI在室溫下將切片復染色30分鐘。將切片安裝在Antifade Gold封片劑(mounting medium)中。

將從第5天的組織切片(來自無孔和微凝膠支架組織塊)獲得的共富集z-堆疊圖像壓縮成MIP，隨后分離成對應于每個激光通道(即，Gel，DAPI，CD11b)的單個圖像。凝膠通道圖像用于使用Adobe illustrator跟蹤凝膠-組織界面的邊緣。該線的寬度從界面(總厚度150μm)擴展到組織中和凝膠中75μm。然后將該線的新邊緣用于裁剪原始DAPI和CD11b圖像，以從組織凝膠界面僅捕獲對應于+/-75μm的區(qū)域。然后將這些圖像導入ImageJ，并將其疊加以將DAPI和CD11b通道合并為單個圖像。使用來自ImageJ的細胞計數(shù)插件分析該圖像，其中定量細胞核的總數(shù)以及CD11b+細胞的總數(shù)。最后，報道了組織內(nèi)和凝膠內(nèi)二者的具有相應的CD11b+信號的細胞核的分數(shù)。

圖11示出了治療受損組織102的方法的一個實施例。圖11示出了在哺乳動物的組織102中形成的傷口部位100。在操作500中，使用在其中包含微凝膠顆粒12的漿料(包含在水性溶液中)的遞送裝置110(例如，如圖所示的管)，將微凝膠顆粒12遞送至傷口部位100。接下來，如操作510所示，可選的施加器122用于將微凝膠顆粒12擴散至傷口部位100中及其上方。施加器122還用于使微凝膠顆粒12的上部的暴露表面與組織102的表面大致齊平。施加器122還可用于使微凝膠顆粒12的上部的暴露表面相對于組織102的表面隆起或升高，以允許用于細胞向內(nèi)生長的結(jié)構(gòu)增加以及防止在完全愈合時的組織界面凹陷。接下來，如操作520所示，開始微凝膠顆粒12的退火以形成退火的微凝膠顆粒12的支架10。在該特定的實施例中，手電筒形式的光源124用于照射微凝膠顆粒12、光引發(fā)劑(例如，曙紅Y)和自由基轉(zhuǎn)移劑(例如，RGD肽)的混合物。當然，也可以使用如本文所描述的其他的退火方式。圖11中所示的退火反應導致形成其中具有間隙空間的微凝膠顆粒12的共價穩(wěn)定的支架10。然后，來自周圍組織102的細胞106(如圖2C所示)開始浸潤支架10內(nèi)的空間，生長，刺激并最終實現(xiàn)組織102的愈合過程。在一種實施方式中，在退火反應之后，將繃帶或濕性敷料可選地置于支架填充的傷口上以保護其在愈合過程中免受損傷。在經(jīng)過一段時間之后，如操作530所示，支架10已經(jīng)降解，并且組織102已經(jīng)返回到愈合狀態(tài)。

為了評估多孔凝膠支架支持細胞生長和網(wǎng)絡形成的能力，使用三種人細胞系開發(fā)體外的細胞形態(tài)學和增殖模型：真皮成纖維細胞(HDF)、脂肪來源的間充質(zhì)干細胞(AhMSC)和骨髓來源的間充質(zhì)干細胞(BMhMSC)。將單細胞懸浮液動態(tài)合并至FXIIIa退火的多孔凝膠支架內(nèi)。在多孔凝膠支架內(nèi)培養(yǎng)二十四(24)小時后，三種細胞系表現(xiàn)出高細胞活力(≥93％，圖12B)。

合并至多孔凝膠支架中的細胞在退火開始后九十(90)分鐘開始顯示擴散的形態(tài)。在培養(yǎng)兩(2)天后，在多孔凝膠支架內(nèi)的所有觀察到的細胞表現(xiàn)出完全擴散的形態(tài)，這持續(xù)到第六天。重要地，在第二天觀察到所有細胞系的廣泛的網(wǎng)絡形成。細胞網(wǎng)絡在整個實驗中尺寸和復雜性增加。BMhMSC需特別值得注意，如圖12A所示的，BMhMSC的擴張網(wǎng)絡形成和較慢的增殖速率表明這些細胞能夠擴散到極長的長度，在微孔支架內(nèi)形成高度相互連接的細胞網(wǎng)絡。

如圖13A所示的，微凝膠顆粒12可以在退火之前與活細胞106的溶液合并且混合以產(chǎn)生微孔支架10，該微孔支架10包含駐留在微孔網(wǎng)絡中并且均勻或不均勻分散在宏觀的退火凝膠支架10內(nèi)的活細胞106。

可以將微凝膠顆粒12純化至等滲細胞培養(yǎng)基的水性溶液中用于保存，并且當用于形成多孔凝膠時，通過K和Q肽之間的非標準的酰胺鍵彼此退火，該非規(guī)范酰胺鍵由活化的因子XIII(FXIIIa)(一種負責穩(wěn)定血凝塊的天然存在的酶)介導。這種酶介導的退火過程允許活細胞106合并至包含相互連接的微孔網(wǎng)絡的動態(tài)形成的多孔支架10中。在添加FXIIIa之后，但在支架退火之前，可以通過注射器施加遞送微凝膠顆粒12的漿料(圖13A)，最終固化成它們被注入其中的腔的形狀，如圖13B-E所示的。

如圖14A所示的，微凝膠顆粒12的微流體制造使得能夠確定性地控制微凝膠尺寸和生產(chǎn)頻率。施加到微流體系統(tǒng)20的入口的壓力決定微凝膠產(chǎn)生的頻率(圖14B)。此外，如圖14C所示的，使用不同尺寸的微凝膠顆粒12產(chǎn)生的多孔微凝膠支架10具有不同的多孔特性，如網(wǎng)絡內(nèi)的中值孔徑。

雖然已經(jīng)示出并描述了實施方式，但是在不脫離本文公開的發(fā)明構(gòu)思的范圍的情況下，可以進行各種修改。因此，除了所附權利要求及其等效物之外，本文描述的主題不應受到限制。