本發(fā)明涉及改進(jìn)的熱穩(wěn)定噴霧干燥輪狀病毒疫苗制劑及其制備方法。本發(fā)明還公開了改進(jìn)的噴霧干燥方法以獲得熱穩(wěn)定的(熱穩(wěn)定)輪狀病毒疫苗制劑。本發(fā)明的疫苗制劑具有改善的熱穩(wěn)定性、易用性、易于運(yùn)輸和可負(fù)擔(dān)性(affordability)特征，其具有顯著更好的機(jī)會(huì)在發(fā)展中國家和低收入國家的疫苗接種計(jì)劃中成功采用。
背景技術(shù)：
：已經(jīng)確定輪狀病毒是嬰兒和幼兒嚴(yán)重腹瀉的主要原因。據(jù)估計(jì)，每年全球60萬5歲以下的兒童死于輪狀病毒腹瀉，另有200萬兒童住院。其中90％的死亡發(fā)生在發(fā)展中國家。輪狀病毒具有高度傳染性和抗性，無論水質(zhì)和可用的衛(wèi)生條件如何，世界上幾乎每個(gè)兒童都有感染的風(fēng)險(xiǎn)。輪狀病毒疫苗通常施用于兒童以保護(hù)他們免于輪狀病毒感染。2009年6月5日，世界衛(wèi)生組織(WorldHealthOrganization，WHO)建議將輪狀病毒疫苗納入所有國家免疫接種計(jì)劃。輪狀病毒疫苗計(jì)劃(RotavirusVaccineProgram)和加速疫苗引入倡議(AcceleratedVaccineIntroductionInitiative)已經(jīng)在發(fā)展中國家人群中運(yùn)作以研究輪狀病毒疫苗，從而協(xié)助發(fā)展中國家將輪狀病毒疫苗引入常規(guī)免疫接種計(jì)劃。這些伙伴關(guān)系由國際非政府組織PATH、WHO、美國疾病控制和預(yù)防中心以及全球疫苗和免疫接種聯(lián)盟牽頭。國際研究數(shù)據(jù)表明，目前輪狀病毒疫苗對(duì)重癥輪狀病毒胃腸炎(rotavirusgastroenteritis，RVGE)具有85％至95％的效力。然而，當(dāng)將其用在大多數(shù)輪狀病毒導(dǎo)致死亡發(fā)生的發(fā)展中國家中，以及在獲得治療方面受到限制時(shí)，仍存在問題。一個(gè)主要原因是，這些國家既沒有準(zhǔn)備也沒有嚴(yán)格遵守兒童的免疫接種時(shí)間表，盡管事實(shí)上世界上幾乎每個(gè)兒童都將在五歲之前遭受輪狀病毒感染。其主要原因是主要與當(dāng)前疫苗的程序適應(yīng)性(programmaticsuitability)和成本有關(guān)。程序適應(yīng)性是WHO為疫苗進(jìn)行資格預(yù)審所開發(fā)的一個(gè)新過程。資格預(yù)審過程包括審查生產(chǎn)過程和質(zhì)量控制程序，審查臨床數(shù)據(jù)，測(cè)試批次的一致性，以及WHO和國家監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)制造設(shè)施的聯(lián)合訪問。一旦評(píng)估完成并且如果疫苗對(duì)于購買原則上被認(rèn)為是可接受的，則被認(rèn)為是預(yù)先具有資格的并被公布在WHO網(wǎng)站上。現(xiàn)有的疫苗僅在特定溫度下穩(wěn)定有限的持續(xù)時(shí)間。本領(lǐng)域公知的是，疫苗必須在保持在2℃至8℃的冷藏溫度下儲(chǔ)存和運(yùn)輸。此外，還公知的是，疫苗必須在從冷藏中取出時(shí)立即施用。目前批準(zhǔn)的疫苗在2℃至8℃下穩(wěn)定達(dá)24至36個(gè)月。研究表明，如果一種目前WHO批準(zhǔn)的輪狀病毒疫苗Rotateq無意中被暴露或儲(chǔ)存在高于8℃的溫度下，則其最多在9℃至25℃下暴露48小時(shí)或在26℃至30℃下暴露僅12小時(shí)內(nèi)保持效力。事實(shí)上，如果這種疫苗暴露于高于30℃的溫度，或者如果上述時(shí)間已經(jīng)過去，則該疫苗必須被丟棄，因?yàn)樗褤p失其效力。有限的數(shù)據(jù)表明，如果疫苗無意中暴露于低于0℃的溫度，則仍保持疫苗的效力。這使得輪狀病毒疫苗的嚴(yán)格冷鏈儲(chǔ)存和運(yùn)輸成為必要，這在發(fā)展中地區(qū)和低收入地區(qū)是特別成問題，那里維持疫苗效力和功效所需的冷鏈不完善、負(fù)擔(dān)過重或不存在，從而導(dǎo)致大量疫苗被浪費(fèi)，并且在最壞的情景下危及潛在接受者的生命。據(jù)報(bào)道，浪費(fèi)高達(dá)25％至50％。國際專利申請(qǐng)?zhí)朩O2009042202公開了用于保存輪狀病毒的制劑。這個(gè)發(fā)明提供了用于穩(wěn)定液體和干燥制劑中的病毒的制劑和方法。特別地，提供了包含穩(wěn)定輪狀病毒生存力的Zn2+陽離子的制劑。疫苗接種方法包括中和胃內(nèi)容物和施用該發(fā)明的疫苗制劑。美國專利申請(qǐng)?zhí)朥S20120308526公開了聲波低壓噴霧干燥法。該發(fā)明提供了在低壓下從振動(dòng)噴嘴噴霧干燥藥物粉末的方法。該方法可以有效地噴霧干燥厚或粘稠的溶液或混懸液，以提供小的均勻顆粒。該發(fā)明包括通過從振動(dòng)噴嘴低壓噴霧的方法制備的干顆粒組合物。除了熱穩(wěn)定以外，從程序的角度來看疫苗合適也是重要的。疫苗應(yīng)容易地制備成其最終形式，在冷鏈中占據(jù)小體積，并且在使用后易于處置。包括冷凍干燥疫苗以及噴霧干燥的候選疫苗之大多數(shù)現(xiàn)有固體形式的疫苗包裝在單獨(dú)的容器/組件中，并且需要注射器和小瓶以及用于重構(gòu)和施用的其他復(fù)雜和昂貴的機(jī)構(gòu)。這在疫苗的施用中造成困難，并且也大大增加了使冷鏈負(fù)擔(dān)過重的疫苗足跡(footprint)。這也進(jìn)而增加了運(yùn)輸和分配挑戰(zhàn)、用于儲(chǔ)存的物流，并且易于導(dǎo)致潛在致命的重構(gòu)錯(cuò)誤例如緩沖劑/疫苗錯(cuò)配、污染、錯(cuò)誤體積施用或通過錯(cuò)誤途徑施用等。很明顯，初級(jí)包裝對(duì)上述程序方面有最大的影響。正在開發(fā)和測(cè)試用于疫苗施用的許多遞送裝置。為了使這些多樣且有前景的遞送裝置與疫苗成功匹配，關(guān)鍵是設(shè)計(jì)提供最大包裝靈活性的疫苗制劑。常用的穩(wěn)定化小瓶凍干法產(chǎn)生疫苗餅，其在藥物遞送裝置中提供最小量的包裝靈活性。即使在藥物遞送裝置(例如雙室注射器和藥筒裝置)中進(jìn)行凍干過程，然而由于裝置以及加工成本，其成本也極高。對(duì)于在低收入地區(qū)廣泛采用的疫苗來說，保持加工和包裝疫苗的低成本至關(guān)重要。對(duì)疫苗價(jià)格有影響的另一組分是用于制劑中的穩(wěn)定劑和賦形劑。從管理和安全的角度來看，使用的賦形劑和穩(wěn)定劑應(yīng)該既不含動(dòng)物來源的物質(zhì)也不含有動(dòng)物組分，這也是至關(guān)重要的。事實(shí)上，在一些國家，出于文化和宗教原因也不希望如此。因此，為了解決上述問題，需要一種熱穩(wěn)定的、劃算的疫苗，其在解決運(yùn)送疫苗的物流方面將是疫苗接種計(jì)劃的一個(gè)巨大優(yōu)勢(shì)，所述疫苗在室溫下保持其效力，并且是低收入和發(fā)展中世界國家可以負(fù)擔(dān)得起的。發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是提供改進(jìn)的熱穩(wěn)定噴霧干燥的輪狀病毒疫苗制劑。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供獲得改進(jìn)的熱穩(wěn)定噴霧干燥輪狀病毒疫苗制劑的噴霧干燥方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供改進(jìn)的噴霧干燥方法以獲得改進(jìn)的熱穩(wěn)定噴霧干燥輪狀病毒疫苗制劑，所述方法使用雙流體噴嘴(two-fluidnozzle)以通過所述噴嘴霧化流體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供改進(jìn)的熱穩(wěn)定噴霧干燥輪狀病毒疫苗制劑，其使在升高的溫度下的效力損失消除或顯著最小化，持續(xù)更長的時(shí)間段，從而減少對(duì)冷藏和冷鏈維持的依賴。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供制備改進(jìn)的熱穩(wěn)定噴霧干燥輪狀病毒疫苗制劑的方法，所述制劑包含選自牛、恒河猴(rhesus)、人、綿羊(ovine)、恒河猴/人重配株(reassortant)或牛/人重配株的活輪狀病毒毒株。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供制備改進(jìn)的熱穩(wěn)定噴霧干燥輪狀病毒疫苗制劑的方法，所述制劑包含單價(jià)或多價(jià)輪狀病毒血清型混合物中的輪狀病毒毒株。本發(fā)明的另一個(gè)目的是制備改進(jìn)的熱穩(wěn)定噴霧干燥的基于粉末或顆粒的輪狀病毒疫苗制劑。本發(fā)明的另一個(gè)目的是制備改進(jìn)的熱穩(wěn)定噴霧干燥輪狀病毒疫苗制劑，其具有用于通過經(jīng)口遞送裝置填充和施用的理想性質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是制備改進(jìn)的熱穩(wěn)定的噴霧干燥的基于粉末或顆粒的輪狀病毒疫苗制劑，并將其與摻和劑(blendingagent)共混以賦予其用于通過經(jīng)口遞送裝置填充和施用的理想性質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供劃算的方法來制備可被低收入和發(fā)展中世界國家負(fù)擔(dān)得起的劃算的改進(jìn)的熱穩(wěn)定輪狀病毒疫苗制劑。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：因此，本發(fā)明涉及改進(jìn)的熱穩(wěn)定噴霧干燥輪狀病毒疫苗制劑。本發(fā)明還提供了噴霧干燥方法以獲得改進(jìn)的熱穩(wěn)定噴霧干燥輪狀病毒疫苗制劑。所述方法用于從含有不同血清型的液體輪狀病毒疫苗中單獨(dú)或組合地除去水部分(含水輪狀病毒疫苗不穩(wěn)定性的主要來源之一)，以形成脫水的穩(wěn)定顆粒。通過使用噴霧干燥方法，用制劑成分的穩(wěn)定相互作用代替去穩(wěn)定化的水相互作用來完成脫水，從而提供通過劃算的方法制備的更加熱穩(wěn)定的疫苗。改進(jìn)的熱穩(wěn)定噴霧干燥輪狀病毒疫苗制劑可包含在單價(jià)或多價(jià)輪狀病毒血清型混合物中選自牛、恒河猴、人、綿羊、恒河猴/人重配株或牛/人重配株的活輪狀病毒毒株。本發(fā)明涉及使用雙流體噴嘴噴霧干燥方法的噴霧干燥方法的用途，其用于在適當(dāng)壓力、流速、干燥溫度和加壓霧化氣體下使用霧化氣體將通過噴嘴的流體霧化。所述干燥和加壓氣體選自氮、氬、CO2或空氣、或其組合。由此獲得的熱穩(wěn)定輪狀病毒疫苗制劑具有在發(fā)展中地區(qū)和低收入地區(qū)經(jīng)常遇到的高溫下保留效力的潛力(所述地區(qū)存在大多數(shù)輪狀病毒負(fù)擔(dān))，并且具有部分或完全消除疫苗冷鏈依賴性的潛力。因此，本發(fā)明公開了改進(jìn)的熱穩(wěn)定輪狀病毒疫苗制劑，其具有更強(qiáng)的熱穩(wěn)定性、減少的足跡、低成本的運(yùn)輸和易于使用的特征。附圖說明圖1描繪了當(dāng)以1×劑和10×劑噴霧干燥時(shí)先導(dǎo)制劑(leadformulation)SD62的累積效力損失。圖2描繪了DoE共混的10×批次方法加上8周的穩(wěn)定性損失。圖3描繪了共混和未共混的粉末樣品的水分含量比較。圖4描繪了DoE批次(未共混，10×輪狀病毒疫苗制劑)的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。圖5A描繪了在先導(dǎo)制劑SD64中于4℃下儲(chǔ)存指定時(shí)間量的5種輪狀病毒噴霧干燥的血清型的效力變化。圖5B描繪了在先導(dǎo)制劑SD64中于37℃下儲(chǔ)存指定時(shí)間量的5種輪狀病毒噴霧干燥的血清型的效力變化。圖6A描繪了SD66在4℃下保留效力24周。圖6B描繪了SD66在37℃下保留其效力24周。圖7A描繪了SD64可重復(fù)性批次的加工損失(processloss)比較。圖7B描繪了SD66可重復(fù)性批次的加工損失比較。圖8描繪了當(dāng)在4℃和37℃下孵育時(shí)SD66可重復(fù)地保留效力16周。圖9A和圖9B描繪了SD64和SD66分別在45℃下保留效力2周和4周。帶有舉例說明和附圖的本發(fā)明具體實(shí)施方式為了消除現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺點(diǎn)，本發(fā)明提供了改進(jìn)的熱穩(wěn)定噴霧干燥輪狀病毒疫苗制劑。更具體地，本發(fā)明提供了改進(jìn)的噴霧干燥方法以獲得所述輪狀病毒疫苗制劑。更具體地，本發(fā)明公開了通過噴霧干燥方法制備的多價(jià)熱穩(wěn)定的輪狀病毒疫苗，以使得所述疫苗具有改善的熱穩(wěn)定性、易用性、易于運(yùn)輸和可負(fù)擔(dān)性特征，其具有顯著更好的機(jī)會(huì)在發(fā)展中國家和低收入國家的疫苗接種計(jì)劃中采用。為了合理地實(shí)現(xiàn)噴霧干燥方法和制劑，其最好地支持方法產(chǎn)率、熱穩(wěn)定性和隨后直至施用的對(duì)疫苗處理，已經(jīng)利用了實(shí)驗(yàn)篩選策略的部分因子設(shè)計(jì)(fractionalfactorialdesign)以從賦形劑/穩(wěn)定劑及其組合中針對(duì)其賦予單個(gè)以及多種血清型熱穩(wěn)定性的能力方面進(jìn)行選擇。所述熱穩(wěn)定噴霧干燥輪狀病毒疫苗制劑獲自包含由美國食品和藥物管理局(UnitedStatesFoodandDrugAdministration，USFDA)定義的“通常認(rèn)為安全的”(GenerallyRegardedAsSafe，GRAS)之賦形劑和穩(wěn)定劑的液體疫苗制劑(進(jìn)料)，并且在噴霧干燥期間和之后以及由在噴霧干燥(進(jìn)料)之前和噴霧干燥粉末重構(gòu)之后獲得的液態(tài)中，向包含單價(jià)和多價(jià)血清型的輪狀病毒疫苗提供熱穩(wěn)定性。所述賦形劑和穩(wěn)定劑選自-(a)糖類，例如麥芽糖糊精、蔗糖、乳糖、山梨糖醇、甘露糖醇和海藻糖；(b)二價(jià)離子蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定劑如Zn(II)和Ca(II)；(c)緩沖劑，例如4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、Tris、磷酸鹽或組氨酸；(d)鹽，例如氯化鈉(NaCl)；(e)填充劑，例如低粒度糖球/藥物球(NPS)、麥芽糖糊精、山梨糖醇、甘露糖醇、葡聚糖或乳糖；(f)活化劑，例如精氨酸、谷氨酸、谷氨酸鈉；(g)分散劑，例如吐溫(Tween)20和吐溫80；以及(h)表面活性劑，例如十二烷基硫酸鈉(SDS)、聚乙二醇(PEG)400、PEG-300、PEG-400和PEG-600、普朗尼克(Pluronic)68和F127。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用液體疫苗進(jìn)料形成所述噴霧干燥疫苗的制劑，所述液體疫苗進(jìn)料包含：輪狀病毒血清型，1％至15％(w/v)蔗糖或海藻糖、或其組合；10mM至100mMpH緩沖組分或其組合，pH范圍為6.0至8.0；0.001％至0.08％的表面活性劑，0.1mM至5mM的二價(jià)陽離子和0.5％至10％的填充劑。本發(fā)明的輪狀病毒疫苗制劑包含所施用范圍為每劑8.18×106至2.0×106的至少一種輪狀病毒血清型，所述至少一種賦形劑的范圍為1％至15％(w/v)，所述至少一種緩沖劑的范圍為10mM至100mM，所述至少一種表面活性劑的范圍為0.001％至0.08％且pH為6-8。選擇賦形劑和穩(wěn)定劑(特別是緩沖劑)以允許二價(jià)離子如Zn(II)和Ca(II)的最大溶解度，其主要是最大過程穩(wěn)定性所需的并且還在輪狀病毒于升高的溫度下經(jīng)延長的時(shí)間段的儲(chǔ)存穩(wěn)定性中起作用。還選擇賦形劑及其組合以產(chǎn)生粉末，其特征在于玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(glasstransitiontemperature，Tg)高于疫苗的預(yù)期儲(chǔ)存溫度。高于預(yù)期儲(chǔ)存溫度的制劑的Tg表明，那些制劑在低于Tg的升高溫度下的儲(chǔ)存期間將保持剛性玻璃態(tài)。本發(fā)明的穩(wěn)健性(robustness)取決于由許多報(bào)告關(guān)鍵質(zhì)量屬性的分析測(cè)定對(duì)其的評(píng)價(jià)和驗(yàn)證。優(yōu)化用于噴霧干燥方法的關(guān)鍵方法參數(shù)(criticalprocessparameter，CPP)以產(chǎn)生關(guān)鍵質(zhì)量屬性，例如現(xiàn)有技術(shù)中已知的影響配制的疫苗之穩(wěn)定性和性能的效力、產(chǎn)率、水分等。因此，在本發(fā)明中，監(jiān)測(cè)的對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的響應(yīng)包括通過基于“定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”(ReverseTranscriptasePolymeraseChainReaction，RTPCR)的多價(jià)定量效力測(cè)定所測(cè)量的效力、使用KarlFisher或重量法測(cè)定水分含量、包括玻璃化轉(zhuǎn)變溫度、流動(dòng)和固結(jié)性質(zhì)的熱性質(zhì)以及噴霧干燥材料的目視觀察。參數(shù)(如入口溫度、吸氣、固體含量百分比)已被評(píng)估為CPP，以研究它們對(duì)臨界質(zhì)量屬性(如水分、產(chǎn)率、粒度和出口溫度)的影響。為了優(yōu)化CPP，在表1中示出了代表最終制劑并因此可用于過程優(yōu)化的無病毒安慰劑制劑組成的一個(gè)實(shí)例。表1：用于噴霧干燥過程優(yōu)化的安慰劑制劑的組成。賦形劑組成蔗糖1.765M檸檬酸鈉235mM磷酸鈉118mMpH6.2水qs50mL本發(fā)明還公開了使用組合了加壓霧化氣體和液體形式的疫苗制劑(以下稱為液體疫苗制劑(進(jìn)料))的“雙流體噴嘴”(二元噴嘴)完成的噴霧干燥方法。所述雙流體噴嘴噴霧干燥方法使用在4bar至7bar的壓力范圍和0℃至20℃溫度范圍下的加壓霧化氣體。用于霧化的干燥和加壓氣體選自純度不小于95％(v/v)的氮、氬、CO2，或空氣，且水分含量不大于2％。干燥氣體處于這樣的壓力，其允許氣體對(duì)于特定規(guī)模的操作和設(shè)備(例如BuchiB290高級(jí)模型)以25Nm3/小時(shí)至35Nm3/小時(shí)，優(yōu)選30Nm3/小時(shí)的速率流動(dòng)，并且在0℃至200℃的溫度范圍以及35℃至60℃的出口溫度范圍下進(jìn)行。所述噴霧干燥過程還包括使用“雙流體噴嘴”以通過噴嘴霧化流體，其中對(duì)于特定規(guī)模的操作和設(shè)備(例如BuchiB290高級(jí)模型)，將噴嘴孔從直徑0.7mm調(diào)節(jié)至1.2mm，優(yōu)選1mm，以調(diào)節(jié)在以D90約30μm為特征的粒度下的產(chǎn)率＞60％。此外，調(diào)整所述二元噴嘴以調(diào)節(jié)噴霧羽流(sprayplume)，從而產(chǎn)生與干燥氣體的最大產(chǎn)物接觸和最小損失，從而導(dǎo)致高產(chǎn)物產(chǎn)率。所述噴霧干燥方法使用范圍為10.00g/100mL至25.00g/100mL，優(yōu)選約21g/100mL的液體進(jìn)料固體含量，用于最佳干燥和產(chǎn)率，并且對(duì)于特定的操作規(guī)模，所述液體疫苗制劑(進(jìn)料)以0.3mL/分鐘至10.0mL/分鐘的流速進(jìn)料。在表2中給出了優(yōu)化的方法參數(shù)的一個(gè)實(shí)例。表2：優(yōu)化的方法參數(shù)，其支持最大產(chǎn)率和最小水分含量。使用上述優(yōu)化的參數(shù)和所述組成的噴霧干燥方法產(chǎn)生噴霧干燥粉末，通過防止加工中的損失，特別是通過防止設(shè)備死體積中的材料損失，提高粉末產(chǎn)率至＞60％。具有上述優(yōu)化參數(shù)的所述加壓霧化氣體如氮或氬以及所述組成產(chǎn)生具有殘留水分含量＜2％的噴霧干燥粉末，從而與使用殘留水分含量＞2％的環(huán)境或除濕空氣相比，其防止與水的存在相關(guān)的疫苗降解途徑。重要的是避免在加工和儲(chǔ)存過程中疫苗抗原的損失或使其保持最小以使與抗原過量填充相關(guān)的疫苗的成本最小化。因此，方法和制劑的一個(gè)關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)是當(dāng)在37℃下儲(chǔ)存并分析至少4周時(shí)，可重復(fù)地證明可接受的效力損失[在本發(fā)明中小于Log10＝[0.5]]，從而滿足世界衛(wèi)生組織指示VVM30標(biāo)準(zhǔn)的最高熱穩(wěn)定性。為了節(jié)約加工成本，必須減少加工特定量材料所需的時(shí)間量。因此，以高10倍(10×)滴度的批次進(jìn)行噴霧干燥，并用摻和劑進(jìn)一步稀釋回收的濃縮粉末10次，可以將加工時(shí)間減少10倍，并提高該過程的生產(chǎn)量。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，用于噴霧干燥的輪狀病毒血清型包含范圍為約1×104至1×109IU/mL的血清型的一種或組合，并與填充劑和/或緩沖劑共混。通過允許選擇具有不同物理化學(xué)性質(zhì)的摻和劑，另外的共混過程有機(jī)會(huì)改造粉末性質(zhì)，以適合于在不同的易于使用的容器封閉件中精確和可重復(fù)的稱重和填充。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，使用具有精確填充操作所需的理想粉末流動(dòng)性質(zhì)的摻和劑來改善噴霧干燥粉末的流動(dòng)性質(zhì)?？捎糜谒龇勰└脑斓膿胶蛣┑膶?shí)例包括糖和糖醇，如各種大小和級(jí)別的環(huán)糊精、麥芽糖糊精、右旋糖、葡萄糖、甘露糖醇淀粉、山梨糖醇、麥芽糖醇、木糖醇和乳糖。本發(fā)明改進(jìn)的熱穩(wěn)定噴霧干燥輪狀病毒疫苗制劑包含具有單價(jià)和多價(jià)輪狀病毒毒株的單個(gè)或多種輪狀病毒血清型，其適當(dāng)?shù)匕b為單劑量或多劑量。易于使用的包裝的實(shí)例包括提供有疫苗粉末和用于重構(gòu)的稀釋劑的小袋(sachet)、雙室小瓶，其中噴霧干燥的輪狀病毒疫苗和具有易碎密封件的雙室袋/單個(gè)容器封閉件(其可以被手指在稀釋劑/緩沖室上擠壓時(shí)破裂)允許固體噴霧干燥的輪狀病毒疫苗和稀釋劑混合。使用易于使用的包裝提高了疫苗施用的方便性以及降低了多組分疫苗的開放操作/重構(gòu)的風(fēng)險(xiǎn)。重構(gòu)錯(cuò)誤包括緩沖劑/疫苗錯(cuò)配、錯(cuò)誤的體積、污染等。此外，它們具有減少疫苗足跡的潛力，從而減輕傳統(tǒng)多組分初級(jí)包裝選擇(例如用于每個(gè)組件以及相關(guān)聯(lián)的注射器和適配器的單獨(dú)小瓶)所面臨的運(yùn)輸以及分配挑戰(zhàn)。由此獲得的熱穩(wěn)定噴霧干燥的輪狀病毒疫苗粉末也可以配制成可迅速分散的片劑劑型。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，液體五價(jià)進(jìn)料制劑的噴霧干燥在每種輪狀病毒血清型(即G1、G2、G3、G4和P1)的更高病毒滴度下進(jìn)行，優(yōu)選10倍量，而不會(huì)不利地影響過程中的效力。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)于五種血清型(即G1、G2、G3、G4和P1)的混合物，以更高的病毒滴度進(jìn)行液體五價(jià)進(jìn)料制劑的噴霧干燥。當(dāng)以1倍(1×)劑水平噴霧干燥，或以10×劑滴度水平從噴霧干燥粉末獲得共混的疫苗制劑時(shí)，由此獲得的熱穩(wěn)定噴霧干燥輪狀病毒疫苗(不論血清型及其組合)在2℃-8℃下經(jīng)至少24個(gè)月不超過效力損失，并且當(dāng)在合適體積的含水稀釋劑中重構(gòu)并在2℃-8℃下孵育24小時(shí)時(shí)，也不超過Log10[0.5]的效力損失，從而促進(jìn)施用用于活動(dòng)設(shè)定(campaignsetting)的多劑量重構(gòu)疫苗并減少浪費(fèi)。還希望程序性地使粉末狀疫苗容易地溶解在稀釋劑中用于使用以促進(jìn)在更少的時(shí)間內(nèi)免疫接種更多的對(duì)象。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將噴霧干燥粉末的全部粉末劑量溶解于水或水溶液中不超過60秒。經(jīng)口施用疫苗在胃酸中存活至關(guān)重要。通過在噴霧干燥的疫苗中并入酸中和能力(AcidNeutralizationCapacity，ANC)作為緩沖劑/抗酸劑粉末，通過中和胃酸在經(jīng)口施用后保護(hù)疫苗免受胃酸的損害。緩沖/抗酸組分選自HEPES、檸檬酸鹽、組氨酸、碳酸鈣、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鈣、碳酸氫鉀、氫氧化鋁或氫氧化鎂、或其組合。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述噴霧干燥的輪狀病毒粉末與緩沖劑和/或填充劑共混，從而產(chǎn)生范圍為2.0mEq/g至5.0mEq/g粉末的酸中和能力。因此，本發(fā)明提供了熱穩(wěn)定、易于使用、易于運(yùn)輸和可負(fù)擔(dān)的噴霧干燥輪狀病毒疫苗，其將影響發(fā)展中國家數(shù)百萬兒童的健康。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將認(rèn)識(shí)到該方法和制劑對(duì)其他病毒的適用性，所述其他病毒包括但不限于麻疹病毒、腮腺炎病毒、風(fēng)疹病毒、腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、單純皰疹病毒、EB病毒(Epstein-Barvirus)。類似地，所述方法和制劑適用于細(xì)菌，所述細(xì)菌包括但不限于分枝桿菌屬(Mycobacterium)、肺炎球菌屬(Pneumococcus)、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)、利斯特氏菌屬(Listeria)、大腸桿菌(E.Coli)、鏈球菌屬(Streptococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)和弧菌屬(Vibrio)。以下實(shí)施例舉例說明但不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1：噴霧干燥對(duì)輪狀病毒血清型穩(wěn)定性的作用已經(jīng)制備了含有5種人-牛輪狀病毒血清型G1、G2、G3、G4和P1的一種示例性先導(dǎo)制劑SD62(表3)，對(duì)于每種血清型具有0.818×107的病毒滴度。表3：針對(duì)含有輪狀病毒血清型G1、G2、G3、G4和P1的輪狀病毒疫苗制劑的噴霧干燥熱穩(wěn)定性評(píng)價(jià)DoE制劑的組成。用0.1NHCI或NaOH將進(jìn)料溶液的pH調(diào)節(jié)至6.2。在70℃-75℃的入口溫度、43℃-48℃的出口溫度、吸氣器在70-75％操作下進(jìn)行噴霧干燥。進(jìn)料速率保持在0.4-1.0mL/分鐘，且進(jìn)料固體為17-20.45％g/mL，噴霧氣流為30Nm3/小時(shí)，霧化壓力為5bar。所用的噴霧噴嘴是Buchi雙流體(0.7mm)，用于收集粉末的旋風(fēng)分離器是BuchiHP。在低RH(＜5％)條件下進(jìn)行對(duì)所收集粉末的回收。a)研究1：使用MettlerToledo鹵素天平或/和KarlFischer滴定儀測(cè)試所回收噴霧干燥粉末的瞬時(shí)水分含量，并且發(fā)現(xiàn)水分含量＜2.0％。b)研究2：將經(jīng)回收的噴霧干燥粉末以150mg/mL的濃度用MilliQ水重構(gòu)，并且與液體對(duì)照(儲(chǔ)存在-70℃)相比測(cè)試加工損失，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的損失統(tǒng)計(jì)學(xué)上等于零。c)研究3：將剩余的經(jīng)回收噴霧干燥粉末密封在玻璃小瓶中，并在37℃/75％RH下在穩(wěn)定室中儲(chǔ)存至少4周。這些樣品已經(jīng)以150mg/mL的濃度重構(gòu)并測(cè)試穩(wěn)定性損失，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在1×劑下產(chǎn)生不超過Log10[0.5]IU/mL的損失(圖1的實(shí)心條)。實(shí)施例2：在高病毒滴度下噴霧干燥輪狀病毒血清型，以及隨后共混對(duì)噴霧干燥的輪狀病毒粉末之效力的作用以8.18×107(10×劑)IU/ml的高病毒滴度制備含有5種人-牛輪狀病毒血清型G1、G2、G3、G4和P1的示例性先導(dǎo)制劑SD62組合物。用0.1NHCl或NaOH將進(jìn)料溶液的pH調(diào)節(jié)至6.2。噴霧干燥和樣品加工如實(shí)施例1中所述進(jìn)行。a)研究1：將所回收的噴霧干燥粉末與填充劑和/或緩沖劑麥芽糖糊精(DE4-7)共混，以產(chǎn)生如實(shí)施例1所述的等于1.0×劑的病毒層(tier)。根據(jù)表4所示的組成制備填充劑和/或緩沖劑。表4：用于先導(dǎo)制劑SD62的填充劑和/或緩沖劑的組成噴霧干燥的粉末(10×)10％麥芽糖糊精83.97％HEPES3.84％組氨酸2.00％氯化鈣0.19％b)研究2：使用MettlerToledo鹵素天平或/和KarlFischer滴定儀測(cè)試所回收未共混和共混的噴霧干燥粉末的瞬時(shí)水分含量，并且發(fā)現(xiàn)水分含量＜2.0％。c)研究3：將濃度為150mg/mL所回收的共混噴霧干燥粉末以及液體對(duì)照(儲(chǔ)存在-70℃)重構(gòu)并測(cè)試加工損失，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的損失與零沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。d)研究4：將所回收的共混噴霧干燥粉末密封在玻璃小瓶中，并在穩(wěn)定室中在37℃175％RH下儲(chǔ)存至少4周。這些樣品已經(jīng)以150mg/mL的濃度重構(gòu)并測(cè)試穩(wěn)定性損失。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)所有樣品在150mg中不小于2×106的10×劑下產(chǎn)生的損失不超過Log10[0.5]IU/mL(圖1條紋條)。實(shí)施例3糖、緩沖劑和陽離子對(duì)噴霧干燥輪狀病毒血清型之熱穩(wěn)定的作用示例組成的先導(dǎo)制劑SD62已經(jīng)在不同濃度的成分下進(jìn)一步修飾和測(cè)試，以產(chǎn)生示例性的五價(jià)制劑SD63、SD64、SD65和SD66(表3)。含有5種人-牛輪狀病毒血清型G1、G2、G3、G4和P1的這些制劑已經(jīng)以8.18×107(10×劑)IU/ml的病毒滴度制備。如實(shí)施例1中所述進(jìn)行噴霧干燥。如實(shí)施例2和表4所述，將所回收的噴霧干燥粉末與填充劑和/或緩沖劑共混以產(chǎn)生等于1.0×劑的病毒層。a)研究1：將濃度為150mg/mL所回收的未共混和共混的噴霧干燥粉末以及液體對(duì)照(儲(chǔ)存在-70℃)重構(gòu)并測(cè)試加工損失，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的損失與零沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。e)研究2：將所回收的未共混和共混的噴霧干燥粉末密封在玻璃小瓶中，并在穩(wěn)定室中在37℃/75％RH下儲(chǔ)存至少4周。將這些濃度為150mg/mL的樣品重構(gòu)并測(cè)試穩(wěn)定性損失(圖2)。b)研究3：使用KarlFischer滴定儀測(cè)試所回收的未共混和共混的噴霧干燥粉末的瞬時(shí)水分含量(圖3)。噴霧干燥的樣品的特征在于水分含量小于2.0％，而共混樣品的水分含量為0.44％至0.95％。c)研究4：使用差示掃描量熱法(DifferentialScanningCalorimetry，DSC)測(cè)試20mg所回收的未共混噴霧干燥粉末的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)。噴霧干燥粉末的Tg報(bào)告為中點(diǎn)溫度和粒度分布(圖4)。d)研究5：使用MalvernMastersizer3000測(cè)定分散在合適反溶劑中的未共混對(duì)照(單獨(dú)的麥芽糖糊精)和共混的粉末混合物的粒度分布(particlesizedistribution，PSD)。潛在批次的D90、D50和D10值示于表5中。表5：未共混和共混的示例性制劑的粒度分布及其與麥芽糖糊精填充劑的比較實(shí)施例4噴霧干燥參數(shù)對(duì)噴霧干燥的示例性先導(dǎo)制劑之粉末性質(zhì)的作用。研究1：測(cè)定先導(dǎo)制劑的流動(dòng)和固結(jié)性質(zhì)：已經(jīng)以8.18×107(10×劑)IU/mL的病毒滴度噴霧干燥含有5種人-牛輪狀病毒血清型的示例性先導(dǎo)制劑SD64。用0.1NHCl或NaOH將進(jìn)料溶液的pH調(diào)節(jié)至6.2。噴霧干燥如實(shí)施例1中所述進(jìn)行。如實(shí)施例2和表4所述，將所回收的噴霧干燥粉末與填充劑和/或緩沖劑共混以產(chǎn)生等于1.0×劑的病毒層。將5.16g粉末轉(zhuǎn)移到50mL量筒以測(cè)量所占據(jù)的堆體積并計(jì)算堆密度。此外，按照USP敲擊(tap)量筒，直到單獨(dú)組敲擊的振實(shí)體積(tappedvolume)的體積差異小于2％。測(cè)量振實(shí)體積以計(jì)算振實(shí)密度。已經(jīng)導(dǎo)出了諸如卡爾(Carr’s)/固結(jié)系數(shù)和豪斯納比率(Hausner’sratio)的固結(jié)性質(zhì)，其值示于表6中。這些值表示在USP中分類的粉末的平順(fair)至可通過的流動(dòng)特征。表6：先導(dǎo)制劑SD64的流動(dòng)特征研究2：測(cè)定先導(dǎo)制劑SD64中的溶解時(shí)間：以8.18×107(10×劑)IU/ml的病毒滴度噴霧干燥含有5種人-牛輪狀病毒血清型的示例性先導(dǎo)制劑SD64。用0.1NHCl或NaOH將進(jìn)料溶液的pH調(diào)節(jié)至6.2。噴霧干燥如實(shí)施例1中所述進(jìn)行。如實(shí)施例2和表4所述，將所回收的噴霧干燥粉末與填充劑和/或緩沖劑共混以產(chǎn)生等于1.0×劑的病毒層。在大致的低RH(＜5％)氮環(huán)境下，將共混的噴霧干燥粉末在小瓶中精確稱重。向這種粉末添加水成為150mg/2mL至200mg/2mL的濃度，并手動(dòng)搖動(dòng)小瓶以觀察溶解。將添加水至溶液中沒有可見顆粒的點(diǎn)之間經(jīng)過的時(shí)間被記錄溶解時(shí)間。先導(dǎo)制劑SD64的溶解速率示于表7中。表7：在SD64中噴霧干燥粉末在水中的溶解速率實(shí)施例5：在示例性先導(dǎo)制劑SD64中輪狀病毒血清型的噴霧干燥對(duì)重構(gòu)后效力的作用以8.18×107(10×劑)IU/mL的病毒滴度噴霧干燥含有5種人-牛輪狀病毒血清型的示例性先導(dǎo)制劑SD64。用0.1NHCI或NaOH將進(jìn)料溶液的pH調(diào)節(jié)至6.2。噴霧干燥如實(shí)施例1中所述進(jìn)行。如實(shí)施例2和表4所述，將所回收的噴霧干燥粉末與填充劑和/或緩沖劑共混以產(chǎn)生等于1.0×劑的病毒層。將150mg共混粉末溶解在2mL水中，并在穩(wěn)定室中在37℃/75％RH和2-8℃下儲(chǔ)存至少24小時(shí)。先導(dǎo)制劑在不同溫度下24小時(shí)的效力損失示于表8中。表8：噴霧干燥的輪狀病毒血清型在不同溫度下24小時(shí)的效力損失。血清型在2-8℃下24小時(shí)的LOG損失在37℃下24小時(shí)的LOG損失G10.09±0.070.33±0.16G30.17±0.090.70±0.17實(shí)施例6：測(cè)定示例性先導(dǎo)制劑SD64的酸中和能力(ANC)以8.18×107(10×劑)IU/mL的病毒滴度噴霧干燥含有5種人-牛輪狀病毒血清型的示例性先導(dǎo)制劑SD64。用0.1NHCl或NaOH將進(jìn)料溶液的pH調(diào)節(jié)至6.2。噴霧干燥如實(shí)施例1中所述進(jìn)行。如實(shí)施例2和表4所述，將所回收的噴霧干燥粉末與填充劑和/或緩沖劑共混以產(chǎn)生等于1.0×劑的病毒層。共混的噴霧干燥粉末的酸中和能力(ANC)根據(jù)USP測(cè)定。簡言之，將150mg共混粉末溶解在70mL水中，并將溶液攪拌1分鐘。然后向該樣品溶液添加30mL1NHCl，并再次將溶液攪拌正好15分鐘，并且不超過額外5分鐘的時(shí)間段。用0.5NNaOH滴定過量的HCl以達(dá)到3.5的穩(wěn)定(10-15秒)pH。粉末所消耗的酸的毫當(dāng)量數(shù)通過下式計(jì)算：總mEq＝(30×NHCl)-VNaOH-NNaOH)。計(jì)算ANC并且結(jié)果示于表9中。表9：組合物號(hào)SD64的ANC。實(shí)施例7：測(cè)定延伸的縱向(longitudinal)熱穩(wěn)定性用實(shí)施例2中概述的方法制備示例性制劑SD64和SD66，并測(cè)試病毒滴度的過程和穩(wěn)定性損失，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有加工損失并且在4℃和37℃下其效力分別保留20周(圖5A和5B)至24周(圖6A和6B)。實(shí)施例8：噴霧干燥方法的可重復(fù)性對(duì)示例性先導(dǎo)制劑SD64和SD66進(jìn)行了可重復(fù)性試驗(yàn)，其中樣品如實(shí)施例7中所述制備。比較了來自所述三個(gè)試驗(yàn)的加工損失的結(jié)果，即N＝1、2、3(圖7A和7B)。圖8中總結(jié)了在37℃下在三個(gè)批次中SD66中可重復(fù)的效力保留至少16周的結(jié)果。實(shí)施例9：在示例性噴霧干燥制劑組合物SD64和SD66中高溫對(duì)輪狀病毒效力的作用已經(jīng)在45℃下測(cè)試了示例性先導(dǎo)制劑SD64和SD66的穩(wěn)定性損失，以確定它們?cè)凇笆芸販囟孺湣边\(yùn)輸中的適合性，其中疫苗在免疫供應(yīng)的最后一英里中在冷鏈外運(yùn)輸，潛在地將疫苗暴露于＞40℃的溫度下。以8.18×107(10×劑)IU/ml的病毒滴度制備含有5種人-牛輪狀病毒血清型的SD64和SD66制劑。用0.1NHCl或NaOH將進(jìn)料溶液的pH調(diào)節(jié)至6.2。噴霧干燥如實(shí)施例1中所述進(jìn)行。如實(shí)施例2和表4所述，將所回收的噴霧干燥粉末與填充劑和/或緩沖劑共混以產(chǎn)生等于1.0×劑的病毒層。使用MettlerToledo鹵素天平和/或KarlFischer滴定儀測(cè)試所回收的未共混和共混的噴霧干燥粉末的瞬時(shí)水分含量(圖4)。將濃度為150mg/mL所回收的未共混和共混的噴霧干燥粉末以及液體對(duì)照儲(chǔ)存在-70℃。將所回收的未共混和共混的噴霧干燥粉末密封在玻璃小瓶中，并在穩(wěn)定室中在45℃/75％RH和2-8℃下儲(chǔ)存至少2周。濃度為150mg/mL的SD64和SD66樣品已經(jīng)重構(gòu)并測(cè)試效力損失(圖9A和圖9B)，并發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)出低于Log10＝[0.5]的效力損失。當(dāng)前第1頁1 2 3