用于乳糜泄的口服酶療法的甲基丙烯酸透明質(zhì)酸衍生物的水凝膠的制作方法

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用于乳糜泄的口服酶療法的甲基丙烯酸透明質(zhì)酸衍生物的水凝膠的制作方法與工藝

本發(fā)明涉及包含負(fù)載有至少一種外源酶的透明質(zhì)酸衍生物水凝膠的藥物組合物，所述酶選自由脯氨酰內(nèi)肽酶(PEP)、內(nèi)切蛋白酶(EP)及其組合組成的組；所述組合物意圖用于乳糜泄的口服治療。

現(xiàn)有技術(shù)

乳糜泄是在遺傳易感個(gè)體中由麥膠(gluten)誘導(dǎo)的小腸病理學(xué)，盡管環(huán)境因素也參與此復(fù)雜的炎性疾病。

麥膠是麥膠蛋白(gliadin)和麥谷蛋白(glutenin)的混合物，富含脯氨酸和谷氨酰胺，脯氨酸和谷氨酰胺不是人類胃腸道的酶的優(yōu)選的底物。因此，麥膠在人類中不完全降解，產(chǎn)生高達(dá)30-40個(gè)氨基酸的亞穩(wěn)態(tài)的免疫原性肽。特別地，α2-麥膠蛋白即一種代表性的麥膠蛋白的序列在胃中被胃蛋白酶裂解，形成大的肽，所述大的肽在小腸腔中被腸刷狀緣膜(intestinal brush border membrane)的胰蛋白酶和胰肽酶消化成用于吸收的單個(gè)氨基酸、二肽和三肽。然而，33聚體序列經(jīng)過消化仍然存在，直到穿過上皮屏障，在選擇的谷氨酰胺殘基處由谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶2(TG2)脫氨。在下方的固有層中，衍生自脫氨的33聚體的表位示出對(duì)人類白細(xì)胞抗原(HLA)DQ2的高親和力。抗原呈遞細(xì)胞(APC)表面上的脫氨的麥膠肽-DQ2復(fù)合物引發(fā)來自麥膠-特異性腸T細(xì)胞的強(qiáng)大的炎性應(yīng)答，該炎性應(yīng)答導(dǎo)致破壞腸結(jié)構(gòu)、營(yíng)養(yǎng)素吸收不良、腹瀉和貧血。

完全無麥膠的飲食能夠解決多數(shù)患者中的乳糜泄的體征和癥狀，并且到目前為止，是用于此病理學(xué)的唯一的治療。顯然，由于人類飲食中麥膠無處不在，此限制是一個(gè)困難的經(jīng)歷并且通常帶來生活質(zhì)量降低。另外，無麥膠的食物非常昂貴，因此，除了不佳的口感以外，經(jīng)濟(jì)原因經(jīng)常使患者望而卻步。

不幸的是，對(duì)嚴(yán)格的無麥膠飲食的自愿的或非自愿的不良的患者依從性引起可以與增加的發(fā)病率和死亡率相關(guān)的并發(fā)癥，諸如骨質(zhì)疏松癥、繼發(fā)性免疫紊亂(secondary immune disorder)、惡性腫瘤等。

因此，存在對(duì)于對(duì)無麥膠飲食的治療替代方案的極大需求，其中包括外源脯氨酰內(nèi)肽酶(PEP)的口服施用。

與人類的胃腸道酶不同，外源PEP可以高效地水解富含脯氨酸的麥膠肽，并且隨后避免炎性應(yīng)答。

對(duì)于此目的已經(jīng)提出多種PEP，諸如來源于腦膜炎膿毒性黃桿菌(Flavobacterium meninosepticum)(FM)、黃色粘球菌(Myxococcus xanthus)(MX)、Sphingomonas capsulata(SC)和黑曲霉(Aspergillus niger)(AN)的PEP，所述PEP具有不同的序列和鏈長(zhǎng)特異性和在酸性介質(zhì)中或在胃腸蛋白酶的存在下的穩(wěn)定性(Bethune MT和Khosla C.Oral enzyme therapy for celiac sprue.Methods Enzymol.2012；502:241-271)。

然而，對(duì)于這些酶的口服施用，需要選擇允許不改變酶的制造方法和酶在胃和/或腸道中以活性形式和有效劑量、優(yōu)選地以隨時(shí)間逐漸且持續(xù)的方式的釋放的適當(dāng)?shù)闹苿?/p>

到目前為止，市場(chǎng)上不存在包含PEP的口服制劑，而僅在臨床試驗(yàn)中有幾個(gè)實(shí)例，諸如品牌為ALV003的PEP SC和EP-B2(大麥內(nèi)切蛋白酶)之間的組合(Tye-Din JA,Anderson RP,Ffrench RA,Brown GJ,Hodsman P,Siegel M,Botwick W,Shreeniwas R.The effects of ALV003 pre-digestion of gluten on immune response and symptoms in celiac disease in vivo.ClinImmunol.2010；134:289–95)。

然而，似乎到目前為止研究過的口服酶療法不能夠充分降解合計(jì)>13g的正常每日麥膠攝入的免疫原性表位，而更確切地說，能夠在具有高麥膠敏感性或1型難治性乳糜泄的患者中消除幾百毫克至幾克麥膠的有害影響，或能夠允許偶爾違反無麥膠飲食。

最后，目前提出的口服療法可能要求伴隨有意或無意地?cái)z入飲食麥膠的每餐施用PEP。

因此，在本領(lǐng)域中對(duì)于不受現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)影響的用于在乳糜泄的口服治療中使用的外源PEP的改善的釋放存在需求。

因此，本發(fā)明的目的是提供用于外源酶的口服施用的新制劑，所述外源酶選自由脯氨酰內(nèi)肽酶(PEP)和內(nèi)切蛋白酶(EP)組成的組，所述新制劑能夠在胃腸道中并且以逐步的方式釋放以活性形式和有效劑量的酶，以允許PEP和/或EP以每日一次劑量施用。

定義和縮寫

EDA：乙二胺

EP：內(nèi)切蛋白酶

HA：透明質(zhì)酸

MA：甲基丙烯酸酐

HA-EDA-MA：透明質(zhì)酸，其中至少一個(gè)羥基已經(jīng)通過與乙二胺(EDA)的反應(yīng)以及隨后的與甲基丙烯酸酐(MA)的反應(yīng)官能化

PEP：脯氨酰內(nèi)肽酶

PEP FM：來源于腦膜炎膿毒性黃桿菌的脯氨酰內(nèi)肽酶

PEP MX：來源于黃色粘球菌的脯氨酰內(nèi)肽酶

PEP SC：來源于Sphingomonas capsulata的脯氨酰內(nèi)肽酶

PEP AN：來源于黑曲霉的脯氨酰內(nèi)肽酶

發(fā)明概述

本發(fā)明提供包含至少一種外源酶的組合物，所述酶選自由脯氨酰內(nèi)肽酶(PEP)、內(nèi)切蛋白酶(EP)及其組合組成的組，所述酶被包埋于光交聯(lián)的甲基丙烯酸透明質(zhì)酸衍生物(HA-EDA-MA)水凝膠中，其中透明質(zhì)酸衍生物包括分子量被包括在50,000和1,500,000道爾頓之間的透明質(zhì)酸(HA)或其鹽，其中至少一個(gè)羥基，在用在碳酸苯酯類或鹵代甲酸苯酯類之間選擇的碳酸化劑活化后，通過與乙二胺(EDA)的反應(yīng)以及隨后的與甲基丙烯酸酐(MA)的反應(yīng)官能化，優(yōu)選地通過使用一鍋合成法(one-pot synthesis)。

所獲得的組合物被制備成凝膠或冷凍干燥粉末。

令人驚訝地，在冷凍干燥過程期間，包埋于水凝膠中的酶導(dǎo)致被保護(hù)免于降解，從而允許本發(fā)明的組合物的冷凍干燥粉末形式的生產(chǎn)和穩(wěn)定的保存期。

根據(jù)本發(fā)明的組合物允許在模擬胃腸液中以持續(xù)的方式且以活性形式釋放外源酶，以解毒麥膠蛋白肽。因此，根據(jù)本發(fā)明的組合物適合用于在治療乳糜泄中使用，并且可以被用于制備常規(guī)口服劑型，如顆粒、膠囊或具有或不具有腸溶包衣的片劑，以用于口服施用和以能夠使乳糜泄患者中的麥膠蛋白肽解毒的活性形式持續(xù)釋放酶(PEP、EP或其組合)。因此，本發(fā)明的主題還是包含根據(jù)本發(fā)明的組合物和至少另一種藥學(xué)上可接受的成分的藥物口服制劑，所述制劑用于在治療乳糜泄中使用。

起始聚合物即透明質(zhì)酸的粘膜粘附性質(zhì)可以允許負(fù)載有酶(PEP、EP或其組合)的制劑在麥膠蛋白肽必須被解毒的位點(diǎn)粘附至胃腸道的粘膜和因此更長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間。

本發(fā)明的另外的目的是用于制備甲基丙烯酸透明質(zhì)酸衍生物的方法，其中透明質(zhì)酸的羥基被乙二胺和隨后的甲基丙烯酸酐官能化，所述方法是一鍋法。

附圖簡(jiǎn)述

圖1示出HA-EDA-MA衍生物的1H-NMR光譜；

圖2示出用于HA-EDA-MA溶液的光輻照的Pyrex管-活塞系統(tǒng)的方案；

圖3示出PEP FM在磷酸鹽緩沖溶液pH 7.2中的穩(wěn)定性，表示為在4℃下儲(chǔ)存多達(dá)5天后用酶處理的底物溶液(Z-Gly-Pro-pNA)在380nm下的吸收度(ABS)的測(cè)量；

圖4示出PEP FM活性，表示為在366nm下輻照持續(xù)不同時(shí)間后用酶處理的底物溶液(Z-Gly-Pro-pNA)在380nm下的吸收度(ABS)的測(cè)量；

圖5示出在其制備后立刻分析(a)和在4℃下儲(chǔ)存10天后分析(b)的從HA-EDA-MA凝膠釋放的PEP FM。在模擬腸液pH 7.2中，從0至24h進(jìn)行釋放研究；

圖6示出在其制備后立刻分析(a)、在4℃下儲(chǔ)存10天后分析(b)和在-20℃下儲(chǔ)存10天后分析(c)的從HA-EDA-MA冷凍干燥粉末釋放的PEP FM。在模擬腸液pH 7.2中，從0至24h進(jìn)行釋放研究；

圖7示出在其制備后立刻分析(a)、在4℃下儲(chǔ)存10天后分析(b)和在-20℃下儲(chǔ)存10天后分析(c)的在1.5％w/w海藻糖存在下從HA-EDA-MA冷凍干燥粉末釋放的PEP FM。在模擬腸液pH 7.2中，從0至24h進(jìn)行釋放研究；

圖8示出在其制備后立刻分析(a)、在4℃下儲(chǔ)存10天后分析(b)和在-20℃下儲(chǔ)存10天后分析(c)的在3％w/w海藻糖存在下從HA-EDA-MA冷凍干燥粉末釋放的PEP FM。在模擬腸液pH 7.2中，從0至24h進(jìn)行釋放研究；

圖9示出在4℃下儲(chǔ)存10天后分析(a)、1個(gè)月后分析(b)和2個(gè)月后分析(c)的在3％w/w海藻糖存在下從HA-EDA-MA冷凍干燥粉末釋放的PEP FM。在模擬腸液pH 7.2中，從0至24h進(jìn)行釋放研究；

圖10示出在-20℃下儲(chǔ)存10天后分析(a)、1個(gè)月后分析(b)和2個(gè)月后分析(c)的在3％w/w海藻糖存在下從HA-EDA-MA冷凍干燥粉末釋放的PEP FM。在模擬腸液pH 7.2中，從0至24h進(jìn)行釋放研究。

發(fā)明詳述

根據(jù)本發(fā)明的HA-EDA-MA衍生物示出被包括在透明質(zhì)酸的至少一個(gè)羥基和全部羥基之間的EDA和MA中的官能化程度。

HA-EDA-MA衍生物可以通過在水溶液中在180-800nm的范圍中的波長(zhǎng)下、以在1％w/v和20％w/v之間的濃度、并且在以在1mU/mg聚合物和100U/mg聚合物之間的濃度的至少一種外源酶(優(yōu)選地PEP)存在的情況下光輻照的方式被光交聯(lián)。

HA-EDA-MA衍生物可以通過在180-800nm的范圍中的波長(zhǎng)下、以在1％w/v和20％w/v之間的濃度光輻照的方式被光交聯(lián)、并且然后通過使所獲得的水凝膠與濃度在1mU/mg聚合物和100U/mg聚合物之間的至少一種外源酶(優(yōu)選地PEP)的溶液接觸被負(fù)載。

HA-EDA-MA衍生物可以在水性介質(zhì)中光交聯(lián)，優(yōu)選地通過在外源酶、優(yōu)選地脯氨酰內(nèi)肽酶(PEP)的存在下在366nm波長(zhǎng)下UV輻照的方式。

在根據(jù)本發(fā)明的組合物中，酶可以是來源于單一微生物的PEP或EP，或其可以是來源于不同微生物或通過生物技術(shù)方法的方式產(chǎn)生的PEP和/或EP的組合；本領(lǐng)域已知的任何PEP或EP及其組合適用于被包埋于根據(jù)本發(fā)明的水凝膠中。

PEP也可以如在Bethune等人Methods Enzymol.2012,502,241-271和其中的注釋中描述的在大腸桿菌(E.coli)中通過重組技術(shù)來制備。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，PEP來源于選自由腦膜炎膿毒性黃桿菌(FM)、黃色粘球菌(MX)、Sphingomonas capsulata(SC)或黑曲霉(AN)組成的組的微生物。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，EP是大麥EP，特別優(yōu)選的是EP-B2。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，所述酶以在1mU/mg聚合物和100U/mg聚合物之間的濃度被包埋于以凝膠形式的水凝膠中。

負(fù)載有酶的HA-EDA-MA水凝膠可以作為凝膠產(chǎn)生。

負(fù)載有酶的HA-EDA-MA水凝膠可以作為冷凍干燥的粉末產(chǎn)生。

冷凍干燥可以在不存在或存在相對(duì)于聚合物的重量，濃度在0.1％w/w和10％w/w之間的冷凍保護(hù)劑的兩種情況下進(jìn)行；所述冷凍保護(hù)劑優(yōu)選為海藻糖。

根據(jù)本發(fā)明，負(fù)載有PEP(特別地PEP FM)的HA-EDA-MA水凝膠在其以不同時(shí)間(直到制備后6個(gè)月)和在不同溫度(從-20℃至37℃)下儲(chǔ)存后，已經(jīng)在模擬胃腸液中在PEP的釋放測(cè)定中被測(cè)試。

在之前的專利(Giammona,G.,Palumbo,F.S.,Pitarresi.G.,Method to produce hyaluronic acid functionalized derivatives and formation of hydrogels thereof.WO 2010/061005 A1)中，已經(jīng)報(bào)道了HA-EDA-MA的合成，但包括HA-EDA衍生物的初始生產(chǎn)，所述HA-EDA衍生物在分離和純化后用于與MA進(jìn)一步反應(yīng)，因此報(bào)道了兩鍋合成法(two-pot synthesis)。

相反，在本發(fā)明中，請(qǐng)求保護(hù)允許直接產(chǎn)生HA-EDA-MA衍生物而不分離HA-EDA衍生物的一鍋合成法。

然后，本發(fā)明的另外的主題是用于產(chǎn)生甲基丙烯酸透明質(zhì)酸衍生物的程序，優(yōu)選地一鍋法，所述程序包括以下步驟：

(a)在極性非質(zhì)子溶劑中使透明質(zhì)酸(HA)鹽與在碳酸苯酯類或鹵代甲酸苯酯類之間選擇的碳酸化劑接觸，以獲得HA的至少一個(gè)羥基的活化，其中所述HA呈可溶于所述極性非質(zhì)子有機(jī)溶劑的鹽的形式；

(b)通過親核取代的方式，使自步驟(a)獲得的活化的HA鹽與乙二胺(NH2-CH2-CH2-NH2，表示為EDA)接觸以獲得HA-EDA；

(c)通過親核取代的方式，使自步驟(b)獲得的HA-EDA與甲基丙烯酸酐(表示為MA)接觸以獲得HA-EDA-MA；

其中，優(yōu)選地，以上步驟全部在同一個(gè)容器中進(jìn)行。

優(yōu)選地，可溶于有機(jī)溶劑的透明質(zhì)酸鹽在四丁基銨鹽(表示為TBA)或十六烷基三甲基銨鹽(表示為CTA)之間選擇。

優(yōu)選地，用于官能化反應(yīng)的極性非質(zhì)子有機(jī)溶劑在二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺及其混合物之間選擇。

優(yōu)選地，在步驟(a)中使用的碳酸化劑可以是雙(4-硝基苯基碳酸酯)(羰基苯基酯)和/或氯代硝基苯基碳酸酯。

優(yōu)選地，步驟(c)在催化劑的存在下進(jìn)行，所述催化劑在二乙胺、三乙胺、二甲氨基吡啶及其混合物之間選擇。

優(yōu)選地，所有步驟在5℃和60℃之間的溫度下進(jìn)行。

連接至HA的EDA和MA基團(tuán)的官能化程度可以從僅一個(gè)羥基變化至HA的全部羥基，并且其(以成正比的方式)取決于在以上描述的方法中使用的碳酸化劑的量。優(yōu)選地，官能化程度在5％和95％之間變化，更優(yōu)選地在20％和80％之間變化。

根據(jù)另外的方面，本發(fā)明涉及從以上描述的方法可獲得的具有范圍在50,000-1,500,000道爾頓中的分子量的HA-EDA-MA衍生物。

以下呈現(xiàn)意圖僅代表當(dāng)經(jīng)受以上描述的方法時(shí)對(duì)HA羥基發(fā)生的官能化(共價(jià)鍵合)的類型的HE-EDA-MA的結(jié)構(gòu)式。

以下報(bào)道的結(jié)構(gòu)不意圖代表官能化程度，如上所述，官能化程度反而與在以上方法中使用的反應(yīng)性碳酸化劑的量成正比。

具體地，HA-EDA-MA衍生物的官能化類型可以由以下結(jié)構(gòu)表示，該結(jié)構(gòu)描述起始透明質(zhì)酸的2個(gè)連續(xù)的二糖單元，其中至少一個(gè)羥基已經(jīng)被官能化。

根據(jù)另外的方面，本發(fā)明涉及使用光交聯(lián)程序從以上描述的產(chǎn)品即HA-EDA-MA衍生物獲得的交聯(lián)的水凝膠，其中提及的官能化的衍生物在水溶液或有機(jī)溶液中的濃度被包括在1％w/v和20％w/v之間。優(yōu)選地，水凝膠通過在被包括在180nm和800nm之間的波長(zhǎng)下輻照獲得，使用或不使用光引發(fā)劑，輻照時(shí)間被包括在5min和10h之間。

這樣的水凝膠還可以通過γ射線、微波輻照或其他電離輻射獲得。

這樣的光交聯(lián)也可以在適當(dāng)?shù)奶砑觿┤绫┧岷图谆┧釂误w、聚乙二醇甲基丙烯酸酯和丙烯酸酯(單官能和多官能二者)的存在下發(fā)生，或在用于改變或提高塑性、硬度、親水性和親脂性特征的其他添加劑的存在下發(fā)生。

根據(jù)另外的方面，本發(fā)明涉及通過光輻照獲得且在輻照方法期間和/或之后，被負(fù)載有以在1mU/mg聚合物和100U/mg聚合物之間的酶濃度的外源脯氨酰內(nèi)肽酶(PEP)的HA-EDA-MA的水凝膠的產(chǎn)生。

根據(jù)具體的方面，本發(fā)明涉及在具有在1mU/mg聚合物和100U/mg聚合物之間的酶濃度的外源脯氨酰內(nèi)肽酶(PEP)(優(yōu)選地，來源于腦膜炎膿毒性黃桿菌(FM)的PEP)的存在下，在水性介質(zhì)中光交聯(lián)(優(yōu)選地在366nm下持續(xù)10分鐘)的HA-EDA-MA衍生物的產(chǎn)生。

負(fù)載有PEP的HA-EDA-MA水凝膠以凝膠或在不存在或存在相對(duì)于聚合物的重量，濃度在0.1％w/w和10％w/w之間的冷凍保護(hù)劑的情況下以冷凍干燥的粉末二者生產(chǎn)。

獲得的負(fù)載有PEP的水凝膠在其生產(chǎn)后立刻和在不同時(shí)間(直到生產(chǎn)后6個(gè)月)和不同溫度(從-20℃至37℃)下儲(chǔ)存后被用于在模擬胃腸液中的釋放實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：

·即使儲(chǔ)存于低溫，例如4℃，單獨(dú)溶解于磷酸鹽緩沖溶液pH 7.2的PEP FM隨時(shí)間逐漸喪失其活性。

·單獨(dú)溶解于磷酸鹽緩沖液pH 7.2的PEP FM在將該溶液冷凍干燥后完全喪失其活性，在冷凍保護(hù)劑的存在下也如此；

·單獨(dú)溶解于磷酸鹽緩沖液pH 7.2并且在366nm下光輻照10分鐘的PEP FM在光輻照期間保持其活性，但在將該溶液冷凍干燥后其完全喪失其活性，在冷凍保護(hù)劑的存在下也如此；

·在HA-EDA-MA衍生物的存在下，溶解于磷酸鹽緩沖液pH 7.2并且在366nm下光輻照10分鐘的PEP FM在不存在和存在冷凍保護(hù)劑的兩種情況下，在冷凍干燥后也保持其活性；

·如果在其制備后立刻分析，在光輻照期間負(fù)載有PEP FM并作為凝膠回收的HA-EDA-MA的水凝膠能夠在模擬腸液pH 7.2中以持續(xù)的方式釋放以活性形式的酶的約70％，直到24h。保留在HA-EDA-MA凝膠中的PEP FM的量完全保持其活性。

·如果在4℃儲(chǔ)存10天后分析，在光輻照期間負(fù)載有PEP FM并作為凝膠回收的HA-EDA-MA的水凝膠能夠在模擬腸液pH 7.2中以持續(xù)的方式釋放以活性形式的酶的約60％，直到24h，并且僅發(fā)生活性的部分損失(約20％)。

·如果在其制備后立刻分析，在不存在冷凍保護(hù)劑下光輻照期間負(fù)載有PEP FM并作為冷凍干燥粉末回收的HA-EDA-MA的水凝膠能夠在模擬腸液pH 7.2中以持續(xù)的方式釋放以活性形式的酶的約70％，直到24h。保留在HA-EDA-MA水凝膠中的PEP FM的量完全保持其活性。

·如果在4℃或-20℃儲(chǔ)存10天后分析，在不存在冷凍保護(hù)劑下光輻照期間負(fù)載有PEP FM并作為冷凍干燥粉末回收的HA-EDA-MA的水凝膠能夠在模擬腸液pH 7.2中以持續(xù)的方式釋放以活性形式的酶的約50％，直到24h，并且僅發(fā)生活性的部分損失(約30％)。這是非常良好的結(jié)果，因?yàn)閱为?dú)的PEP FM，即在不存在HA-EDA-MA水凝膠的情況下，在冷凍干燥后完全喪失其活性。

·如果在其制備后立刻分析，在以相對(duì)于聚合物的重量的1.5％w/w的海藻糖(作為冷凍保護(hù)劑的實(shí)例)的存在下光輻照期間負(fù)載有PEP FM并作為冷凍干燥粉末回收的HA-EDA-MA的水凝膠能夠在模擬腸液pH 7.2中以持續(xù)的方式釋放以活性形式的酶的約60％，直到24h。保留在HA-EDA-MA水凝膠中的PEP FM的量完全保持其活性。

如果這些樣品在4℃儲(chǔ)存10天，它們?nèi)阅軌蛟谀M腸液pH 7.2中以持續(xù)的方式釋放以活性形式的PEP FM的約50％，直到24h，并且僅發(fā)生活性的部分損失(約30％)。

如果這些樣品在-20℃儲(chǔ)存10天，它們?nèi)阅軌蛟谀M腸液pH 7.2中以持續(xù)的方式釋放以活性形式的PEP FM的約50％，直到24h，并且PEP FM完全保持其活性。

·如果在其制備后立刻分析，在以相對(duì)于聚合物的重量的3％w/w的海藻糖(作為冷凍保護(hù)劑的實(shí)例)的存在下光輻照期間負(fù)載有PEP FM并作為冷凍干燥粉末回收的HA-EDA-MA的水凝膠能夠在模擬腸液pH 7.2中以持續(xù)的方式釋放以活性形式的酶的約50％，直到24h。保留在HA-EDA-MA水凝膠中的PEP FM的量完全保持其活性。

如果這些樣品在4℃或-20℃儲(chǔ)存1和2個(gè)月，它們?nèi)阅軌蛟谀M腸液pH 7.2中以持續(xù)的方式釋放以活性形式的PEP FM的約50％，直到24h，并且PEP FM完全保持其活性。

因此，根據(jù)以上結(jié)果，通過在PEP FM和具有適當(dāng)濃度的冷凍保護(hù)劑的存在下光輻照HA-EDA-MA水凝膠制備的根據(jù)本發(fā)明的組合物，能夠完全保護(hù)酶活性免受冷凍干燥方法的影響。

負(fù)載于作為冷凍干燥粉末回收的HA-EDA-MA水凝膠中的PEP FM在以不同時(shí)間和溫度儲(chǔ)存期間完全保持其活性，并且其從HA-EDA-MA水凝膠以活性形式在模擬腸液pH 7.2中釋放，直到24h。

按照用于負(fù)載PEP FM的相同方法，本發(fā)明涉及負(fù)載有其他外源酶的HA-EDA-MA水凝膠，所述其他外源酶選自由脯氨酰內(nèi)肽酶(PEP)和內(nèi)切蛋白酶(EP)組成的組，所述脯氨酰內(nèi)肽酶如來自黃色粘球菌(MX)的PEP、來自Sphingomonas capsulata(SC)的PEP或來自黑曲霉(AN)的PEP，全部單獨(dú)地或與PEP FM組合或在它們之間或與其他酶組合地使用。

總而言之，HA-EDA-MA水凝膠能夠：

-保護(hù)負(fù)載的酶免受冷凍干燥方法影響；

-總體上在冷凍保護(hù)劑的存在下，在冷凍干燥的粉末的儲(chǔ)存期間，保護(hù)負(fù)載的酶免于改變；

-允許酶在模擬胃液(對(duì)于酸-活化的酶)和在模擬腸液(對(duì)于所有酶)中以活性形式和以持續(xù)的方式釋放，

-用于制備常規(guī)口服劑型，例如顆粒、膠囊和具有或不具有腸溶包衣的片劑，以用于口服施用，并能夠在乳糜泄患者中以使麥膠蛋白肽解毒的活性形式釋放酶。

本發(fā)明將通過以下實(shí)施例被進(jìn)一步例證，以下實(shí)施例被意圖幫助理解本發(fā)明，而不是被解釋為具體限制本文中描述和要求保護(hù)的本發(fā)明。

實(shí)驗(yàn)部分

實(shí)施例1

通過一步合成法制備HA-EDA-MA衍生物

將用氫氧化四丁基銨溶液中和透明質(zhì)酸溶液制備的1g透明質(zhì)酸的四丁基銨鹽(HA-TBA)溶解于90ml無水二甲基亞砜(DMSO)中(透明質(zhì)酸的重均分子量260kDa)。

將以獲得等于0.5的4-NPBC/HA-TBA重復(fù)單元的摩爾比的方式選擇的適量的雙(4-硝基苯基)碳酸酯(4-NPBC)溶解于10ml無水DMSO中；在40℃、在攪拌下，將此溶液逐滴添加至HA-TBA溶液。4h后，逐滴添加175μl的乙二胺(EDA)并將溶液留置在40℃持續(xù)另外的3h。

添加以獲得與HA-TBA-EDA上的氨基的摩爾相比8倍過量的適當(dāng)體積(900μl)的甲基丙烯酸酐(MA)，然后添加105μl的催化劑三乙胺(TEA)并且最終的溶液被留置在40℃持續(xù)24h。

通過首先添加10ml NaCl飽和溶液完成反應(yīng)的后處理(work-up)并將混合物在室溫下、在攪拌下留置30min。然后，將反應(yīng)溶液在乙醇中沉淀，并將產(chǎn)物用乙醇/雙蒸水(9:1)溶液洗滌若干次，直到獲得無反應(yīng)中間體和NaCl的產(chǎn)物。所獲得的固體被命名為HA-EDA-MA衍生物。方案1示出了用于制備HA-EDA-MA衍生物的一鍋程序。

方案1.使透明質(zhì)酸的四丁基銨鹽(HA-TBA)與乙二胺(EDA)和甲基丙烯酸酐(MA)反應(yīng)以通過一鍋程序獲得HA-EDA-MA衍生物。

HA-EDA-MA衍生物由¹H-NMR表征(見圖1)，示出了以下峰(D₂O):δ1.9(s,-CO-CH＝CH-CH₃)；δ2.0(s,-NH-CO-CH₃)；δ5.5和5.7(m,-CO-CH＝CH-CH₃)。

通過比較可歸因于甲基丙烯酸基團(tuán)的乙烯基質(zhì)子的δ5.5和5.7的峰面積與可歸因于HA重復(fù)單元的N-乙酰基葡糖胺的甲基的δ1.9的面積評(píng)價(jià)官能化程度。與HA-EDA的重復(fù)單元連接的甲基丙烯酸基團(tuán)中的官能化程度結(jié)果為50％mol/mol，不存在屬于EDA的氨基游離基團(tuán)的峰，即在δ3.1(m,CO-NH-CH₂-CH₂-NH₂)，所以全部氨基已經(jīng)被甲基丙烯酸酐衍生。

實(shí)施例2

HA-EDA-MA衍生物的光交聯(lián)

在室溫下，將30mg的按照實(shí)施例1獲得的HA-EDA-MA衍生物溶解于500μl的0.05M磷酸鹽緩沖液pH 7.2中，以使最終濃度等于6％w/v并在真空下脫氣。然后，將溶液置于Pyrex管中并用Rayonet光反應(yīng)器用波長(zhǎng)在366nm的UV輻照10分鐘(見圖2)。之后，將獲得的水凝膠作為凝膠回收或冷凍干燥以獲得粉末。

實(shí)施例3

PEP FM活性的評(píng)價(jià)

通過比色測(cè)定測(cè)量來源于腦膜炎膿毒性黃桿菌(FM)的PEP的活性，在所述比色測(cè)定中酶與其特異性底物即芐氧羰基-Gly-Pro-對(duì)硝基苯胺(Z-Gly-Prp-pNA)反應(yīng)。

具體地，將0.25ml的在40％二氧六環(huán)中的2mM Z-Gly-Pro-pNA與1.0ml的0.1M磷酸鹽緩沖溶液pH 7.2混合，并將溶液在30℃預(yù)溫育5min。然后，添加0.1ml的在0.05M磷酸鹽緩沖溶液pH 7.2中的酶，并且在30℃溫育10min后，通過添加2.0ml的Triton-X100溶液(10g Triton-X100/95ml 1M乙酸鹽緩沖液，pH 4.0)終止反應(yīng)。

在380nm測(cè)量所得產(chǎn)物的吸收度。

1單位酶活性被定義為在30℃、pH7.2每分鐘從Z-Gly-Pro-pNA產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺的酶活性。

實(shí)施例4

PEP FM在磷酸鹽緩沖溶液pH 7.2中作為時(shí)間的函數(shù)的穩(wěn)定性

制備在0.05M磷酸鹽緩沖溶液pH 7.2中的0.2U/ml PEP FM的等分試樣(1.0ml)并將其在4℃保存于冰箱中直到5天，以評(píng)估其隨時(shí)間的穩(wěn)定性。在第1、2、3、4和5天后，通過如實(shí)施例3中報(bào)道的比色測(cè)定評(píng)價(jià)酶的活性。每個(gè)實(shí)驗(yàn)一式三份地進(jìn)行。結(jié)果示于圖3中。

實(shí)施例5

在磷酸鹽緩沖溶液pH 7.2中的PEP FM的冷凍干燥及其活性的評(píng)價(jià)

在不存在或存在海藻糖(7.5μg/ml或15μg/ml)下將1ml的在0.05M磷酸鹽緩沖溶液pH 7.2中的0.2U/ml的PEP FM冷凍干燥。然后，通過如實(shí)施例3中報(bào)道的比色測(cè)定評(píng)價(jià)酶的活性。每個(gè)實(shí)驗(yàn)一式三份地進(jìn)行。在全部情況中，沒有發(fā)現(xiàn)活性。

實(shí)施例6

在磷酸鹽緩沖溶液pH 7.2中的PEP FM的光輻照及其活性的評(píng)價(jià)

將1ml的在0.05M磷酸鹽緩沖溶液pH7.2中的0.2U/ml的PEP FM在等于366nm的波長(zhǎng)下光輻照不同時(shí)間(從1min至20min)。

在每個(gè)輻照時(shí)間后，通過如實(shí)施例3中報(bào)道的比色測(cè)定評(píng)價(jià)酶的活性。

還對(duì)用作陽(yáng)性對(duì)照的非輻照的酶溶液進(jìn)行活性測(cè)定。每個(gè)實(shí)驗(yàn)一式三份地進(jìn)行。結(jié)果示于圖4中。

實(shí)施例7

在其光輻照后冷凍干燥在磷酸鹽緩沖溶液pH 7.2中的PEP FM及其活性的評(píng)價(jià)

將1ml的在0.05M磷酸鹽緩沖溶液(PBS)pH 7.2中的0.2U/ml PEP FM在等于366nm的波長(zhǎng)下光輻照10min。

將經(jīng)輻照的溶液冷凍干燥，并通過如實(shí)施例3中報(bào)道的比色測(cè)定評(píng)價(jià)酶的活性。

實(shí)驗(yàn)一式三份地進(jìn)行，并且在全部情況中，沒有發(fā)現(xiàn)活性。

實(shí)施例8

在其光輻照后冷凍干燥在磷酸鹽緩沖溶液pH 7.2中的PEP FM及其活性的評(píng)價(jià)

將200μl的在0.05M磷酸鹽緩沖溶液pH 7.2中的0.2U/ml PEP FM與800μl的在0.05M磷酸鹽緩沖溶液pH 7.2中的15μg/ml海藻糖混合。將此溶液在等于366nm的波長(zhǎng)下光輻照10min。

將經(jīng)輻照的溶液冷凍干燥，并通過如實(shí)施例3中報(bào)道的比色測(cè)定評(píng)價(jià)酶的活性。

實(shí)驗(yàn)一式三份地進(jìn)行，并且在全部情況下沒有發(fā)現(xiàn)活性。

實(shí)施例9

負(fù)載有PEP FM的HA-EDA-MA凝膠的制備

將30mg的HA-EDA-MA衍生物溶解于400μl的0.05M磷酸鹽緩沖溶液pH 7.2中。將溶液在真空下脫氣，并且然后添加100μl的在0.05M磷酸鹽緩沖溶液pH 7.2中的0.4U/mg PEP FM。其中最終聚合物濃度等于6％w/v。將溶液在等于366nm的波長(zhǎng)下光輻照10min。

在其制備后立刻或在4℃儲(chǔ)存10天后分析獲得的負(fù)載有PEP FM的HA-EDA-MA凝膠。