本發(fā)明屬于制藥領(lǐng)域，涉及3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮和黑三棱內(nèi)酯b組合物在腦血管病，特別是缺血性腦血管病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腦血管疾?。╟erebrovasculardisease,cvd）是指由于各種腦血管病變所引起的腦部病變，按其發(fā)病進(jìn)程可分為急性腦血管?。ㄖ酗L(fēng)）和慢性腦血管病兩種。急性腦血管病包括短暫性腦缺血發(fā)作、腦血栓形成、腦栓塞、高血壓腦病、腦出血和蛛網(wǎng)膜下腔出血等；慢性腦血管病包括腦動(dòng)脈硬化、腦血管病性癡呆、腦動(dòng)脈盜血綜合癥、帕金森氏病等。缺血性腦卒中（stroke）是指由于腦的供血?jiǎng)用}（頸動(dòng)脈和椎動(dòng)脈）狹窄或閉塞、腦供血不足導(dǎo)致的腦組織壞死的總稱。腦缺血包括四種類型，分比為短暫性腦缺血發(fā)作（tia）、可逆性神經(jīng)功能障礙（rind）、進(jìn)展性卒中（sie）完全性卒中（cs）。tia無腦梗死存在，而rind、sie和cs有不同程度的腦梗死存在。腦缺血/再灌損傷病理復(fù)雜，其中自由基和炎癥反應(yīng)起著重要的作用。在先天性免疫反應(yīng)和獲得性免疫反應(yīng)中，tlrs（toll-likereceptors），包括tlr1-9成員，能夠識(shí)別外源性的病原相關(guān)分子模式（pathogen-associatedmolecularpatterns，pamps）和內(nèi)源性的應(yīng)激、損傷相關(guān)的分子模式（damage-associatedmolecularpatterns，damps）。與其他tlrs成員相比，tlr2和tlr4在腦缺血再灌損傷中起著更重要的作用（neurologicalresearch,2010,32(2)123–126;neuroscience2013,238,87–96）。3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮（依達(dá)拉奉，edaravone）作為一種新型強(qiáng)效的自由基清除劑，可以清除羥自由基（·oh）、一氧化氮自由基（no·）、過氧亞硝基離子（onoo-）（chempharmbull2004,52(2):186-91；redoxrep.2002,7(4):219-22；jpharmacolexpther.2007,322(1):274-81），抑制細(xì)胞過氧化損傷，作為一種有效的神經(jīng)元保護(hù)劑（自由基清除劑）具有分布廣、半衰期斷、安全、毒性低等優(yōu)點(diǎn)，為臨床缺血性腦卒中有效的一線治療藥物（中國急性缺血性腦卒中診治指南(2010版)）。依達(dá)拉奉黑三棱（sparganiumstoloniferum）為多年生沼生草本，其根莖已在傳統(tǒng)中藥應(yīng)用于治療多種炎癥疾?。ㄖ兴幩幚砼c臨床2008,14,7–10）。qiaoliliang等人從黑三棱中提取、分離并鑒定出一種單體——黑三棱內(nèi)酯b（sparstoloninb，ssnb）。在小鼠巨噬細(xì)胞中，ssnb能抑制lps（tlr4配體），pam3csk4（tlr1/2配體）和fsl-1（tlr2/6配體）誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)，而對poly（i:c）（tlr3配體）和odn1668（tlr9配體）誘導(dǎo)的炎癥因子沒有抑制作用。進(jìn)一步研究表明，ssnb能夠減少tlr2和tlr4與myd88的結(jié)合，從而抑制nf-κb的激活（jbiolchem2011,286:26470–26479），并能保護(hù)小鼠內(nèi)毒素休克（cytokine2015,75:302–309）。ssnb能抑制血管平滑肌細(xì)胞（vsmcs）增殖、遷移、炎癥反應(yīng)以及脂質(zhì)產(chǎn)生，提示可能用于抗動(dòng)脈粥樣病變治療（vasculpharmacol2015,67-69:59–66；專利cn101899054a）。henryr.bateman等人發(fā)現(xiàn)ssnb能夠抑制促血管生成和阻斷細(xì)胞周期，可能是通過下調(diào)ccne2和cdc6和通過g1/s檢驗(yàn)點(diǎn)阻止進(jìn)程而發(fā)揮作用（plosone2013,8:e70500）。另外，ambrishkumar等人發(fā)現(xiàn)，ssnb還能阻斷n-myc擴(kuò)增或不擴(kuò)增的腫瘤細(xì)胞的生長周期（g2-m期），增加3-d培養(yǎng)細(xì)胞中的ros產(chǎn)生降低細(xì)胞內(nèi)gsh水平，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（plosone2014，9:e96343）。此外，ssnb能保護(hù)缺血再灌誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥損傷（expbiolmed(maywood)2014,239:376–384；cardiovascdrugsther2014,28:433–439），以及阻斷hiv轉(zhuǎn)錄（virolj2015,12:108）。黑三棱內(nèi)酯b。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的是提供一種藥物組合物，包括3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮或其在藥學(xué)可接受的鹽和黑三棱內(nèi)酯b。上述藥物組合物，其特征在于重量比3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮：黑三棱內(nèi)酯9：1~1：9，優(yōu)選重量比9：1~1：4，優(yōu)選重量比為4：1~1：4，優(yōu)選重量比為4：1~1：2。本發(fā)明的藥物組合可以應(yīng)用于制備腦血管的藥物。其中，腦血管病優(yōu)選缺血性腦血管病，進(jìn)一步優(yōu)效缺血性腦卒中。本發(fā)明的有益效果是：3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮和黑三棱內(nèi)酯b兩者配伍，根據(jù)動(dòng)物藥效試驗(yàn)結(jié)果，針對腦血管病，兩者具有協(xié)同性地增加藥效的作用。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例舉例說明本發(fā)明，不應(yīng)被認(rèn)為是對本發(fā)明的限制。實(shí)施例中提及的依達(dá)拉奉是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮。實(shí)施例1依達(dá)拉奉與黑三棱內(nèi)酯b組合物對局灶性腦缺血再灌損傷的保護(hù)作用研究1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物sprague-dawley（sd）大鼠，雄性，清潔級，體重270-290g。1.2受試藥品依達(dá)拉奉原料藥黑三棱內(nèi)酯b原料藥1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1局灶性腦缺血再灌模型的制備采用頸內(nèi)動(dòng)脈線栓法制備大腦中動(dòng)脈阻塞（middlecerebralarteryocclusion,mcao）腦缺血再灌注模型。動(dòng)物用7％水合三氯乙醛（6ml/kg）麻醉后，俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，消毒皮膚，頸部正中切開，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，輕輕剝離迷走神經(jīng)，結(jié)扎并剪斷頸外動(dòng)脈，循頸內(nèi)動(dòng)脈向前，結(jié)扎翼腭動(dòng)脈。夾閉頸總動(dòng)脈近心端，從頸外動(dòng)脈的結(jié)扎線的遠(yuǎn)端作一切口，插入外徑為0.285mm的尼龍線，進(jìn)過頸總動(dòng)脈分叉進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，然后徐徐插入至有輕微阻力為止（自分叉處約20mm），阻斷大腦中動(dòng)脈的所有血供，右側(cè)腦缺血2.0h后，輕輕拔出尼龍線，恢復(fù)血供進(jìn)行再灌注，縫合皮膚，消毒。1.3.2動(dòng)物分組與給藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為依達(dá)拉奉組（3mg/kg）、黑三棱內(nèi)酯b（1.5mg/kg）、依達(dá)拉奉與黑三棱內(nèi)酯b組合物組及模型組，共4組。制備腦缺血模型后，將動(dòng)物機(jī)率均等單盲分配至各組。動(dòng)物于再灌注后立即靜脈給藥1次，模型組動(dòng)物給于等體積的生理鹽水。腦缺血后24小時(shí)評價(jià)神經(jīng)缺陷癥狀，而后處死動(dòng)物，取腦，染色，拍照測定腦梗死面積。1.3.3神經(jīng)缺陷癥狀評分及腦梗死面積的測定采用改良bederson5分制法進(jìn)行神經(jīng)缺陷癥狀評價(jià)。采用單盲法評價(jià)腦缺血后大鼠的神經(jīng)缺陷癥狀，即由試驗(yàn)設(shè)計(jì)者將動(dòng)物按組標(biāo)記，對神經(jīng)缺陷癥狀進(jìn)行評分的試驗(yàn)者不知道動(dòng)物的分組情況，評分結(jié)束后，評分者將各種標(biāo)記的評分結(jié)果呈交設(shè)計(jì)者，由設(shè)計(jì)者揭盲，獲得各試驗(yàn)組每只動(dòng)物的評分。腦梗死程度的測定，動(dòng)物處死后，斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，用生理鹽水沖洗大腦表面血跡，吸去表面殘留水跡，于－20℃放置20min，取出后立即于視線交叉平面垂直向下作冠狀切面，并向后每隔2mm切一片，將腦片置于2％ttc染液中孵育(37℃90min)，正常腦組織染成深紅色，缺血腦組織則呈蒼白色，用生理鹽水沖洗后，迅速將腦片從前向后按順序排成一排，吸干表面殘留水跡，拍照。照片用圖像分析軟件處理，根據(jù)公式計(jì)算左腦相應(yīng)的體積以及梗死灶體積，求出梗死灶百分比。梗死體積計(jì)算法：v=t(a1+a2+a3+………+an)t為切片厚度，a為梗死面積。%i=100%×(vc-vl)/vc%i為梗死體積百分比，vc為對照側(cè)（左腦半球）腦體積，vl為梗死側(cè)（右腦半球）非梗死區(qū)域體積。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1對神經(jīng)缺陷癥狀的影響各組動(dòng)物神經(jīng)缺陷癥狀的程度見表1，與模型組相比，依達(dá)拉奉、依達(dá)拉奉與黑三棱內(nèi)酯b組合物均能顯著改善大鼠神經(jīng)缺陷癥狀（p=0.021，0.000），黑三棱內(nèi)酯b單用具有一定改善神經(jīng)缺陷癥狀的趨勢（p=0.111）。根據(jù)金正均公式q=e(a+b)/(ea+eb-ea×eb)評價(jià)組合物中依達(dá)拉奉與黑三棱內(nèi)酯b是否有協(xié)同作用。式中e(a+b)為合用藥物的有效率，ea、eb分別為a藥、b藥單獨(dú)用藥的有效率。若q值在0.85～1.15范圍內(nèi)，為兩藥合用單純相加，q值>1.15為增強(qiáng)，q值<0.85則表示兩藥合用有拮抗作用。按照上述公式計(jì)算，q=1.23，說明組合物組分間具有協(xié)同效應(yīng)，復(fù)方優(yōu)于單方。表1.依達(dá)拉奉與黑三棱內(nèi)酯b復(fù)方用藥對神經(jīng)缺陷癥狀的影響組別動(dòng)物數(shù)神經(jīng)缺陷癥狀評分模型組132.69±0.75依達(dá)拉奉組131.85±0.99*黑三棱內(nèi)酯b組112.18±0.75依達(dá)拉奉與黑三棱內(nèi)酯b組131.23±0.72***x±sd。與模型組相比，*p<0.05，***p<0.0012.2對腦梗面積的影響對腦梗塞面積的影響見表2，與模型組相比，依達(dá)拉奉、黑三棱內(nèi)酯b、依達(dá)拉奉與黑三棱內(nèi)酯b組合物均能顯著減小大鼠腦梗面積（p=0.038，0.038，0.000）。按照上述金正均公式計(jì)算，q=1.25，說明組合物組分間具有協(xié)同效應(yīng)，復(fù)方優(yōu)于單方。表2.依達(dá)拉奉與黑三棱內(nèi)酯b復(fù)方用藥對腦梗面積的影響組別動(dòng)物數(shù)腦梗死面積（%）模型組1345.5±10.0依達(dá)拉奉組1335.6±12.8*黑三棱內(nèi)酯b組1136.1±11.0*依達(dá)拉奉與黑三棱內(nèi)酯b組1323.9±16.7***x±sd。與模型組相比，*p<0.05，***p<0.001。實(shí)施例2依達(dá)拉奉/黑三棱內(nèi)酯b（9:1,4:1,2:1,1:1）對局灶性腦缺血再灌損傷的作用1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物sprague-dawley（sd）大鼠，雄性，清潔級，體重270-290g。1.2受試藥品依達(dá)拉奉原料藥黑三棱內(nèi)酯b原料藥1.3實(shí)驗(yàn)方法局灶性腦缺血再灌模型的制備、神經(jīng)缺陷癥狀評分及腦梗死面積的測定方法同實(shí)施例11.3。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為四個(gè)組方比例組（依達(dá)拉奉/黑三棱內(nèi)酯b比例分別為9:1、4:1、2:1、1:1，各組的給藥劑量均為4.5mg/kg）、陽性藥依達(dá)拉奉組（3mg/kg）及模型組，共6組。制備腦缺血模型后，將動(dòng)物機(jī)率均等單盲分配至各組。動(dòng)物于再灌注后立即靜脈給藥1次，模型組動(dòng)物給于等體積的生理鹽水。腦缺血后24小時(shí)評價(jià)神經(jīng)缺陷癥狀，而后處死動(dòng)物，取腦，染色，拍照測定腦梗死面積。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1對神經(jīng)缺陷癥狀的影響各組動(dòng)物神經(jīng)缺陷癥狀的程度見表3，與模型組相比，依達(dá)拉奉/黑三棱內(nèi)酯b比例9:1、4:1、2:1、1:1及陽性藥依達(dá)拉奉均能顯著改善神經(jīng)缺陷癥狀（p=0.018，0.000，0.001，0.038，0.040）。表3.依達(dá)拉奉與黑三棱內(nèi)酯b復(fù)方用藥對神經(jīng)缺陷癥狀的影響組別動(dòng)物數(shù)神經(jīng)缺陷癥狀評分模型組102.90±0.91依達(dá)拉奉組92.05±0.73*組方9:1組91.94±0.63*組方4:1組91.39±0.42***組方2:1組101.50±0.74**組方1:1組92.00±0.83*x±sd。與模型組相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。2.2對腦梗塞面積的影響對腦梗塞面積的影響見表4，與模型組相比，依達(dá)拉奉/黑三棱內(nèi)酯b比例9:1、4:1、2:1、1:1及陽性藥依達(dá)拉奉均能顯著減小動(dòng)物缺血再灌后腦梗塞面積（p=0.031，0.002，0.002，0.014，0.034）。表4依達(dá)拉奉與黑三棱內(nèi)酯b復(fù)方用藥對腦梗面積的影響組別動(dòng)物數(shù)腦梗死面積（%）模型組1038.2±13.5依達(dá)拉奉組926.3±7.8*組方9:1組924.5±11.7*組方4:1組917.8±10.4**組方2:1組1018.4±10.4**組方1:1組923.0±9.9*x±sd。與模型組相比，*p<0.05，**p<0.01實(shí)施例3依達(dá)拉奉/黑三棱內(nèi)酯b（1:1,1:2,1:4,1:9）對局灶性腦缺血再灌損傷的作用1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物sprague-dawley（sd）大鼠，雄性，清潔級，體重270-290g1.2受試藥品依達(dá)拉奉原料藥黑三棱內(nèi)酯b原料藥1.3實(shí)驗(yàn)方法局灶性腦缺血再灌模型的制備、神經(jīng)缺陷癥狀評分及腦梗死面積的測定方法同實(shí)施例11.3。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為四個(gè)組方比例組（依達(dá)拉奉/黑三棱內(nèi)酯b比例分別為1:1、1:2、1:4、1:9，各組的給藥劑量均為4.5mg/kg）、陽性藥依達(dá)拉奉組（3mg/kg）及模型組，共6組。制備腦缺血模型后，將動(dòng)物機(jī)率均等單盲分配至各組。動(dòng)物于再灌注后立即靜脈給藥1次，模型組動(dòng)物給于等體積的生理鹽水。腦缺血后24小時(shí)評價(jià)神經(jīng)缺陷癥狀，而后處死動(dòng)物，取腦，染色，拍照測定腦梗死面積。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1對神經(jīng)缺陷癥狀的影響各組動(dòng)物神經(jīng)缺陷癥狀的程度見表5，與模型組相比，依達(dá)拉奉/黑三棱內(nèi)酯b比例1:1、1:2、1:4及陽性藥依達(dá)拉奉均能顯著改善神經(jīng)缺陷癥狀（p=0.029，0.001，0.013，0.026）。組合物1:9比例與模型組比較，雖有改善神經(jīng)缺陷癥狀的趨勢，但未達(dá)到顯著水平。表5.依達(dá)拉奉與黑三棱內(nèi)酯b復(fù)方用藥對神經(jīng)缺陷癥狀的影響組別動(dòng)物數(shù)神經(jīng)缺陷癥狀評分模型組92.78±0.75依達(dá)拉奉組101.85±0.88*組方1:1組101.65±1.22*組方1:2組91.56±0.53**組方1:4組101.60±1.05*組方1:9組91.94±1.01x±sd。與模型組相比，*p<0.05，**p<0.012.2對腦梗塞面積的影響對腦梗塞面積的影響見表6，與模型組相比，依達(dá)拉奉/黑三棱內(nèi)酯b比例1:1、1:2、1:4、1:9及陽性藥依達(dá)拉奉均能顯著減小動(dòng)物缺血再灌后腦梗塞面積（p=0.016，0.008，0.028，0.038，0.036）。表6.依達(dá)拉奉與黑三棱內(nèi)酯b復(fù)方用藥對腦梗面積的影響組別動(dòng)物數(shù)腦梗死面積（%）模型組938.9±12.0依達(dá)拉奉組1025.9±12.7*組方1:1組1023.8±12.6*組方1:2組923.0±10.0**組方1:4組1025.1±12.8*組方1:9組927.9±8.4*x±sd。與模型組相比，*p<0.05，**p<0.01。當(dāng)前第1頁12