本發(fā)明涉及藥物化學和藥物治療學領(lǐng)域，具體涉及聚醚類化合物、其制備方法、含此類化合物的藥物組合物及用途。
背景技術(shù)：
：癌癥已經(jīng)成為危害人類健康的最主要的疾病之一。目前臨床上通常包括手術(shù)治療、自然療法、放射治療、化學治療、中醫(yī)治療等手段。其中化學治療是指利用化療藥物達到殺死或抑制腫瘤細胞生長的目的，化療藥物可分為烷化劑、抗代謝藥、抗癌抗生素、植物類、激素類和雜類等，其中現(xiàn)有的抗癌抗生素雖然可以達到一定的效果，但長期使用易導致腫瘤細胞具有耐藥性，且常常引起毒副作用。因此，有必要擴充該類抗癌藥物多樣性。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)醚類抗生素具有很好的抑制腫瘤生長的效果。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種能夠有效治療或預(yù)防癌癥的手段。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了通式i所示的聚醚類化合物、其螯合形式、水合形式或其藥學上可接受的鹽在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療癌癥和預(yù)防癌癥復發(fā)，其中，所述r1、所述r2、所述r3、所述r4、所述r5、所述r6、所述r7和所述r8各自獨立地為氫、-oh、-nh2、鹵素、任選取代的c1～10直鏈或支鏈的飽和或不飽和烴基、任選取代的c1～10直鏈或支鏈烴氧基、任選取代的c1～10酰基、任選取代的c6～20芳基、任選取代的雜芳基、或者其中，r9、r10各自獨立地為氫、-oh、-nh2、鹵素、c1-5直鏈或支鏈的飽和或不飽和烴基、羧基、疊氮基、肟基、胺基、巰基、酰胺基、硫酸酯基、鼠李糖基、苯基或芐基，且任選地被一個或多個選自鹵素、-och3、-oh、-ocf3、-nh2、苯基、芐基、雜芳基和、-nhrx和-nrx2中的基團所取代，其中，rx各自獨立地是飽和的脂肪族的c1-4烷基、苯基或芐基，所述雜芳基為3元～6元的單環(huán)或二環(huán)的雜芳基，任選地含有1～3個選自n、o或s的雜原子；n為2～7的整數(shù)；所述鹵素為-f、-cl、-br、-i。其中，需要說明的是，本發(fā)明的藥物不僅可以抑制腫瘤細胞的生長，還可以抑制腫瘤干細胞的生長，從而徹底清除癌細胞、預(yù)防癌癥復發(fā)，尤其是預(yù)防乳腺癌的復發(fā)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，通式i中：所述r1、所述r2、所述r3、所述r4、所述r5、所述r6、所述r7和所述r8各自獨立地為氫、-oh、-nh2、鹵素、任選取代的c1～5直鏈或支鏈的飽和或不飽和烴基、任選取代的c1～5直鏈或支鏈烴氧基、任選取代的c1～5?；?、任選取代的苯基、或者其中，所述r9、r10各自獨立地為氫、-oh、-nh2、鹵素、c1～5直鏈或支鏈的飽和或不飽和烴基、羧基、疊氮基、肟基、胺基、巰基、酰胺基、硫酸酯基、鼠李糖基、苯基或芐基，且任選地被一個或多個選自鹵素、-och3、-oh、-ocf3、-nh2、苯基、芐基、雜芳基、-nhrx和-nrx2中的基團所取代，其中，rx各自獨立地是飽和的脂肪族的c1-4烷基、苯基或芐基，所述雜芳基為5元～6元的單環(huán)雜芳基，且任選地含有1～3個選自n、o或s的雜原子；n為2～7的整數(shù)；所述鹵素為-f、-cl、-br、-i。根據(jù)本發(fā)明的實施例，通式i中：所述r1、所述r2、所述r3、所述r4、所述r5、所述r6、所述r7、所述r8和所述r9各自獨立地為氫、-oh、-nh2、鹵素、任選取代的c1～3直鏈或支鏈的飽和或不飽和烴基、任選取代的c1～3直鏈或支鏈烴氧基、任選取代的c1～3酰基、任選取代的苯基、或者其中，所述r9、r10各自獨立地為氫、-oh、-nh2、鹵素、c1～3直鏈或支鏈的飽和或不飽和烴基、羧基、疊氮基、肟基、胺基、巰基、酰胺基、硫酸酯基、鼠李糖基、苯基或芐基，且任選地被一個或多個選自鹵素、-och3、-oh、-ocf3、-nh2、苯基、芐基、雜芳基、-nhrx和-nrx2中的基團所取代，其中，rx各自獨立地是飽和的脂肪族的c1-4烷基、苯基或芐基，所述雜芳基5元～6元的單環(huán)雜芳基，且任選地含有1個選自n、o或s的雜原子；n為2～7的整數(shù)；所述鹵素為-f、-cl、-br、-i。根據(jù)本發(fā)明的實施例，通式i中：所述r1、所述r2、所述r3、所述r4、所述r5、所述r6、所述r7、所述r8各自獨立地為氫、-oh、-nh2、鹵素、-och3、-ocf3、c2-10飽和脂肪族鏈烴、丙烯基、丙炔基、2-(三氟甲基)乙基、2-溴乙基、2-疊氮乙基、乙?；?-鹵(氯、溴)乙酰基、2-疊氮基乙?；⒈郊柞；?、苯乙?；⑷芜x取代的苯基、或者其中，所述r9、r10各自獨立地為氫、-oh、-nh2、鹵素、甲基、乙基、異丙基，乙烯基，丙烯基、羧基、疊氮基、肟基、胺基、巰基、酰胺基、硫酸酯基、鼠李糖基、苯基或芐基，且所述苯基和芐基任選地被一個或多個選自鹵素、-och3、-oh、-ocf3、-nh2、-nhrx和-nrx2中的基團所取代，其中，rx各自獨立地是飽和的脂肪族的c1-4烷基、苯基或芐基；n為2～7的整數(shù)；所述鹵素為-f、-cl、-br、-i。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述r1為所述r2、所述r3、所述r4均為氫，所述r5為甲基，所述r7和所述r8均為-oh，所述化合物的結(jié)構(gòu)式如下：其中，r6為氫、-oh、-nh2、鹵素、-och3、-ocf3、甲基、乙基、異丙基，乙烯基，丙烯基、丙炔基、2-(三氟甲基)乙基、2-溴乙基、2-疊氮乙基、乙?；?、2-鹵(氯、溴)乙?；?-疊氮基乙?；⒈郊柞；⒈揭阴；蚱渲校鰎10為氫、-oh、-nh2、鹵素、甲基、乙基、異丙基，乙烯基，丙烯基、羧基、疊氮基、肟基、胺基、巰基、酰胺基、硫酸酯基、鼠李糖基、苯基或芐基，且所述苯基和芐基任選地被一個或多個選自鹵素、-och3、-oh、-ocf3、-nh2、-nhrx和-nrx2中的基團所取代，其中，rx各自獨立地是飽和的脂肪族的c1-4烷基、苯基或芐基；n為2～7的整數(shù)；所述鹵素為-f、-cl、-br、-i。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述r1為r2、r3、r4均為氫，所述r5為甲基,所述r6為-oh，所述化合物的結(jié)構(gòu)式如下：其中，r7和r8各自獨立地為氫、-oh、-nh2、鹵素、-och3、-ocf3、甲基、乙基、異丙基，乙烯基，丙烯基、丙炔基、2-(三氟甲基)乙基、2-溴乙基、2-疊氮乙基、乙酰基、2-鹵(氯、溴)乙?；?、2-疊氮基乙酰基、苯甲?；⒈揭阴；颉⑵渲?，所述r9為氫、-oh、-nh2、鹵素、甲基、乙基、異丙基，乙烯基，丙烯基、羧基、疊氮基、肟基、胺基、巰基、酰胺基、硫酸酯基、鼠李糖基、苯基或芐基，且所述苯基和芐基任選地被一個或多個選自鹵素、-och3、-oh、-ocf3、-nh2、-nhrx和-nrx2中的基團所取代，其中，rx各自獨立地是飽和的脂肪族的c1-4烷基、苯基或芐基；n為2～7的整數(shù)；所述鹵素為-f、-cl、-br、-i。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述r2為r1、r7和r8均為-oh，r3和r5均為氫，r4為甲基，所述化合物的結(jié)構(gòu)式如下，所述化合物的結(jié)構(gòu)式如下：其中，r6為氫、-oh、-nh2、鹵素、-och3、-ocf3、甲基、乙基、異丙基，乙烯基，丙烯基、丙炔基、2-(三氟甲基)乙基、2-溴乙基、2-疊氮乙基、乙?；?、2-鹵(氯、溴)乙?；?、2-疊氮基乙?；?、苯甲?；?、苯乙?；蚱渲?，所述r10為氫、-oh、-nh2、鹵素、甲基、乙基、異丙基，乙烯基，丙烯基、羧基、疊氮基、肟基、胺基、巰基、酰胺基、硫酸酯基、鼠李糖基、苯基或芐基，且所述苯基和芐基任選地被一個或多個選自鹵素、-och3、-oh、-ocf3、-nh2、-nhrx和-nrx2中的基團所取代，其中，rx各自獨立地是飽和的脂肪族的c1-4烷基、苯基或芐基；n為2～7的整數(shù)；所述鹵素為-f、-cl、-br、-i。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述r2為r6為-oh，r3、r5均為氫，r4為甲基，所述化合物的結(jié)構(gòu)式如下：其中，r1,r7,r8各自獨立地為氫、-oh、-nh2、鹵素、-och3、-ocf3、甲基、乙基、異丙基，乙烯基，丙烯基、丙炔基、2-(三氟甲基)乙基、2-溴乙基、2-疊氮乙基、乙?；?、2-鹵(氯、溴)乙?；?-疊氮基乙酰基、苯甲?；?、苯乙?；?、其中，所述r9為氫、-oh、-nh2、鹵素、甲基、乙基、異丙基，乙烯基，丙烯基、羧基、疊氮基、肟基、胺基、巰基、酰胺基、硫酸酯基、鼠李糖基、苯基或芐基，且所述苯基和芐基任選地被一個或多個選自鹵素、-och3、-oh、-ocf3、-nh2、-nhrx和-nrx2中的基團所取代，其中，rx各自獨立地是飽和的脂肪族的c1-4烷基、苯基或芐基；n為2～7的整數(shù)；所述鹵素為-f、-cl、-br、-i。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述r3為r1、r7和r8均為-oh，r2、r5均為氫，r4為甲基，所述化合物的結(jié)構(gòu)式如下：其中，r6為氫、-oh、-nh2、鹵素、-och3、-ocf3、甲基、乙基、異丙基，乙烯基，丙烯基、丙炔基、2-(三氟甲基)乙基、2-溴乙基、2-疊氮乙基、乙?；?、2-鹵(氯、溴)乙?；?、2-疊氮基乙酰基、苯甲?；?、苯乙?；蚱渲校鰎10為氫、-oh、-nh2、鹵素、甲基、乙基、異丙基，乙烯基，丙烯基、羧基、疊氮基、肟基、胺基、巰基、酰胺基、硫酸酯基、鼠李糖基、苯基或芐基，且所述苯基和芐基任選地被一個或多個選自鹵素、-och3、-oh、-ocf3、-nh2、-nhrx和-nrx2中的基團所取代，其中，rx各自獨立地是飽和的脂肪族的c1-4烷基、苯基或芐基；n為2～7的整數(shù)；所述鹵素為-f、-cl、-br、-i。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述r3為r1、r7和r6均為-oh，r2、r5均為氫，r4為甲基，所述化合物的結(jié)構(gòu)式如下：其中，r1、r7和r8各自獨立地為氫、-oh、-nh2、鹵素、-och3、-ocf3、甲基、乙基、異丙基，乙烯基，丙烯基、丙炔基、2-(三氟甲基)乙基、2-溴乙基、2-疊氮乙基、乙?；?、2-鹵(氯、溴)乙?；?、2-疊氮基乙酰基、苯甲酰基、苯乙酰基或其中，所述r9為氫、-oh、-nh2、鹵素、甲基、乙基、異丙基，乙烯基，丙烯基、羧基、疊氮基、肟基、胺基、巰基、酰胺基、硫酸酯基、鼠李糖基、苯基或芐基，且所述苯基和芐基任選地被一個或多個選自鹵素、-och3、-oh、-ocf3、-nh2、-nhrx和-nrx2中的基團所取代，其中，rx各自獨立地是飽和的脂肪族的c1-4烷基、苯基或芐基；n為2～7的整數(shù)；所述鹵素為-f、-cl、-br、-i。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述聚醚類化合物為下列化合物之一：r1為或-oh，r2、r3各自獨立地為或氫，r4、r5各自獨立地為甲基或氫，r6、r7、r8均為-oh。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述聚醚類化合物為下列化合物之一：根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述癌癥為腦癌、皮膚癌、腎癌、骨癌、肉瘤、前列腺癌、子宮癌、黑色素癌、結(jié)腸癌、淋巴癌、白血病、胰腺癌、上皮細胞癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、卵巢癌及相應(yīng)的腫瘤細胞干細胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述藥物通過抑制腫瘤細胞干細胞增殖預(yù)防癌癥復發(fā)。目前以聚醚為母核的化合物先主要作為抗生素使用，發(fā)明人經(jīng)大量實驗偶然發(fā)現(xiàn)該類化合物具有良好的抗腫瘤活性。通過將該三個化合物分別與惡性腫瘤細胞混合培養(yǎng)，其都可以有不同程度的抗腫瘤活性。由此，以聚醚為母核的化合物在其藥學上可接受給藥形式(游離形式、鈉鹽或鉀鹽形式、螯合形式、水合形式)可用于治療惡性腫瘤細胞，豐富了治療這類疾病藥物的多樣性。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通式i所示的聚醚類化合物能夠抑制惡性腫瘤細胞的增殖，并對化合物1、化合物2和化合物3這三個化合物進行了研究，發(fā)現(xiàn)其對多種癌細胞具有抑制作用。具體地，發(fā)明人通過下面的實驗過程證明了發(fā)明人的觀點：(1)發(fā)明人將多種癌細胞與化合物1、化合物2和化合物3這三個化合物尤其是其鈉鹽在體外分別混合培養(yǎng)。利用mtt染色法，通過測其od值，計算化合物1、化合物2和化合物3這三個化合物對腫瘤細胞增殖的抑制率及ic50(半數(shù)抑制率)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，化合物1、化合物2和化合物3這三個化合物對多種腫瘤細胞均有不同程度的抑制作用。(2)發(fā)明人通過與抗癌藥紫杉醇以及與同類被發(fā)現(xiàn)具有抗癌作用的鹽霉素(salinomycin)對比發(fā)現(xiàn)，這三個化合物都對多種癌細胞增殖的抑制作用明顯強于紫杉醇的抑制作用，部分強于鹽霉素。附圖說明圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的化合物1的圖譜示意圖；圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的化合物2的圖譜示意圖；圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的化合物3的圖譜示意圖；圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的干細胞流式檢測的圖譜示意圖。具體實施方式下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實施例1化合物1、化合物2和化合物3是通過streptomyceshygroscopicus亞型鏈霉菌和streptomycesendus亞型鏈霉菌發(fā)酵獲得的，具體方法如下：將兩株streptomyceshygroscopicus亞型和streptomycesendus亞型鏈霉菌分別接種于sfm平板，培養(yǎng)三天到四天左右。待sfm培養(yǎng)基中形成菌落時，挑單菌落至種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)三天到四天左右，按照1％的量接菌至發(fā)酵培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基的成份為可溶性淀粉30g/l，黃豆餅粉10g/l，酵母抽提物2.5g/l，caco33g/l，ph7.2)中。培養(yǎng)條件：30度，220轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)7到8天時間。待培養(yǎng)到第7或8天時，收取發(fā)酵液，高速離心使上清與菌絲體分離，菌絲體加入等量的丙酮破菌，超聲20min，旋蒸丙酮，上清與菌絲體采用等量的乙酸乙酯萃取，重復一次。旋蒸濃縮至干，后用硅膠柱粗分離，得到粗品用hplc檢測產(chǎn)物，鑒于hplc結(jié)果顯示該三株菌的產(chǎn)量比較高，因此，我們也對濃縮完的樣品進行了tlc點板，并在碘缸里顯色，將很明顯的點摳下，用甲醇溶解，高速離心取上清做質(zhì)譜確定目標點的位置，化合物檢測的結(jié)果如圖1-3所示，圖1表明該化合物為化合物1，圖2表明該化合物為化合物2，圖3表明該化合物為化合物3。實施例2利用mtt實驗檢測化合物1鈉鹽與紫杉醇對mcf-7腫瘤細胞的抑制作用，具體方法如下：分別取對數(shù)生長期的mcf-7(乳腺癌細胞,武漢大學基礎(chǔ)醫(yī)學院菌種保藏中心)，待細胞長滿瓶壁80％時，采用0.25％-edta胰蛋白酶消化(3min-5min)使細胞懸浮。將該細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板中(每孔細胞數(shù)在5000個左右)，每孔200μl；對照組為每孔加入200μl不加藥物的細胞的組；空白組為每孔加入200μl不含細胞的培養(yǎng)基的組。將上述接種了細胞的96孔細胞培養(yǎng)板放入細胞含5％的co2培養(yǎng)箱中孵育37℃過夜，使細胞貼壁。樣品化合物1鈉鹽，鹽霉素(salinomycin)和現(xiàn)有抗癌藥物紫杉醇分別用dmso溶解，配制為100mg/ml的儲存液，然后使用前用相應(yīng)培養(yǎng)基稀釋成不同濃度(dmso終濃度小于0.1％)的樣品溶液。在不同的實驗組中分別加入200μl不同濃度的樣品溶液(化合物1鈉鹽，鹽霉素)(100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml，0.01μg/ml)或紫杉醇溶液(100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml，0.01μg/ml)；對照組為往貼壁細胞中加入200μl培養(yǎng)基的組；空白組為無細胞只加200μl培養(yǎng)基的組。然后將此加過不同濃度藥物溶液(100、10、1、0.1、0.01μg/l樣品溶液或鹽霉素或紫杉醇溶液)的96孔細胞培養(yǎng)板在細胞培養(yǎng)箱(37℃)中培養(yǎng)48小時后，在取出的上述96孔細胞培養(yǎng)板的每個孔中加入20μl0.5mg/ml的噻唑藍(mtt)，然后繼續(xù)放入細胞培養(yǎng)箱(37℃)中培養(yǎng)。2-4個小時后，將與mtt共同孵育的96孔細胞培養(yǎng)板在高速離心機中以2000rpm離心10分鐘。離心后，去除96孔細胞培養(yǎng)板中上清液，然后通過向每孔加100μl二甲基亞砜(dmso)溶解在96孔板底部生成的甲臢藍色結(jié)晶。該加過dmso的96孔細胞培養(yǎng)板在平板振蕩器上振蕩10分鐘后，利用酶聯(lián)免疫檢測儀，在570nm波長下檢測od值(參比波長為490nm)，計算抑制率及ic50(半數(shù)抑制率)。抑制率％＝(a-a0)/(a-a1)×100％式中：a代表對照組的od值；a0代表樣品組的od值；a1代表空白組的od值。化合物1鈉鹽及紫杉醇對mcf-7細胞的ic50值受試物對mcf-7的ic50(μmol/l)化合物1鈉鹽1.63±0.04紫杉醇8.49±1.43salinomyicn3.86±0.08由上表所示的結(jié)果可知，與紫杉醇相比，化合物1鈉鹽對mcf-7細胞體外增殖均有更顯著的抑制作用，其對mcf-7細胞株的ic50值較紫杉醇降低了5.21倍，較salinomycin降低了2.34倍。說明化合物1鈉鹽對mcf-7腫瘤細胞增殖有較強的抑制作用，其抑制作用明顯強于紫杉醇的抑制作用。實施例3：利用mtt實驗檢測化合物3與紫杉醇對mcf-7腫瘤細胞的抑制作用，實驗方法以及檢測方法同實施例2，區(qū)別在于所采用的化合物為化合物2?；衔?的鈉鹽及紫杉醇對mcf-7細胞的ic50值如下表所示?；衔?鈉鹽及紫杉醇對mcf-7細胞的ic50值受試物對mcf-7的ic50(μmol/l)化合物2鈉鹽2.25±0.19紫杉醇8.49±1.43salinomyicn3.86±0.08由上表所示的結(jié)果可知，與鹽霉素、紫杉醇相比，化合物2鈉鹽對mcf-7細胞體外增殖均有更顯著的抑制作用，其對mcf-7細胞株的ic50值較紫杉醇降低了3.77倍，與鹽霉素相當。說明化合物2鈉鹽對mcf-7腫瘤細胞增殖有較強的抑制作用，其抑制作用明顯強于紫杉醇的抑制作用。實施例4：利用mtt實驗檢測化合物3與紫杉醇對mcf-7腫瘤細胞的抑制作用，實驗方法以及檢測方法同實施例2，區(qū)別在于所采用的化合物為化合物3?；衔?的鈉鹽及紫杉醇對mcf-7細胞的ic50值如下表所示。受試物對mcf-7的ic50(μmol/l)化合物3鈉鹽5.19±1.4紫杉醇8.49±1.43salinomyicn3.86±0.08由表中所示的結(jié)果可知，與紫杉醇相比化合物3鈉鹽對mcf-7細胞體外增殖均有更顯著的抑制作用，其對mcf-7細胞株的ic50值較紫杉醇降低了1.61倍。說明化合物4鈉鹽對mcf-7腫瘤細胞增殖有較強的抑制作用，其抑制作用強于紫杉醇的抑制作用，但抗癌活性不及salinomycin。實施例5：本發(fā)明通式的化合物鈉鹽衍生物化合物的制備方法，具體如下：在0℃，無水無氧條件下，分別將化合物1、2、3(1.7g，200毫摩爾)、二環(huán)己基碳二亞胺(240毫摩爾)和4-二甲氨基吡啶(10毫摩爾)溶解于二氯甲烷(8ml)中，后在攪拌下緩慢滴加相應(yīng)的試劑，滴加結(jié)束后放置室溫過夜反應(yīng)。向反應(yīng)體系中加入0.1mol/l的hcl溶液淬滅，飽和食鹽水洗滌反應(yīng)液，用乙酸乙酯萃取，合并有機相，有機相中加入無水硫酸鈉干燥，旋蒸除去溶劑得到濃縮液，濃縮液經(jīng)過快速過柱得到如式ii、iv、vi所式的結(jié)構(gòu)衍生物。實施例6：本發(fā)明通式的化合物鈉鹽衍生物化合物的制備方法，具體如下：在0℃，無水無氧條件下，任意將化合物1，2，3(1.7g，200毫摩爾)、和4-二甲氨基吡啶(10毫摩爾)溶解于二氯甲烷(8ml)，后在攪拌下緩慢滴加三乙胺(600毫摩爾)，攪拌10min后，再滴加相應(yīng)的酰氯，溴代化合物。滴加結(jié)束后放置室溫反應(yīng)數(shù)小時。向反應(yīng)體系中加入0.1mol/l的hcl溶液淬滅，飽和食鹽水洗滌反應(yīng)液，用乙酸乙酯萃取，合并有機相，有機相中加入無水硫酸鈉干燥，旋蒸除去溶劑得到濃縮液，濃縮液經(jīng)過快速過柱得到如式iii、v、vii所示的結(jié)構(gòu)的衍生物。實施例7檢測化合物1、2、和3對多種腫瘤細胞的抑制作用，具體方法如下：(1)細胞復蘇：實驗前，超凈工作臺臺面用紫外線照射30min。將水浴鍋預(yù)熱至37℃，將新鮮配制的培養(yǎng)基置于水浴鍋預(yù)熱。取出凍存的細胞，迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用含70％酒精棉球擦拭凍存管的外壁。吸取凍存管內(nèi)細胞，轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，同時加入5ml預(yù)熱完全培養(yǎng)基。500g低轉(zhuǎn)速離心3-5min，吸棄上清液。向離心管內(nèi)加入10ml培養(yǎng)液，輕柔吹打制成細胞懸液。通過臺盼藍染色細胞記數(shù)并進行活力測定后，將細胞懸液加入10cm培養(yǎng)皿中，于含37℃/5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。(2)細胞培養(yǎng)：細胞培養(yǎng)時所需的培養(yǎng)基及傳代的比例參考atcc，細胞實驗前的一代傳代培養(yǎng)過程中，將該細胞的培養(yǎng)基換成無酚紅培養(yǎng)基+10％fbs。(3)細胞抑制實驗：化合物樣品均用dmso進行8濃度5倍梯度稀釋，檢測時用無酚紅的完全培養(yǎng)基進行稀釋，配置成實驗用濃度(5倍最終濃度)的溶液。細胞活力檢測方法:a)接種細胞：收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，在384孔板中接種40μl細胞懸液，邊緣孔用無菌pbs填充。b)將細胞板放在37℃/5％co2培養(yǎng)箱孵育過夜，第二天加入10μl5倍待測濃度的化合物樣品。c)細胞在37℃/5％co2培養(yǎng)箱孵育，72小時用倒置顯微鏡進行觀察。d)讀板：72小時后室溫孵育10min，每孔加入30μl每孔celltiter-glo反應(yīng)混合物，將檢測板振蕩2-3分鐘，室溫孵育10min。在pherastar(bmglabtech)讀rlu值并保存數(shù)據(jù)。cellgrowthinhibition％＝100％×[1-rlu樣品/rlu陰性]，其中rlu樣品為加樣品孔或陽性對照孔rlu值，rlu陰性為僅含dmso的rlu值。運用graphpadprism6.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果如下表所示，表明化合物對多種腫瘤均具有顯著的抑制作用?；衔?、化合物2和化合物3對多種腫瘤細胞的ic50值實施例8：檢測化合物1、化合物2和化合物3對腫瘤干細胞增殖的抑制作用，具體方法如下：(1)懸浮培養(yǎng)的富集干細胞的含量測定：細胞培養(yǎng)對象：人乳腺癌細胞株mda-mb-231細胞。培養(yǎng)方式：采用懸浮細胞培養(yǎng)方式培養(yǎng)，37度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。懸浮細胞培養(yǎng)培養(yǎng)基(200ml)：b274ml；insulin80μl；dmem-f12194ml；hegf:40μl；雙抗：2ml培養(yǎng)瓶：t25(15ml)；t75(75ml)；接種密度：1000個/ml；檢測試劑盒：aldefluortmkit；培養(yǎng)時間：10天到15天左右(每天搖晃2次以上)。實驗過程：(1)將細胞培養(yǎng)后分裝15ml離心管中，并清洗一次t25瓶，配平離心250g,10min；(2)移去上清，各加入1ml(0.05％)胰酶，并用pbs清洗一次，轉(zhuǎn)移到t25培養(yǎng)瓶中，緩慢輕輕對打至單個細胞過程5min到10min；(3)轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，配平離心250g10min；(4)用1mlpbs分兩次加入，轉(zhuǎn)移至1.5mlep管中，對打均勻，取少量計數(shù)；(5)計算數(shù)量在10萬到20萬個細胞與ep管中，離心去掉pbs,加入試劑盒緩沖液1ml重懸；(6)去另外一個ep管中加入deab10μl，后向細胞ep管中加入已經(jīng)激活的aldfluor試劑10μl，快速混合充分，吸取0.5ml于deab的ep管中，混合均勻，放入37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)45min；(7)45min后，離心(250g，10min)去掉上清，加入試劑緩沖液0.5ml重懸，放在冰上避光保存。采用流式細胞儀對細胞進行檢測，實驗結(jié)果如圖4所示，貼壁細胞中干細胞的含量為2.36％，經(jīng)過懸浮細胞培養(yǎng)后得到的干細胞比例為25.95％，從而提高了近11倍。數(shù)據(jù)間存在顯著性差異。從而可以看到達到了我們富集干細胞的目的。(2)藥物抑制試驗：藥物：化合物1、化合物2和化合物3細胞種類：步驟(1)富集的干細胞細胞接種：96孔細胞每孔接種細胞量12000左右每120μl。藥物的稀釋濃度：采用pbs稀釋：設(shè)置濃度：100μg/ml、20μg/ml、4μg/ml、0.8μg/ml、0.16μg/ml、0.032μg/ml、0.0064μg/ml、0.00128μg/ml、0.000256μg/ml。加化合物：將細胞板放在37℃/5％co2培養(yǎng)箱孵育過夜，第二天加入10μl5倍待測濃度的化合物樣品。檢測時間以及檢測方式：給藥72h后采用mtt法進行檢測，后用三聯(lián)溶液(10％sds、5％異丁醇、0.1％濃鹽酸)溶解采用酶標儀在570nm處檢測od值。每個化合物獨立重復一次。結(jié)果如下表受試藥物ic50(g/ml)化合物11.176e-06±0.041化合物22.35e-06±0.152化合物34.251e-06±0.129結(jié)果表明，化合物1、化合物2和化合物3均對腫瘤干細胞有顯著的抑制作用，從而可以抑制腫瘤的復發(fā)。在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進行結(jié)合和組合。盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。當前第1頁12