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一種小分子化合物在抗流感病毒藥物中的應(yīng)用的制作方法與工藝

文檔序號:11991989閱讀:284來源:國知局
一種小分子化合物在抗流感病毒藥物中的應(yīng)用的制作方法與工藝
本發(fā)明涉及一種新的化合物,更具體地,涉及一種抗流感病毒化合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù):
流行性感冒是流感病毒引起的急性呼吸到感染的傳染病,特別是由甲型流感病毒引起的流行性感冒是嚴(yán)重危害家養(yǎng)畜禽及人類健康的一種人畜共患病。其對人類致病性高,曾多次引起了世界性的大流行,給許多國家和地區(qū)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失和社會恐慌。目前市面上生成的針對流感的抗病毒藥物主要是針對流感病毒的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)為靶標(biāo)的藥物,如扎那米韋和達(dá)菲。但是與抗生素不同,抗病毒的藥物抗病毒譜比較窄,而HA和NA突變率很高,所以不斷研究和開發(fā)新型的抗流感藥物是一項艱巨而又需要不斷堅持的重要工作。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明提供一種抗病毒化合物在抗流感病毒藥物中的應(yīng)用,所述的抗病毒化合物的結(jié)構(gòu)式如式I所示:式I本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):該化合物利用流感病毒聚合酶復(fù)合體活性體系驗證其作用機(jī)制,該化合物針對的靶點(diǎn)為聚合酶復(fù)合體,具體相對廣泛抗流感病毒的活性。附圖說明圖1:抗病毒化合物對H1N1亞型流感的抑制效果的IC50。圖2:抗病毒化合物對細(xì)胞的毒性實(shí)驗(MTS)(CC50)。圖3:抗病毒化合物對H1N1亞型流感病毒的聚合酶復(fù)合體的復(fù)制活性的抑制效果。具體實(shí)施方式為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì),下面結(jié)合實(shí)驗和結(jié)果來說明這種抗病毒化合物對抗H1N1亞型流感的應(yīng)用。實(shí)驗一:抗病毒化合物的抗病毒效果的空斑實(shí)驗1)準(zhǔn)備24孔板的MDCK細(xì)胞,待細(xì)胞密度到80%-90%左右,可以開始感染實(shí)驗;2)去掉24孔細(xì)胞的上清培養(yǎng)基,用PBS洗1-2遍,加入稀釋好的病毒感染液;3)配好細(xì)胞培養(yǎng)液,感染1h后,去掉病毒感染液,用PBS洗1遍,加入含有梯度稀釋濃度的藥物的細(xì)胞培養(yǎng)基。4)感染24h后,收取感染的細(xì)胞上清進(jìn)行空斑實(shí)驗。準(zhǔn)備好密度為90%以上的12孔MDCK細(xì)胞。取感染的細(xì)胞上清進(jìn)行稀釋,一般稀釋倍數(shù)有104倍、105倍、106倍,即-4、-5、-6。5)去掉MDCK細(xì)胞上清培養(yǎng)基,用PBS洗1-2遍,加入稀釋好的感染上清,每孔300ul,孵育1-2h;6)把2*瓊脂糖膠放入微波爐中低火3min至完全溶解,在放入水浴鍋溫?。?)待1*瓊脂糖培養(yǎng)基溫度為42°C左右,去掉孵育的上清,用PBS洗1遍,加入1*瓊脂糖膠培養(yǎng)基1ml/12孔;放入4度冰箱5-10min左右,待瓊脂糖膠凝固后,倒扣放入37度培養(yǎng)箱。8)48小時后觀察噬斑。本實(shí)驗證明該抗病毒化合物具有良好的抗H1N1亞型流感病毒的作用。實(shí)驗二:細(xì)胞毒性和凋亡活性檢測分別將0.5uM,1uM,10uM,50uM的抗病毒化合物與MDCK細(xì)胞共同孵育,48小時后用MTS法檢測細(xì)胞活力。本實(shí)驗證明該抗病毒化合物不具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。實(shí)驗三:抗病毒化合物對流感病毒聚合酶復(fù)合體活性的抑制實(shí)驗1)構(gòu)建真核表達(dá)的H1N1亞型流感病毒的聚合酶復(fù)合體蛋白的質(zhì)粒:pcDNA3.1-PB1,pcDNA3.1-PB2,pcDNA3.1-PA和pcDNA3.1-NP。2)取生長良好的人腎上細(xì)胞株239T細(xì)胞,接種于48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔1×105細(xì)胞。使用的培養(yǎng)基是完全培養(yǎng)基:高糖DMEM,10%胎牛血清以及1%雙抗,培養(yǎng)條件是5%二氧化碳、37℃;3)24h貼壁后,共轉(zhuǎn)染流感聚合酶質(zhì)粒系統(tǒng)。轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)染,試劑使用lipo2000,轉(zhuǎn)染液50μl。3)轉(zhuǎn)染12h后,加入化合物,每孔加入化合物終濃度為0.5uM,1uM,10uM,50uM。4)培養(yǎng)24h后,利用雙報告系統(tǒng)檢測熒光素酶luciferase與renilla表達(dá)的比值。實(shí)驗結(jié)果如圖3所示,從實(shí)驗結(jié)果可以看出,抗病毒化合物均具有抑制H1N1亞型流感病毒聚合酶復(fù)合體活性的作用。本實(shí)驗說明該抗病毒化合物能夠抑制H1N1亞型流感病毒的復(fù)合酶活性。
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