穿心蓮總內酯提取方法、穿心蓮總內酯藥物組合物及用途
【專利摘要】本申請公開了一種提取穿心蓮總內酯的方法。所述方法包括：將干燥的穿心蓮全草或莖葉用C1-4低級醇水溶液浸提，濃縮浸提液，用活性炭熱處理；和將處理后的濃縮液進一步濃縮至完全除去所述低級醇后加入非極性或弱極性有機溶劑萃取，取有機相濃縮結晶。該方法工藝步驟簡單，提取效率顯著提高，適于工業(yè)化生產(chǎn)。本申請還公開了一種穿心蓮總內酯藥物組合物及其在制備用于治療或抑制炎癥的藥物中的用途。
【專利說明】穿心蓮總內酯提取方法、穿心蓮總內酯藥物組合物及用途

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明總地涉及中藥提取物及提取方法，更具體地，涉及穿心蓮總內酯提取物及 提取方法。

【背景技術】
[0002] 穿心蓮是爵床科植物穿心蓮（Andrographis paniculata(Burm. f. )Nees)的干燥 地上部分（中國藥典2010版）。穿心蓮中主要活性成分為穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯、 新穿心蓮內酯、脫氧穿心蓮內酯等（陳麗霞、曲戈霞、邱峰，穿心蓮二萜內酯類化學成分的 研究[J].中國中藥雜志，2006, 31 (19): 1594)。穿心蓮作為臨床常用抗炎中藥，具有多種抗 炎有效成分，有清熱解毒、消炎、消腫止痛的作用，主要用于治療細菌性痢疾、尿路感染、急 性扁桃體炎、腸炎、咽喉炎、肺炎和流行性感冒等（張望望、張文書，穿心蓮抗炎作用機制研 究[J]?醫(yī)學綜述，2008,14(06) :938-939)。其中穿心蓮內酯的抗炎效果是目前臨床所公 認的。目前有關穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯、新穿心蓮內酯抗炎作用研究較多（Niranjan A,Tewari SK, Lehri A. Biological activities of Kalmegh (Andrographis paniculata Nees)and its active principles - A review [J].Indian Journal of Natural Products and Resources, 2010, 1 (2): 125-135)，如在基于脂多糖（LPS)刺激小鼠巨噬細 胞RAW264. 7建立的體外炎癥模型中，穿心蓮內酯（Chiou WF，Chen CF，Lin JJ. Mechanism of suppression of inducible nitric oxide synthase(iNOS)expression in RAW 264.7cells by andrograpolide[J]. British Journal of Pharmacology, 2000, 129(8) :1 553-1560)和新穿心蓮內酯（Batkhuu J,Hattori K,Takano F,et al. Suppression of NO production in activated macrophages in vitro and ex vivo by Neoandrographolide isolated from andrographis paniculata[J]. Biol. Pharm. Bull. 2002, 25(9):1169-1174) 的IC50值分別為17. 4 y mol/L和35. 5 y mol/L。穿心蓮內酯和新穿心蓮內酯的抗炎機理是 在巨噬細胞RAW264. 7中，兩者能通過降低誘導型一氧化氮合酶蛋白的表達來抑制一氧化 氮的合成，還能從頭阻止蛋白合成，加速蛋白的降解，降低其穩(wěn)定性。
[0003] 已經(jīng)有大量研究公開了提取穿心蓮藥材中有效成分的方法。例如，中國發(fā)明專利 申請CN 1810240A中公開了用70%乙醇溶液浸提穿心蓮全草，去掉葉綠素等脂溶性雜質后 經(jīng)樹脂柱純化，犾得的芽心連總內醋中，芽心連內醋占總內醋的20 -80%;或者米用C02超臨 界流體萃取的方法獲得的穿心蓮總內酯中，穿心蓮內酯占總內酯40-95 %。再如，中國發(fā)明 專利申請CN101559088A中公開了由穿心蓮莖葉提取各種內酯純品的方法。該方法用95% 乙醇溶液浸提后去掉葉綠素等脂溶性雜質，濃縮獲得浸膏、溶于甲醇，并析出穿心蓮內酯結 晶，再經(jīng)氧化鋁柱除去黃酮類，得到穿心蓮總內酯，其中穿心蓮內酯占總內酯含量的20%上 下。
[0004] 上述方法均需要采用柱純化方法，工藝復雜，增加工業(yè)化生產(chǎn)的成本。
[0005] 此外，目前還未有關于穿心蓮總內酯抗炎的詳細研究的報道。
[0006] 因此仍需要開發(fā)更為簡單有效且成本低廉的提取工藝并進一步明確穿心蓮總內 酯的抗炎效果。


【發(fā)明內容】

[0007] 針對以上現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種工藝步驟簡單，提 取效率更高的穿心蓮總內酯提取方法。該方法不用柱純化方法，更適于工業(yè)化生產(chǎn)。此外， 本發(fā)明還提供了一種穿心蓮總內酯藥物組合物，該組合物的各組分間具有協(xié)同作用，能更 好地抑制炎癥。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種提取穿心蓮總內酯的方法。所述方法包括以下 步驟：
[0009] A.將干燥的穿心蓮全草或莖葉用C1-4低級醇水溶液浸提，濃縮浸提液，用活性炭 熱處理；和
[0010] B.將處理后的濃縮液進一步濃縮至完全除去所述低級醇后加入非極性或弱極性 有機溶劑萃取，取有機相濃縮結晶。
[0011] 穿心蓮的干燥全草或莖葉都可作為提取原料。本發(fā)明的方法提取效率高，因此優(yōu) 選采用成本更低廉的穿心蓮全草。
[0012] 根據(jù)優(yōu)選的實施方式，所述C1-4低級醇可為甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇或正丁 醇，優(yōu)選為甲醇或乙醇。
[0013] 所述C1-4低級醇的水溶液的體積百分比濃度（v/v)為70%以上，優(yōu)選90%以上， 更優(yōu)選為95%。最優(yōu)選為95%乙醇溶液。
[0014] 根據(jù)一種實施方式，步驟A中，將干燥的穿心蓮全草或莖葉用8?15倍量、優(yōu)選 8?12量、最優(yōu)選約10倍量的C1-4低級醇水溶液浸提1?3次，每次0. 5?2小時、優(yōu)選 0. 5?1. 5小時。
[0015] 根據(jù)一種實施方式，在用活性炭熱處理之前，減壓或常壓濃縮浸提液至原體積的 1/12?1/8、優(yōu)選約1/10,以獲得無沉淀濃縮液。濃縮溫度為50?80°C，優(yōu)選為約60°C。
[0016] 優(yōu)選地，活性炭的用量以所述干燥的穿心蓮全草或莖葉的重量計為3?8wt%、優(yōu) 選3?6wt %、最優(yōu)選為約4wt %。
[0017] 優(yōu)選地，活性炭熱處理溫度為50?80°C、優(yōu)選為約60°C。處理時間優(yōu)選約30分 鐘。
[0018] 所述非極性或弱極性有機溶劑優(yōu)選為選自由乙酸乙酯、二氯甲烷和氯仿所組成組 中的一種或多種。
[0019] 考慮到溶劑的毒性以及對環(huán)境的影響，最優(yōu)選為乙酸乙酯。且采用該溶劑時可完 全回收，在最終產(chǎn)品中無殘留。
[0020] 根據(jù)優(yōu)選的實施方式，萃取在50?80°C、優(yōu)選約60°C下進行。所述非極性或弱 極性有機溶劑的用量以所述干燥的穿心蓮全草或莖葉的重量計為200?1000ml/kg、優(yōu)選 400 ?750ml/kg、最優(yōu)選 500ml/kg。
[0021] 優(yōu)選地，將所述有機相在50?80°C、優(yōu)選約60°C濃縮為原體積的3/10?4/5、優(yōu) 選約1/2,在10°C以下，優(yōu)選在約4°C冷卻結晶。
[0022] 根據(jù)一種優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的方法包括以下步驟：
[0023] A.將干燥的穿心蓮全草或莖葉用濃度為90% (v/v)或更高的乙醇水溶液浸提 1?3次，每次0. 5?1. 5小時，在約60°C減壓濃縮浸提液至原體積的約1/10,用活性炭在 約60°C熱處理；和
[0024] B.將處理后的濃縮液進一步濃縮至完全除去乙醇后，以所述干燥的穿心蓮全草或 莖葉的重量計，以400?750ml/kg的比例加入乙酸乙酯進行萃取，取有機相在約60°C下濃 縮為原體積的3/10?4/5,在10°C以下冷卻結晶。
[0025] 根據(jù)一種最優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的方法包括以下步驟：
[0026] A.將干燥的穿心蓮全草用濃度為95% (v/v)的乙醇水溶液浸提2次，每次0. 5? 1. 5小時，在約60°C減壓濃縮浸提液至原體積的約1/10,用活性炭在約60°C熱處理，其中活 性炭的用量以所述干燥的穿心蓮全草的重量計為約4wt% ;和
[0027] B.將處理后的濃縮液進一步濃縮至完全除去乙醇后，以所述干燥的穿心蓮全草的 重量計，以500ml/kg的比例加入乙酸乙酯進行萃取，取有機相在約60°C下濃縮為原體積的 約1/2,在約4°C冷卻結晶。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供一種穿心蓮總內酯藥物組合物。所述組合物中穿心 蓮總內酯由穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯和新穿心蓮內酯組成，所述穿心蓮總內酯的含量 占所述組合物總重量的60wt%以上，其中所述組合物中穿心蓮內酯：脫水穿心蓮內酯：新 穿心蓮內酯的重量比為5?8:1:1?3。
[0029] 優(yōu)選地，所述組合物中穿心蓮內酯：脫水穿心蓮內酯：新穿心蓮內酯的重量比為 5?7:1:2?3。根據(jù)優(yōu)選實施方式，所述穿心蓮總內酯的含量占所述組合物總重量的60? 80wt %
[0030] 根據(jù)優(yōu)選的實施方式，所述穿心蓮總內酯藥物組合物為根據(jù)以上提取穿心蓮總內 酯的方法制備得到的提取物。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供上述穿心蓮總內酯藥物組合物在制備用于治療或抑 制炎癥的藥物中的用途。
[0032] 所述炎癥可為細菌性痢疾、尿路感染、急性扁桃體炎、腸炎、咽喉炎、肺炎、流行性 感冒、小兒手足口病等。
[0033] 本發(fā)明提供了一種工藝簡單、成本低廉的穿心蓮總內酯提取方法。該方法不需要 采用柱層析法對提取物進行純化，大大降低了成本，且更適于工業(yè)化生產(chǎn)。而且該方法不需 用石油醚等溶劑預先除去脂溶性雜質，僅用有機溶劑進行萃取和結晶就可直接獲得最終產(chǎn) 品，因而極大的簡化了步驟。并且，根據(jù)優(yōu)選方案所用的溶劑，乙酸乙酯，更為環(huán)保。采用本 發(fā)明的提取工藝，可對穿心蓮全草進行提取。雖然穿心蓮全草中穿心蓮總內酯的含量要低 于穿心蓮的葉子，根據(jù)產(chǎn)地、批次不同，全草中總內酯含量在約1. 99?4. 41%的范圍內波 動（根據(jù)廣東等五省穿心蓮藥材中穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯含量比較），但是其價格 低廉，且采用本發(fā)明的提取方法在大規(guī)模提取中可達到較高的提取率，從而降低了成本。
[0034] 以本發(fā)明提取方法獲得的提取物中，穿心蓮內醋含量最_，占到提取物的40wt% 以上。其他內酯的含量以新穿心蓮內酯其次，占到l〇wt%，甚至15wt%以上。再次是脫水 穿心蓮內酯，占約7?8wt%左右。因此，本發(fā)明中的穿心蓮總內酯是指由穿心蓮內酯、新穿 心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯組成的內酯；穿心蓮總內酯的含量是指穿心蓮內酯、新穿心蓮 內酯和脫水穿心蓮內酯三者的總含量。
[0035] 此外，經(jīng)進一步研究發(fā)現(xiàn)，雖然穿心蓮內酯對LPS誘導的巨噬細胞RAW264. 7釋放 的NO的抑制效果顯著好于脫水穿心蓮內酯和新穿心蓮內酯，但是本發(fā)明的穿心蓮總內酯 提取物對NO抑制效果要顯著好于任何一種單一成分。這提示穿心蓮總內酯中的各成分間 存在協(xié)同作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0036] 參照以下附圖，將更好地理解本發(fā)明的許多方面。
[0037] 圖1是顯示穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯和新穿心蓮內酯分別對巨噬細胞釋放N0 的抑制作用的濃度vs抑制率曲線圖。
[0038] 圖2是顯示根據(jù)本申請實施例1?3的穿心蓮總內酯提取物對巨噬細胞釋放N0 的抑制作用的濃度vs抑制率曲線圖。

【具體實施方式】
[0039] 為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面結合附圖對本發(fā)明的具體實 施方式進行詳細說明。附圖中所示和根據(jù)附圖描述的本發(fā)明的實施方式僅僅是示例性的， 并且本發(fā)明并不限于這些實施方式。
[0040] 實施例1大規(guī)模制備穿心蓮總內酯提取物
[0041] 穿心蓮藥材（購自安徽亳州，爵床科植物穿心蓮（Andrographis paniculata(Burm. f. )Nees)的干燥全草）24. 5kg用10倍量（體積）的95%乙醇回流提取 兩次，每次lh，合并提取液，60°C減壓濃縮，回收乙醇，得到體積為原提取液10%的濃縮液。 加入980g(以藥材重量計4wt% )活性碳，60°C熱處理30分鐘，趁熱抽濾，進一步在60°C下 濃縮至無醇味。向濃縮得到的水溶液中加入12. 25L(以藥材重量計500ml/kg)乙酸乙酯， 在60°C下萃取，并在60°C下濃縮至有微量黃色結晶析出，冷卻至4°C放置，待晶體完全析出 后抽濾，晾干，得到黃色粉末，即為穿心蓮總內酯提取物。
[0042] 實施例2大規(guī)模制備穿心蓮總內酯提取物
[0043] 穿心蓮藥材（購自安徽亳州，爵床科植物穿心蓮（Andrographis paniculata(Burm. f. )Nees)的干燥全草）25kg用10倍量（體積）的75%乙醇回流提取3 次，每次3h，合并提取液，60°C減壓濃縮，回收乙醇，得到體積為原提取液9 %的濃縮液。加 入750g(以藥材重量計3wt% )活性碳，60°C熱處理30分鐘，趁熱抽濾，進一步在60°C下濃 縮至無醇味。將濃縮得到的水溶液，加入25L(以藥材重量計1000ml/kg)乙酸乙酯，在60°C 萃取，并在60°C下濃縮至有微量黃色結晶析出，冷卻至4°C放置，待晶體完全析出后抽濾， 晾干，得到黃色粉末，即為穿心蓮總內酯提取物。
[0044] 實施例3大規(guī)模制備穿心蓮總內酯提取物
[0045] 穿心蓮藥材（購自安徽亳州，爵床科植物穿心蓮（Andrographis paniculata(Burm. f. )Nees)的干燥全草）25kg用10倍量（體積）的90%乙醇回流提取1 次，每次2h，合并提取液，60°C減壓濃縮，回收乙醇，得到體積為原提取液12%的濃縮液。加 入1500g(以藥材重量計6wt% )活性碳，80°C熱處理30分鐘，趁熱抽濾，進一步在60°C下 濃縮至無醇味。將濃縮得到的水溶液，加入18. 75L(以藥材重量計750ml/kg)乙酸乙酯，在 60°C萃取，并在70°C下濃縮至有微量黃色結晶析出，冷卻至4°C放置，待晶體完全析出后抽 濾，晾干，得到黃色粉末，即為穿心蓮總內酯提取物。
[0046] 實施例1?3的提取效率
[0047] 以上實施例1?3的提取效率分別以轉移率和得率表示如下表1。
[0048] 其中，轉移率和得率的計算公式如下：

【權利要求】
1. 一種提取穿心蓮總內酯的方法，包括以下步驟： A. 將干燥的穿心蓮全草或莖葉用C1-4低級醇的水溶液浸提，濃縮浸提液，用活性炭熱 處理；和 B. 將處理后的濃縮液進一步濃縮至完全除去所述低級醇后加入非極性或弱極性有機 溶劑萃取，取有機相濃縮結晶。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述C1-4低級醇為甲醇或乙醇。
3. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述C1-4低級醇的水溶液的體積百分比濃度 (v/v)為70%以上。
4. 根據(jù)權利要求3所述的方法，其中，步驟A中，將干燥的穿心蓮全草或莖葉用8?15 倍量的C1-4低級醇的水溶液浸提1?3次。
5. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，步驟A中，減壓或常壓濃縮所述浸提液至原體積 的1/12?1/8,以獲得無沉淀濃縮液，其中濃縮溫度為50?80°C。
6. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，步驟A中，所述活性炭的用量以所述干燥的穿心 蓮全草或莖葉的重量計為3?8wt% ;且用活性炭熱處理的溫度為50?80°C。
7. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，步驟B中，所述非極性或弱極性有機溶劑為選自 由乙酸乙酯、二氯甲烷和氯仿所組成組中的一種或多種。
8. 根據(jù)權利要求7所述的方法，其中，步驟B中，所述萃取在50?80°C下進行；非極性 或弱極性有機溶劑的用量以所述干燥的穿心蓮全草或莖葉的重量計為200?1000ml/kg。
9. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，步驟B中，將所述有機相在50?80°C濃縮為原 體積的3/10?4/5 ;并在10°C以下冷卻結晶。
10. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，包括以下步驟： A. 將干燥的穿心蓮全草或莖葉用濃度為90% (v/v)或更高的乙醇水溶液浸提1?3 次，每次〇. 5?1. 5小時，在60°C減壓濃縮浸提液至原體積的1/10,用活性炭在60°C熱處 理；和 B. 將處理后的濃縮液進一步濃縮至完全除去乙醇后，以所述干燥的穿心蓮全草或莖葉 的重量計，以400?750ml/kg的比例加入乙酸乙酯進行萃取，取有機相在60°C下濃縮為原 體積的3/10?4/5,在10°C以下冷卻結晶。
11. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，包括以下步驟： A. 將干燥的穿心蓮全草用濃度為95% (v/v)的乙醇水溶液浸提2次，每次0. 5?1. 5 小時，在60°C減壓濃縮浸提液至原體積的1/10,用活性炭在60°C熱處理，其中活性炭的用 量以所述干燥的穿心蓮全草的重量計為4wt% ;和 B. 將處理后的濃縮液進一步濃縮至完全除去乙醇后，以所述干燥的穿心蓮全草的重量 計，以500ml/kg的比例加入乙酸乙酯進行萃取，取有機相在60°C下濃縮為原體積的1/2,在 4 °C冷卻結晶。
12. -種穿心蓮總內酯藥物組合物，其中，穿心蓮總內酯由穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內 酯和新穿心蓮內酯組成，所述穿心蓮總內酯的含量占所述組合物總重量的60wt%以上，其 中，所述組合物中穿心蓮內酯：脫水穿心蓮內酯：新穿心蓮內酯的重量比為5?8:1:1? 3〇
13. 根據(jù)權利要求12所述的穿心蓮總內酯藥物組合物，其中，所述組合物中穿心蓮內 酯：脫水穿心蓮內酯：新穿心蓮內酯的重量比為5?7:1:2?3。
14. 一種穿心蓮總內酯藥物組合物，該藥物組合物為根據(jù)權利要求1?11中任意一項 所述的提取穿心蓮總內酯的方法制備得到的提取物。
15. 根據(jù)權利要求12?14中任意一項所述的穿心蓮總內酯藥物組合物在制備用于治 療或抑制炎癥的藥物中的用途。
16. 根據(jù)權利要求15所述的用途，其中，所述炎癥為細菌性痢疾、尿路感染、急性扁桃 體炎、腸炎、咽喉炎、肺炎、流行性感冒或小兒手足口病。
【文檔編號】A61K36/19GK104382968SQ201410583323
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月27日 優(yōu)先權日:2014年10月27日
【發(fā)明者】徐芳芳, 石偉, 張橋, 王振中, 楊華巍 申請人:南京慷睿特醫(yī)藥科技有限公司