Ⅱ型抑瘤素m受體在治療動脈粥樣硬化中的功能和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種Ⅱ型抑瘤素M受體（Osmr）在治療動脈粥樣硬化中的功能和應用，屬于基因的功能與應用領域。本發(fā)明以ApoE-/-小鼠及Osmr-/-ApoE-/-小鼠為實驗對象，通過高脂飲食誘導獲得動脈粥樣硬化模型，結果表明與ApoE-/-小鼠對比，Osmr基因缺陷顯著減少了主動脈的斑塊面積，增強主動脈竇斑塊的穩(wěn)定性，顯著減輕了炎癥反應。這表明Osmr在動脈粥樣硬化中的功能主要體現(xiàn)為促進主動脈斑塊形成，特別是促進動脈粥樣硬化。針對Osmr的上述功能，Osmr可作為藥物靶標用于篩選預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物，Osmr的抑制劑可用于制備預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物。
【專利說明】II型抑瘤素Μ受體在治療動脈粥樣硬化中的功能和應用
[0001]

【技術領域】
[0002]本發(fā)明屬于基因的功能與應用領域，具體涉及一種II型抑瘤素Μ受體(Osmr)在治療動脈粥樣硬化中的功能和應用，具體是Osmr在制備預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物中應用。

【背景技術】
[0003]心腦血管疾病在許多發(fā)達國家中是主要致死性病因，在我國的發(fā)病率和致死率也逐年升高。心腦血管疾病的基礎是動脈粥樣硬化(Atheosclersisis, AS),動脈粥樣硬化可使動脈管壁增厚、變硬、管腔狹窄，導致很多心腦血管事件發(fā)生。而動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的破裂、血小板的聚集及血栓形成造成的冠狀動脈急性狹窄和閉塞是導致急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome, ACS)的重要原因。
[0004]動脈粥樣硬化是多種遺傳基因、危險因素及免疫機制共同參與的一種慢性炎癥性疾病，局部和全身的炎癥免疫反應在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，固有免疫和適應性免疫共同參與調節(jié)動脈粥樣硬化病變，病理上表現(xiàn)為大、中動脈多處斑塊形成，好發(fā)于血液分流、動脈彎曲及動脈分支等區(qū)域，其病變特征是血中脂質在動脈內膜沉積，弓丨起內膜灶性纖維性增厚，病灶深部為由壞死組織和細胞外脂質池形成的粥樣物質。動脈粥樣硬化斑塊中存在著多種免疫細胞，其中以巨噬細胞和T細胞最為常見，此外還有少量的樹突狀細胞(Dentritic cell,DC)、自然殺傷細胞(natural killer cell’NK cell)和肥大細胞(mast cell)等，偶有B淋巴細胞。
[0005]動脈粥樣硬化最早期肉眼可見的損傷是脂質條紋，主要由攝取了大量膽固醇的巨噬細胞源性泡沫細胞構成。血液循環(huán)中的單核細胞在動脈易損部位黏附到活性內皮細胞，啟動了脂質條紋的形成，黏附的單核細胞隨后受局部產生的化學趨附分子的吸引遷移到內膜下，并進一步分化為巨噬細胞。大量膽固醇脂在巨噬細胞內積聚，形成泡沫細胞，這是動脈粥樣硬化形成早期的特征性病理生理過程。動脈粥樣硬化的發(fā)生是多因素共同作用的結果，目前已發(fā)現(xiàn)的動脈粥樣硬化危險性因素很多，但相關針對治療及控制效果均不理想，降脂和抗炎治療是目前最主要的治療措施。
[0006]0SMR是抑瘤素M (0SM)的受體，是一種具有多種生物學活性的細胞因子。0SM屬于白細胞介素IL-6家族，能夠抑制腫瘤細胞。0SM作為一種多功能的細胞調節(jié)因子，可作用于多種細胞，具有多種生物學活性，能調節(jié)基因活性、細胞存活、增殖和分化的潛在功能，在炎癥反應、造血作用、肝臟發(fā)育以及免疫系統(tǒng)等方面展示出獨特的生物學活性，具有重要的生物學作用。0SM有兩種類型的受體，分別為I型和II型0SM受體(0SMR)，I型0SMR與LIF (白血病抑制因子)受體(LIFR)相同，由gpl30和一個LIF的結合亞單位構成的異源二聚體；II型0SMR由1個gpl30與1個OSMR0亞單位(OSMRP )構成的異源二聚體【1】，0SMRi3亞單位在神經元平滑肌上有表達。有研究證實了 0SM在炎性反應(風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化)中的作用，在風濕性關節(jié)炎患者的滑膜上，巨噬細胞可以產生OSM，它通過刺激蛋白水解途徑，間接破壞細胞外基質，以及刺激炎性介質(如前列腺素)產生等共同作用導致組織破壞【2】。體外研究中，OSM已被證明具有多種生物學活性，包括刺激造血，抑制腫瘤細胞生長，促進巨噬細胞分化，對神經營養(yǎng)肽的誘導作用，調節(jié)膽固醇代謝以及對骨細胞的作用等【3-6】。最新研究表明OSM通過增加細胞增殖，減少細胞凋亡和上調SERPIN家庭成員來介導STAT3依賴的腸上皮細胞的修復【7】;在成纖維細胞中，OSM通過OSMR增強IL-1和TNF的表達，從而加重破壞炎癥性關節(jié)炎【8】?；谏鲜鲅芯炕A，我們認為OSMR在動脈粥樣硬化形成的特征性病理生理過程中可能扮演著重要角色，但其在動脈粥樣硬化形成的特征性病理生理過程中的生物學功能和可能的作用機制尚未闡明。
[0007]小鼠和基因工程小鼠資源是目前疾病機制研究、基因功能研究、藥物創(chuàng)制等領域最重要的動物模型之一，也是這些領域創(chuàng)新研究的必須條件。利用基因工程小鼠針對動脈粥樣硬化病理過程中的各個分子環(huán)節(jié)進行研究，對闡明動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中的分子機制，尋找動脈粥樣硬化治療的分子靶點具有重要的意義。
[0008]【參考文獻】
1.胡志清，繆競誠。抑瘤素Μ的研究進展，上海醫(yī)學，2008:602-604.2.Pelletier J P, Mart e_l Pelletier J.0ncostatin M: foe or friend?Arthritis Rheum, 2003, 48: 3301-3303.3.楊吉成。醫(yī)用分子生物學。北京:化學工業(yè)出版社，2004:230-235.4.歐陽立明，劉建文。重組抑瘤素Μ抑制腫瘤細胞增殖轉移的研究。中國臨床藥理學與治療學，2005，10: 1335-1339.5.Jorcyk C L，Holzer RG，Ryan RE.0ncostatin M induces cell detachmentand enhances the metastatic capacity of T-47D human breast carcinoma cells.Cytokine, 2006， 33: 323-336.6.Miyajima A，Kinoshita T，Tanaka M， et al.Role of Oncostatin M inhematopoiesis and liver development.Cytokine Growth Factor Rev, 2000， 11:177-183.7.Beigel F， Friedrich M， Probst C， etal.0ncostatin M mediatesSTAT3-dependent intestinal epithelial restitut1n via increased cellproliferat1n, decreased apoptosis and upregulat1n of SERPIN family members.PLoS One.2014:9(4):e93498.8.Le Goff B， Singbrant S， Tonkin BA, etal.0ncostatin M acting via OSMR,augments the act1ns of IL-1 and TNF in synovial fibroblasts.Cytokine.2014Aug; 68(2): 101-9。


【發(fā)明內容】

[0009]本發(fā)明的目的在于確定Osmr的表達和動脈粥樣硬化的相互關系，提供一個用于預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的靶基因Osmr的新用途。
[0010]本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn):
本發(fā)明確定的Osmr的表達和動脈粥樣硬化的關系如下: 1.0smr基因敲除顯著減少了動脈粥樣硬化的斑塊面積
本發(fā)明以ApoE基因敲除(ApoE+)小鼠與Osmr/ApoE雙基因敲除(Osmr+ApoEi)小鼠為實驗對象，分別通過低脂飼料和高脂飼料飲食誘導獲得動脈粥樣硬化小鼠模型(AS)。結果表明ApoE+和Osmr+ApoE+小鼠通過低脂飼料飲食，主動脈樹有少量斑塊形成，通過高脂飼料飲食后，斑塊面積顯著增加，Osmr/ApoE-7-小鼠的主動脈樹、主動脈竇以及頭臂干的斑塊面積均顯著小于ΑροΕ+小鼠(圖1-2)。
[0011]2.0smr基因敲除顯著增強主動脈竇斑塊的穩(wěn)定性
本發(fā)明以ApoE基因敲除(ApoE+)小鼠與Osmr/ApoE雙基因敲除(Osmr+ApoEi)小鼠為實驗對象，通過高脂飼料飲食誘導獲得動脈粥樣硬化小鼠模型(AS)，對主動脈竇斑塊的穩(wěn)定性進行研究。結果表明Osmr基因敲除顯著減少主動脈竇斑塊內巨噬細胞的含量和壞死中心的面積，增加斑塊內平滑肌細胞的含量和膠原成分含量，增強了主動脈竇斑塊的穩(wěn)定性(圖3)。
[0012]3.0smr基因敲除顯著減輕了炎癥反應
本發(fā)明以ApoE基因敲除(ApoE+)小鼠與Osmr/ApoE雙基因敲除(Osmr+ApoEi)小鼠為實驗對象，通過高脂飼料飲食誘導獲得動脈粥樣硬化小鼠模型(AS)，對主動脈竇斑塊的炎癥因子的表達進行研究。結果表明Osmr基因敲除顯著降低了主動脈竇斑塊的ICAM-1和IL-6等促炎因子，升高了 IL-10等抑炎因子的表達水平(圖4)。
[0013]由以上結果可知發(fā)生動脈粥樣硬化時，Osmr基因缺陷減少了斑塊面積，增強主動脈竇斑塊的穩(wěn)定性，顯著減輕了炎癥反應。因此Osmr具有促進動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的作用，為研究防治動脈粥樣硬化的新靶點和新策略提供了理論依據(jù)和臨床基礎。
[0014]因此，Osmr基因可作為藥物靶點，構建Osmr基因過表達的體外細胞模型或動物模型，用于篩選預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物；Osmr基因也可作為基因治療中的靶基因，設計并制備預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物和/或生物學試劑，通過基因工程技術達到預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的目的。例如以Osmr為靶基因，設計可干擾Osmr表達的雙鏈siRNA,通過化學方法合成以后，注射入人體通過RNA干擾的方法使Osmr基因沉默來治療動脈粥樣硬化；還可以設計并構建Osmr的突變體，注射后進入細胞，競爭Osmr原形的作用底物，從而抑制Osmr的功能，起到治療目的；此外，還可以以Osmr為靶點設計小分子化合物抑制劑，利用Osmr基因過表達的體外細胞模型或動物模型，通過篩選，發(fā)現(xiàn)其中能夠特異性抑制Osmr的分子，從而為動脈粥樣硬化的治療提供新的治療性分子。
[0015]針對Osmr的上述功能,提供Osmr作為藥物祀標在篩選預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物中的應用。
[0016]針對Osmr的上述功能，提供Osmr的抑制劑在制備預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物中的應用。
[0017]一種預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物，包含Osmr的抑制劑。
[0018]所述的Osmr的抑制劑優(yōu)選為Osmr基因的siRNA、0smr基因的RNA干擾載體,0smr的抗體及其他能夠抑制Osmr表達的抑制劑中的一種。
[0019]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果:
1.本發(fā)明發(fā)現(xiàn)Osmr基因的新功能，即Osmr能夠促進動脈粥樣硬化的作用。
[0020]2.基于Osmr促進動脈粥樣硬化的功能，為研制動脈粥樣硬化的藥物提供靶標。
[0021]3.0smr的抑制劑可用于制備預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是APOE+和Osmr_/_ApoE_/_小鼠的主動脈樹油紅0染色及斑塊面積統(tǒng)計圖，結果表明Osmr基因敲除顯著減少了主動脈樹的斑塊面積(NS:無顯著性差異)。
[0023]圖2是ApoE—7—和Osmr+ApoE-A小鼠主動脈竇及頭臂干HE染色及斑塊面積統(tǒng)計柱狀圖，結果表明Osmr基因敲除顯著減少了主動脈竇以及頭臂干的斑塊面積(*:p<0.05 vsHFD ApoE+組)。
[0024]圖3是APOE+和Osmr_/_ApoE_/_小鼠的主動脈竇斑塊內壞死中心、膠原成分、巨噬細胞及平滑肌細胞含量染色及結果統(tǒng)計柱狀圖，結果表明Osmr基因敲除顯著減少主動脈竇斑塊內巨噬細胞的含量和壞死中心的面積，增加斑塊內平滑肌細胞的含量和膠原成分含量(*:p < 0.05 vs HFD ApoE+ 組)。
[0025]圖4是ApoE+和Osmr+ApoE+小鼠的主動脈竇斑塊內ICAM-1、IL-6、IL-10等炎癥因子的表達水平免疫熒光染色及結果統(tǒng)計柱狀圖，結果表明Osmr基因敲除顯著降低了主動脈竇斑塊的促炎因子ICAM-1和IL-6的表達水平，升高了抗炎因子IL-10的表達水平(*:p < 0.05 vs HFD ApoE+ 組)。

【具體實施方式】
[0026]下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0027]實驗用動物及飼養(yǎng)
實驗動物種屬，性別，周齡及來源:ApoE基因敲除(APOE+)小鼠與Osmr/ApoE雙基因敲除(0smr+ApoE+)小鼠，雄性，8周齡，體重19_25g。ApoE基因敲除小鼠(ΑροΕ+,購自Jackson Laboratory,貨號002052) ；0smr 7 ApoE 7小鼠由Osmr基因敲除小鼠(購自日本RIKEN公司，貨號:RBRC02711)和ApoE基因敲除小鼠雜交得到。
[0028]實驗動物飼料配方:高脂飼料(HFD，購自北京華阜康生物科技有限公司，按AIN-76 A Western Diets配方，熱量百分比:蛋白質15.8%，脂肪40%，碳水化合物44.2%);低脂飼料(NC，購自北京華阜康生物科技有限公司，貨號D12450B):熱量百分比:蛋白質20%，碳水化合物70%，脂肪10%。
[0029]動物飼養(yǎng)及環(huán)境條件:所有的實驗小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學心血管病研究所SPF級動物房(許可證號:SYXK (鄂):2009-0053)。每12小時交替照明，溫度24±2°C，濕度40%-70%，小鼠自由飲水進食。
[0030]實施例1小鼠動脈粥樣硬化模型(AS)獲得
1.實驗動物分組:選用8周齡，體重19-25g，雄性，ApoE*小鼠和Osmr +APOE-A小鼠，分別給予高脂飼料(Western Diets, HFD)和低脂飼料(Normal chow, NC)飼養(yǎng),ApoE+ HFD組，APOE+ NC 組，Osmr +ΑΡ0Ε+ HFD 組，Osmr ^ApoE^ NC 組共 4 個組別，每組各 20 只。
[0031]2.動脈粥樣硬化模型通過高脂飼料誘導操作流程:
采用ApoE+小鼠和Osmr +ApoE+小鼠，建立AS模型,進行表型相關分析，明確Osmr基因對動脈粥樣硬化疾病發(fā)揮的作用。小鼠從8周齡開始，HFD組全程高脂飼料喂養(yǎng)28周處死并收集樣本，NC組全程低脂飼料喂養(yǎng)28周處死并收集樣本。
[0032]實施例2 AS模型小鼠斑塊面積測定 1.小鼠終末組織取材
小鼠喂養(yǎng)高脂或低脂飼料直至28周時，稱重，用3%戊巴比妥鈉，90mg/kg麻醉小鼠，用針頭固定于取材板，用紗布濕潤小鼠胸腹部皮膚，用眼科剪剪開胸腔，暴露心臟，剪開右心耳，把輸液器的針頭刺進左心室，用50mL注射器緩慢推注10-15mL PBS緩沖液，待右心耳流出液清亮，換上4%多聚甲醛繼續(xù)推注10-15mL。灌流結束后，清除胸腹腔臟器，僅保留心臟。將小鼠置于顯微鏡下，分離主動脈弓周圍筋膜、脂肪組織，剪下頭臂干，放入裝有4%多聚甲醛的5mL EP管中，在升主動脈起始部剪下心臟，在胸主動脈中部剪斷，并在頸總和鎖骨下約3mm處剪斷，把主動脈弓放入上述EP管中。
[0033]2.主動脈樹斑塊面積測定
主動脈樹置于4%多聚甲醛中隔夜固定一純水漂洗30min — 60%異丙醇處理10 min —油紅0染液(公司sigma，貨號00625)染色60min — 60%異丙醇漂洗lminX3次至背景干凈一解剖鏡下去除殘余外壁脂肪一將染色好的動脈平鋪于黑色解剖蠟板上，染色后用數(shù)碼相機拍照，并使用Image-Pro Plus 0圖像分析軟件進行斑塊面積定量測定(油紅0原液=0.5克油紅0+100毫升100%異丙醇，油紅0染液(工作液):V (油紅0原液)/ V (H20)=3/2)。
[0034]主動脈樹斑塊面積(％)=斑塊總面積/主動脈樹總面積*100%。
[0035]3.病理組織處理
3.1石蠟標本制備
4%多聚甲醛中隔夜固定后，將頭臂干、主動脈弓用濾紙小心包好，以防從包埋框間隙中漏出。流水沖洗30min后放入脫水機,30%乙醇15min — 50%乙醇15min — 75%乙醇15min — 85% 乙醇 15min — 95% 乙醇 15min — 100% 乙醇 15min — 100% 乙醇 15min —二甲苯15min — 二甲苯15min —石臘30min —石臘30min。頭臂干及主動脈弓脫水完成后，從脫水機拿出。頭臂干呈Y直立于石蠟中，主動脈弓平躺于石蠟中。
[0036]3.2主動脈組織切片
使用切片機分別對主動脈竇和頭臂干石蠟標本切片(切片厚度5 μ m)。
[0037]4.主動脈竇斑塊面積測定
蘇木素伊紅染色(HE染色):取主動脈竇石蠟白片65°C烘烤30分鐘一二甲苯5分鐘X3次一100%乙醇1分鐘一95%乙醇1分鐘一70%乙醇1分鐘一純水漂洗(以玻片上不掛有水珠為標準)一甩盡載玻片上的水分，蘇木素溶液(珠海貝索，BA-4021)浸染5分鐘一自來水漂洗(去除玻片上蘇木素的浮色)一1%鹽酸乙醇1-3秒一自來水漂洗(去除玻片上鹽酸乙醇)一Scott液(碳酸氫鈉0.35g,硫酸鎂2g,蒸懼水100mL) 1分鐘一自來水浸洗(去除玻片上的Scott液)一甩盡在玻片上的水分，伊紅溶液(珠海貝索，BA-4024)染色10秒鐘一純水漂洗(去除玻片上伊紅的浮色)一70%乙醇一下一95%乙醇一下一100%乙醇30秒，3次一二甲苯2分鐘，3次一趁二甲苯未干時封片(以切片無氣泡為原則)一通風櫥內吹干，顯微鏡拍照。
[0038]5.頭臂干斑塊面積測定蘇木素伊紅染色(HE染色)，取頭臂干石蠟白片，具體操作方法同實施例2.4。
[0039]HE染色圖片統(tǒng)計:直接用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件圈主動脈竇和頭臂干斑塊面積。
[0040]通過主動脈樹油紅0染色可大體評估整條血管上動脈粥樣硬化斑塊形成的多少、分布情況及斑塊面積的大小。圖1是小鼠AS模型后主動脈樹油紅0染色結果圖，頭臂干和主動脈竇是動脈粥樣硬化斑塊最明顯的部位，APOE+和0smr_/_ApOE_/_小鼠通過低脂飼料飲食，主動脈樹就有少量斑塊形成，且0smr+ApoE+小鼠的斑塊面積和ApoE+小鼠無明顯差異；通過高脂飲食后，斑塊含量顯著增加，Osmr/ApoE-7-小鼠的主動脈樹斑塊面積顯著小于ApoE-7-小鼠。圖2是小鼠AS模型后主動脈竇和頭臂干HE染色結果圖，結果表明經高脂飲食后0smr_/_ApOE_/_小鼠的主動脈竇和頭臂干的斑塊面積顯著小于Αρ0Ε+小鼠。以上結果表明Osmr基因敲除顯著降低了動脈粥樣硬化的斑塊面積。
[0041]實施例3 AS模型小鼠斑塊穩(wěn)定性的測定 1.主動脈竇壞死中心的面積大小測定。
[0042]蘇木素伊紅染色(HE染色)，方法同實施例2.4，選取含膽固醇結晶、無細胞核纖維結構的組織顯微鏡拍照。
[0043]壞死中心的面積測定:使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件圈壞死中心面積。
[0044]2.主動脈竇膠原成分含量測定:
天狼星紅(PSR)染色，主要步驟為:取主動脈竇石蠟白片55°C烘烤30min—二甲苯2min, 3次一100%酒精lmin — 95%酒精lmin — 70%酒精lmin —流水沖洗lOmin —雙蒸水lmin —質量分數(shù)0.2%磷鑰酸2min — 0.1%天狼猩紅苦味酸溶液滴于組織上，濕盒中染色90min —去除殘液一0.01N鹽酸4s — 70%酒精1次一90%酒精1次一100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲苯未干立即蓋玻片封片，顯微鏡拍照。
[0045]膠原比例測定:使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件圈紅色膠原面積,膠原比例(％)=膠原面積/斑塊面積*100%。
[0046]3.主動脈竇巨噬細胞及平滑肌細胞標志物的表達測定
免疫熒光染色檢測主動脈竇巨噬細胞標志物⑶68、平滑肌細胞標志物SMA (SmoothMuscle Actin)的表達。所需一抗信息:CD68 (MCA1957; 1:100; rat; AbD Serotec),SMA(ab5694; 1:100; rabbit; Abeam);所需二抗信息:Alexa Flour? 568 goat ant1-rat IgG(A11077 ；Invitrogen), Alexa Fluor 488-conjugated goat ant1-rabbit IgG (A11008 ；Invitrogen)。
[0047]主要步驟為:
1)烤片:將主動脈竇石蠟白片置于烤箱中30min以上。
[0048]2)脫蠟:二甲苯 5minX3 次。
[0049]3)水合:100% 乙醇 5minX2 次；95% 乙醇 5min ；70% 乙醇 5min ;ddH20浸洗 5minX2次。
[0050]4)檸檬酸鹽組織抗原修復(高壓修復):取一定量的pH6.0檸檬酸鹽抗原修復工作液于修復盒中，放入高壓鍋中，大火加熱至沸騰，將脫蠟水合后的組織切片置于修復盒中，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續(xù)加熱至噴氣，開始計時5min后，取出修復盒；室溫放置20min，自然冷卻后取出切片。
[0051]5) ddH20 漂洗 5minX2 次，PBS 漂洗 5minX2 次。
[0052]6)組化筆劃圈，滴加10%羊血清(GTX27481，GeneTex)封閉，于濕盒中37°C封閉60mino
[0053]7)棄封閉液,滴加適當比例稀釋的一抗，4°C孵育過夜,37°C復溫30min,棄去一抗，PBS 洗 10minX3 次。
[0054]8)滴加二抗，于濕盒中37°C孵育60min，棄去二抗，PBS浸洗5minX3次。
[0055]9) SlowFade Gold antifade reagent with DAP I (S36939, Invitrogen)封片。
[0056]10)熒光鏡下觀察，拍照。
[0057]突光定量統(tǒng)計:使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對陽性細胞計數(shù)測定，CD68/SMA (%)=陽性細胞數(shù)/斑塊面積*100%。
[0058]巨噬細胞是斑塊內最重要的細胞成分，它主要有血液循環(huán)單核細胞進入內皮下后分化而來，單核/巨噬細胞可分泌多種粘附、趨化因子如細胞黏附分子(ICAM-1)、單核細胞趨化和激活因子(MCP-1)等，增進斑塊內細胞的進入，此外巨噬細胞還可分泌多種基質金屬蛋白酶(MMPs)，降低斑塊內膠原面積，從而破壞斑塊的穩(wěn)定性；平滑肌細胞可分泌多種細胞基質，是動脈粥樣硬化斑塊內分泌膠原的細胞源，主要作用是修復被破壞的細胞基質成分從而起到保護作用；膠原成分是斑塊內最重要的細胞外基質，也是纖維帽的主要成分，具有抗血流沖擊防止斑塊破裂的作用，也是維護斑塊穩(wěn)定性的重要評估指標。
[0059]圖3是ApoE+小鼠和Osmr +ApoE+小鼠的主動脈竇斑塊內含物的分析結果圖。主動脈竇HE染色可見Osmr+ApoEi小鼠的壞死中心面積明顯小于ΑροΕ—7—小鼠；PSR染色結果表明高脂飲食后的模型，Osmr/ApoE-7-組小鼠的膠原比例明顯高于Αρ0Ε+小鼠；免疫熒光發(fā)觀察巨噬細胞標志物⑶68在Osmr+ApoEi小鼠斑塊內的表達量則顯著低于ApoE^小鼠；平滑肌細胞標志物SMA在Osmr+ApoEi小鼠斑塊內的表達量明顯高于ApoE^小鼠。以上結果表明Osmr基因敲除顯著減少主動脈竇斑塊內巨噬細胞的含量和壞死中心的面積，增加斑塊內平滑肌細胞的含量和膠原成分含量；0smr基因敲除可以增強主動脈竇斑塊的穩(wěn)定性(圖3)。
[0060]實施例4 AS模型小鼠斑塊內炎癥因子表達的測定
免疫熒光染色檢測主動脈竇ICAM-1、IL-6、IL-10等炎癥因子的表達。所需一抗信息:ICAM-1CAF796 ； 1:100 ；goat ；R&D systems)、IL-6(AF-406_NA ； 1:100 ；goat ；R&D systems)、IL-10 (AF-217-NA ； 1:100 ；goat ；R&D systems);所需二抗信息:Alexa Flour? 568 donkeyant1-goat IgG (A11057 ;Invitrogen)。
[0061]主要步驟為:參見實施例3.3。
[0062]熒光定量統(tǒng)計:使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對陽性細胞進行吸光度(10D)測定。
[0063]炎癥反應是導致動脈粥樣硬化斑塊破裂的主要因素之一。炎性細胞分泌大量細胞因子如白細胞介素6 (IL-6)，白細胞介素10 (IL-10)等可導致內皮細胞的活化、平滑肌細胞的增生凋亡及粥樣病變的進展。受損的內皮細胞和單核/巨噬細胞分泌的粘附、趨化因子是介導炎癥細胞向動脈粥樣硬化斑塊聚集的關鍵因子。通過免疫熒光染色觀察ICAM-1、IL-6、IL-10等炎癥因子的表達變化，結果表明Osmr基因敲除顯著降低了主動脈竇斑塊內促炎因子ICAM-1、IL-6的表達水平，升高了 IL-10抑炎癥因子的表達水平(圖4)。
[0064]上述實施例結果顯示，APOE+小鼠及小鼠在高脂飲食的誘導下發(fā)生動脈粥樣硬化，和Αρ0Ε+小鼠相比，Osmr/ApoE雙基因敲除后小鼠的主動脈斑塊面積顯著減少，斑塊穩(wěn)定性也增加，炎癥反應明顯減輕。這些結果表明，Osmr可顯著促進主動脈斑塊的形成和動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。本發(fā)明證明了 Osmr在動脈粥樣硬化模型中有著重要的惡化作用，其抑制劑可用于制備治療動脈粥樣硬化疾病的藥物。
[0065]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.0smr作為藥物靶標在篩選預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物中的應用。
2.0smr的抑制劑在制備預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物中的應用。
3.一種預防、緩解和/或治療動脈粥樣硬化的藥物，其特征在于:包含Osmr的抑制劑。
4.根據(jù)權利要求2所述的應用或權利要求3所述的藥物，其特征在于:所述的Osmr的抑制劑為Osmr基因的siRNA、0smr基因的RNA干擾載體或Osmr的抗體及其他能夠抑制Osmr表達的抑制劑中的一種。
【文檔編號】A61K45/00GK104258396SQ201410514034
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月29日 優(yōu)先權日:2014年9月29日
【發(fā)明者】李紅良, 郭森, 黃玲, 向梅, 張鵬 申請人:武漢大學