黃連水提物及其單體在制備抑制豬鏈球菌或干預(yù)豬鏈球菌生物被膜藥物中的用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了黃連水提物及其單體在制備抑制豬鏈球菌或干預(yù)豬鏈球菌生物被膜藥物中的用途，屬于黃連水提物及其單體的新醫(yī)藥用途領(lǐng)域。本發(fā)明采用豬鏈球菌BF體外模型研究黃連水提物及其單體對(duì)豬鏈球菌生物被膜的體外干預(yù)作用。通過結(jié)晶紫法及掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)黃連水提物及其單體對(duì)豬鏈球菌生物被膜的形成有顯著抑制作用。熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃連水提物及其單體使生物被膜信號(hào)分子的mRNA表達(dá)量顯著下降，顯著降低豬鏈球菌生物被膜中毒力基因mRNA表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃連水提物或者黃連單體化合物對(duì)于抑制豬鏈球菌或干預(yù)豬鏈球菌生物被膜有確切的功效，能應(yīng)用于制備抑制豬鏈球菌或干預(yù)消除豬鏈球菌生物被膜的形成的藥物。
【專利說明】黃連水提物及其單體在制備抑制豬鏈球菌或干預(yù)豬鏈球菌 生物被膜藥物中的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及黃連水提物及其單體的新醫(yī)藥用途，尤其涉及黃連水提物及其單體化 合物在制備抑制豬鏈球菌或干預(yù)豬鏈球菌生物被膜藥物中的用途，屬于黃連水提物及其單 體的新醫(yī)藥用途領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬鏈球菌是引起豬包括腦膜炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎等威脅生命疾病 的重要病原。根據(jù)多糖莢膜成分的不同，豬鏈球菌分為35個(gè)血清型（1-34,1/2)，其中豬鏈 球菌2型是最常見、毒力最強(qiáng)的血清型菌株。目前國內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為，豬鏈球菌在動(dòng)物體內(nèi)外 可以形成生物被膜（biofilm，BF)，BF作為細(xì)菌的一種重要生存方式，受多種因素的影響和 調(diào)節(jié)。其中，密度感應(yīng)（quorum sensing, QS)現(xiàn)象就是近年來發(fā)現(xiàn)的對(duì)BF產(chǎn)生重要作用 的影響因素之一。QS即細(xì)菌通過自身產(chǎn)生的信號(hào)分子進(jìn)行交流和協(xié)調(diào)群體行為的過程，與 QS現(xiàn)象有關(guān)的種間QS信號(hào)系統(tǒng)是由IuxS基因編碼的AI-2信號(hào)分子介導(dǎo)完成的。IuxS/ AI-2不僅影響豬鏈球菌BF的形成，而且影響細(xì)菌毒力因子的表達(dá)，通過干預(yù)豬鏈球菌的QS 系統(tǒng)，有可能成為未來研發(fā)抗微生物藥物的策略之一。
[0003] 黃連，屬毛茛科、黃連屬多年生草本植物，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗腹瀉、降血 糖、降血脂、抗氧化等作用。迄今，尚無關(guān)于黃連水提物及其單體抑制豬鏈球菌或干預(yù)豬鏈 球菌生物被膜的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供黃連水提物及其單體化合物在制備抑制豬鏈 球菌或干預(yù)豬鏈球菌生物被膜藥物中的新用途，黃連水提物及其單體化合物通過作用于QS 系統(tǒng)，有效抑制豬鏈球菌或干預(yù)豬鏈球菌生物被膜的形成。
[0005] 本發(fā)明所要解決的上述技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0006] 本發(fā)明通過建立豬鏈球菌BF體外模型，研究黃連水提物及其單體化合物對(duì)豬鏈 球菌生物被膜的體外干預(yù)作用。
[0007] 通過結(jié)晶紫法研究黃連水提物、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀及鹽酸藥根堿對(duì)豬鏈 球菌生物被膜形成的影響，結(jié)果表明，豬鏈球菌經(jīng)31. 25 y g ? ml/1鹽酸小檗堿作用3d后 測得的OD值（0. 538±0. 027)與陰性對(duì)照組（0. 825±0. 087)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P〈〇. 01)，提示該濃度的鹽酸小檗堿對(duì)豬鏈球菌生物被膜形成有顯著抑制作用。豬鏈球 菌經(jīng)50 ii g ? ml/1黃連水提物、62. 5 ii g ? ml/1鹽酸巴馬汀作用3d后測得的OD值分別為 0. 589±0. 042、0. 597±0. 043與陰性對(duì)照組相比差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈0. 05)。
[0008] 通過豬鏈球菌生物被膜內(nèi)的活菌計(jì)數(shù)分析黃連水提物、鹽酸小檗堿、鹽酸巴 馬汀及鹽酸藥根堿對(duì)豬鏈球菌生物被膜內(nèi)細(xì)菌的影響，結(jié)果顯示31. 25 ii g ? ml/1鹽酸 小檗堿、62. 5 y g ? ml/1鹽酸巴馬汀對(duì)生物被膜內(nèi)細(xì)菌具有清除作用，菌落計(jì)數(shù)分別為 6. 71±0. llcfu/mL、7. 28±0. 20cfu/mL，與陰性對(duì)照組菌落數(shù) 9. 16±0. 90cfu/mL 相比，生 物被膜內(nèi)存活細(xì)菌數(shù)明顯減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈〇. 05)。黃連水提物及鹽酸藥根堿對(duì)生物 被膜內(nèi)細(xì)菌也具有清除作用，菌落計(jì)數(shù)分別為7. 87±0. 58cfu/mL、8. 09±0. 23cfu/mL，比較 差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>〇. 05)。
[0009] 掃描電鏡觀察顯示，50 ii g ? ml/1黃連水提物、31. 25 ii g ? ml/1鹽酸小檗堿、 62. 5 ii g ? ml/1鹽酸巴馬汀和125 ii g ? ml/1鹽酸藥根堿實(shí)驗(yàn)組豬鏈球菌生物被膜形態(tài)結(jié)構(gòu) 發(fā)生明顯變化，僅有少許散在細(xì)菌。說明黃連水提物、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸藥根 堿處理后生物被膜的結(jié)構(gòu)遭到明顯的破壞。
[0010] 本發(fā)明以16s RNA為內(nèi)參基因，用熒光實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)IuxS因子和7個(gè)毒力基因 的表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，黃連水提物組、鹽酸小檗堿組、鹽酸巴馬汀 組和鹽酸藥根堿組IuxS表達(dá)量差異顯著（P〈0. 05)，mRNA表達(dá)量顯著下降。cps、gdh毒力 基因mRNA表達(dá)量顯著上升；與對(duì)照組相比，黃連水提物組、鹽酸小檗堿組、鹽酸巴馬汀組與 鹽酸藥根堿組表達(dá)量差異顯著（P〈〇. 05)。ftps毒力基因mRNA表達(dá)量顯著下降，與對(duì)照組 相比，黃連水提物組與鹽酸巴馬汀組fbps表達(dá)量差異顯著（P〈0. 05)。mrp毒力基因mRNA 表達(dá)量顯著上升；與對(duì)照組相比，黃連水提物組、鹽酸小檗堿組和鹽酸藥根堿組mrp表達(dá)量 差異顯著（P〈〇. 05)。ef毒力基因mRNA表達(dá)量顯著下降；與對(duì)照組相比，鹽酸小檗堿組、鹽 酸巴馬汀組與鹽酸藥根堿組ef表達(dá)量差異顯著（P〈〇. 05)。sly毒力基因mRNA表達(dá)量顯著 下降；與對(duì)照組相比，黃連水提物組與鹽酸小檗堿組sly表達(dá)量差異顯著（P〈0. 05)。gapdh 毒力基因mRNA表達(dá)量顯著下降；與對(duì)照組相比，黃連水提物組、鹽酸小檗堿組、鹽酸巴馬汀 組與鹽酸藥根堿組gapdh表達(dá)量差異顯著（P〈0. 05)。
[0011] 綜上所述，黃連水提物及其單體有望成為QS信號(hào)系統(tǒng)抑制劑，通過影響QS系統(tǒng)干 預(yù)或者消除生物被膜的形成。
[0012] 因此，黃連水提物或者黃連單體可以用于制備抑制豬鏈球菌的藥物。
[0013] 本發(fā)明公開了一種抑制豬鏈球菌的藥物組合物，包括：有效量的黃連水提物或者 黃連單體化合物和藥學(xué)上可接受的輔料或載體。
[0014] 本發(fā)明還公開了一種干預(yù)豬鏈球菌生物被膜形成的藥物組合物，包括：有效量的 黃連水提物或者黃連單體化合物和藥學(xué)上可接受的輔料或載體。
[0015] 本發(fā)明進(jìn)一步公開了一種干預(yù)豬鏈球菌生物被膜中毒力基因或生物被膜信號(hào)分 子基因表達(dá)的藥物組合物，包括：有效量的黃連水提物或者黃連單體化合物和藥學(xué)上可接 受的輔料或載體。
[0016] 以上所述的黃連單體化合物為鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀或鹽酸藥根堿中的一種或 多種；優(yōu)選為鹽酸小檗堿或鹽酸巴馬汀中的任意一種。
[0017] 本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果：
[0018] 本發(fā)明中黃連水提物或其單體化合物對(duì)豬鏈球菌生物被膜的形成有顯著抑制作 用，使生物被膜信號(hào)分子LuxS/AI-2的mRNA表達(dá)量顯著下降，顯著降低豬鏈球菌生物被膜 中fbp S、ef、Sly和gapdh毒力基因mRNA表達(dá)量，能夠有效干預(yù)或消除豬鏈球菌生物被膜的 形成。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1為1/2MIC黃連水提物及單體化合物對(duì)豬鏈球菌生物被膜形成的影響 (n=5， X士SD);
[0020] 圖2為1/2MIC黃連水提物及單體化合物對(duì)豬鏈球菌生物被膜內(nèi)細(xì)菌的影響 (n=5， S士SD);
[0021] 圖3為掃描電鏡下1/2MIC黃連水提物及單體化合物對(duì)豬鏈球菌生物被膜形態(tài)學(xué) 影響；其中，A為陰性對(duì)照；B為黃連水提物；C為鹽酸小檗堿；D為鹽酸巴馬??；E為鹽酸藥 根堿；F為阿奇霉素；
[0022] 圖4為黃連水提物及單體化合物對(duì)豬鏈球菌生物被膜IuxS基因的影響 (11=5， X士SD);
[0023] 圖5為黃連水提物及其單體化合物對(duì)豬鏈球菌生物被膜毒力基因cps的影響 (n=5， X士 SD);
[0024] 圖6為黃連水提物及其單體化合物對(duì)豬鏈球菌生物被膜毒力基因gdh的影響 (11=5， X士SD);
[0025] 圖7為黃連水提物及其單體化合物對(duì)豬鏈球菌生物被膜毒力基因fbps的影響 Cn= 5, X士SD);
[0026] 圖8為黃連水提物及其單體化合物對(duì)豬鏈球菌生物被膜毒力基因mrp的影響 (n=5, x±SD);
[0027] 圖9為黃連水提物及其單體化合物對(duì)豬鏈球菌生物被膜毒力基因ef的影響 (n=5， X士SD);
[0028] 圖10為黃連水提物及其單體化合物對(duì)豬鏈球菌生物被膜毒力基因sly的影響 (n=5， X士SD);
[0029] 圖11為黃連水提物及其單體化合物對(duì)豬鏈球菌生物被膜毒力基因gapdh的影響 (n=5， X士SD)。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié) 和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0031] 1、材料
[0032] I. 1實(shí)驗(yàn)菌株
[0033] 2型豬鏈球菌分離株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。
[0034] 1. 2藥物及材料
[0035] 1. 2. 1 藥物
[0036] 鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品（上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號(hào)130329);
[0037] 鹽酸巴馬汀標(biāo)準(zhǔn)品（上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號(hào)130120);
[0038] 鹽酸藥根堿標(biāo)準(zhǔn)品（上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號(hào)130506);
[0039] 阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品（石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)100110101);
[0040] 黃連為生藥，購自北京同仁堂大藥房。
[0041] 1.2. 2培養(yǎng)基及試劑
[0042] 胰蛋白胨、葡萄糖、牛肉粉、酵母粉、無水碳酸鈉、氯化鈉、戊二醛（Sigma公司分析 純）；DMS0、無水乙醇和氯化鈉為國產(chǎn)分析純、腦心浸液肉湯培養(yǎng)基、生理鹽水、THB培養(yǎng)基、 LB肉湯、PH7. 4磷酸鹽緩沖溶液（PBS)為本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室配制。
[0043] 實(shí)施例1黃連水提物及其單體化合物對(duì)豬鏈球菌生物被膜的體外干預(yù)作用
[0044] 1、實(shí)驗(yàn)方法
[0045] I. 1黃連水提物的制備
[0046] 取50g黃連粉末，用500mL蒸餾水在100°C下煎煮lh，過濾，收集濾液，濾渣第2次 和第3次均加300mL水，煮沸l(wèi)h，合并濾液，濃縮至0. 25g/mL，保存在4°C下備用，用時(shí)按需 要稀釋。
[0047] 1. 2 豬鏈球菌最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration, MIC)的確定
[0048] 采用微量稀釋法測定黃連水提物及單體化合物對(duì)豬鏈球菌的MIC。取單個(gè)S. suis 菌落接種于THB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)12h?16h。利用麥?zhǔn)媳葷醿x將菌液濃度先調(diào)整為 0.5麥?zhǔn)希↙OXlO 8Cfu .mL-1)，再用THB培養(yǎng)基稀釋為約I. OX Kfcfu.mL-1，備用。依次向 無菌96孔細(xì)胞培養(yǎng)板加入THB培養(yǎng)基，除第1孔加入160 ii L THB培養(yǎng)基外，其余每管加 入100 ii L THB，在第1孔加入藥物40 ii L混勻，然后吸取100 ii L至第2孔，混勻后再吸取 100 UL至第3孔，如此連續(xù)倍比稀釋至第11孔，并從第11孔中吸取100 UL棄去，第12孔 為不含藥物的生長對(duì)照。然后在每孔內(nèi)加入上述制備好的細(xì)菌菌液各IOOu L。混勻后蓋 好，于37°C孵育24h。肉眼觀察無細(xì)菌生長的藥物最低濃度孔為各藥物對(duì)S. suis的MIC。
[0049] 1. 3豬鏈球菌BF體外模型的建立
[0050] 取S. suis單個(gè)菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37°C，180rpm過夜培養(yǎng)。用比濁儀調(diào) 至0. 5麥?zhǔn)蠁挝?，稀?00倍。吸取菌液200 ii L加入卡爾加里生物被膜裝置，37°C培養(yǎng)，連 續(xù)培養(yǎng)3天后，即可形成穩(wěn)定的BF。用消毒的鑷子小心將其取下，可用掃描電鏡檢測生物被 膜形態(tài)結(jié)構(gòu)。
[0051] 1. 4黃連水提物及其單體化合物對(duì)豬鏈球菌生物被膜的體外干預(yù)作用
[0052] 在卡爾加里生物被膜裝置中每孔加入IOOy L含MIC藥物的THB培養(yǎng)基，再加入 100 U L濃度調(diào)至約I. OX 106Cfu/mL的菌液；陰性對(duì)照組加200 ii L菌液，空白對(duì)照組加 200 L THB培養(yǎng)基，每組重復(fù)5孔，37°C下培養(yǎng)3d后，用滅菌生理鹽水沖洗3次，自然干燥 后用甲醇固定生物被膜30min，棄去固定液待自然干燥后，室溫下用200 ii L 0. 1 %的結(jié)晶 紫對(duì)生物被膜染色30min，棄去染色液，自來水沖洗直至無色、晾干；此時(shí)，若孔的兩邊看到 紫色的環(huán)形成即可判斷形成了生物被膜，每孔加入200 y L濃度為33%的冰醋酸溶液，置于 搖床振搖30min以釋放生物被膜中的結(jié)晶紫，測定其在595nm波長處的吸光度。
[0053] 1. 5豬鏈球菌生物被膜內(nèi)的活菌計(jì)數(shù)
[0054]各組處理方法同1. 4,每組重復(fù)5孔，37°C下培養(yǎng)3d。將形成生物被膜的卡爾加 里生物被膜裝置密封后放入超聲波清洗器中，在35°C、功率為105W條件下進(jìn)行超聲波處理 IOmin使膜內(nèi)菌釋放，所得的生物被膜菌液以生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋后，在營養(yǎng)瓊脂平板上 37°C培養(yǎng)24h后計(jì)數(shù)，每次測定均重復(fù)測3次計(jì)算平均值，結(jié)果以Iog(CfuAiL)表示，觀察 藥物對(duì)生物被膜內(nèi)菌量影響。
[0055] 1. 6豬鏈球菌BF形態(tài)的SEM檢測
[0056] 各組處理方法同1. 4,每組重復(fù)5孔，37°C下培養(yǎng)3d。
[0057] (1)打開卡爾加里生物被膜裝置，將樁釘經(jīng)無菌操作取下后，滅菌PBS溶液多次充 分漂洗；
[0058] (2)2. 5 %戊二醛PBS溶液固定過夜后，用滅菌PBS溶液沖洗數(shù)遍；
[0059] (3) 50 %、70 %、90 %系列濃度乙醇脫水各lOmin，100 %乙醇脫水2次，每次 15min ；
[0060] (4)50%、100%叔丁醇置換2次，每次151^11;
[0061] (5)臨界點(diǎn)干燥儀干燥，噴金；
[0062] (6)掃描電鏡觀察。
[0063] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0064] 2. 1黃連水提物及其單體化合物對(duì)豬鏈球菌的MIC
[0065] 通過微量稀釋法分別測定了黃連水提物、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿和 阿奇霉素對(duì)豬鏈球菌的MIC。結(jié)果見表1。
[0066] 表1黃連水提物及單體化合物對(duì)豬鏈球菌的MIC
[0067]

【權(quán)利要求】
1. 黃連水提物或者黃連單體化合物在制備抑制豬鏈球菌的藥物中的用途。
2. 黃連水提物或者黃連單體化合物在制備干預(yù)豬鏈球菌生物被膜形成的藥物中的用 途。
3. 黃連水提物或者黃連單體化合物在制備干預(yù)豬鏈球菌生物被膜中毒力基因或信號(hào) 分子基因表達(dá)的藥物中的用途。
4. 按照權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于：所述毒力基因?yàn)間dh、mrp、gapdh、sly、 fbps、ef或cps中的一個(gè)或多個(gè)；所述信號(hào)分子基因?yàn)閘uxS。
5. 按照權(quán)利要求1至3任何一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述黃連水提物的制備包 括：將黃連粉末加水煎煮，過濾，收集濾液；濾渣再加水進(jìn)行煎煮，過濾，收集濾液；合并濾 液，濃縮，即得；其中，優(yōu)選的，黃連粉末與水按照質(zhì)量g/體積mL為1 :10 ;所述煎煮的溫度 優(yōu)選為KKTC，煎煮的時(shí)間優(yōu)選為lh。
6. 按照權(quán)利要求1至3任何一項(xiàng)所述的用途，其特征在于：所述的黃連單體化合物為 鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀或鹽酸藥根堿中的一種或多種；優(yōu)選為鹽酸小檗堿或鹽酸巴馬汀 中的任意一種。
7. -種抑制豬鏈球菌的藥物組合物，其特征在于，包括：有效量的黃連水提物或者黃 連單體化合物和藥學(xué)上可接受的輔料或載體。
8. -種干預(yù)豬鏈球菌生物被膜形成的藥物組合物，其特征在于，包括：有效量的黃連 水提物或者黃連單體化合物和藥學(xué)上可接受的輔料或載體。
9. 一種干預(yù)豬鏈球菌生物被膜中毒力基因或生物被膜信號(hào)分子基因表達(dá)的藥物組合 物，其特征在于，包括：有效量的黃連水提物或者黃連單體化合物和藥學(xué)上可接受的輔料或 載體。
10. 按照權(quán)利要求7至9任何一項(xiàng)所述的藥物組合物，其特征在于：所述的黃連單體化 合物為鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀或鹽酸藥根堿中的一種或多種；優(yōu)選為鹽酸小檗堿或鹽酸 巴馬汀中的任意一種。
【文檔編號(hào)】A61P31/04GK104306477SQ201410494065
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月24日
【發(fā)明者】李艷華, 劉冰, 陳儉清, 閆清波, 韓強(qiáng), 趙玉林, 周永輝, 黃全勇 申請(qǐng)人:李艷華, 劉冰, 陳儉清