干細(xì)胞制劑的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種干細(xì)胞制劑的制備方法。干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)的研究已成為自然科學(xué)中最為引人注目的領(lǐng)域,人類(lèi)寄希望于利用干細(xì)胞的分離和體外培養(yǎng),實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床疾病的治療。一種干細(xì)胞制劑的制備方法,該方法包括如下步驟:(1)從生物活性物質(zhì)組合來(lái)源中提取干細(xì)胞,對(duì)其生物活性物質(zhì)需進(jìn)行分離純化、培養(yǎng)擴(kuò)增;(2)對(duì)從生物活性物質(zhì)組合中提取的干細(xì)胞進(jìn)行剌激分沁、濃縮,提取獲得細(xì)胞外活性物質(zhì)a;(3)收集并純化步驟(2)后,剩下的干細(xì)胞用溫和的物理法細(xì)胞破碎收集細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)b,再將細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)b濃縮;(4)將所述的細(xì)胞外活性物質(zhì)a和所述的細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)b按a:b=1:3.5比例進(jìn)行混合得到干細(xì)胞制劑。本發(fā)明用于干細(xì)胞制劑的制備。
【專利說(shuō)明】干細(xì)胞制劑的制備方法
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】:
本發(fā)明涉及一種干細(xì)胞制劑的制備方法。
[0002]【背景技術(shù)】:
干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)的研究已成為自然科學(xué)中最為引人注目的領(lǐng)域。干細(xì)胞及其分泌的相關(guān)活性因子,其通過(guò)不同的方法應(yīng)用于人體,可用于治療哮喘、過(guò)敏性鼻炎、婦女更年期綜合癥、燒燙傷的修復(fù)、心腦血管疾病、免疫性疾病及抗衰老等,能活化機(jī)體干細(xì)胞,修復(fù)或替代受損、病變和衰老的細(xì)胞,具有調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞代謝功能,增強(qiáng)機(jī)體免疫力,延緩衰老等功效。
[0003]干細(xì)胞理論的日臻完善和技術(shù)的迅猛發(fā)展,必將在疾病治療和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域產(chǎn)生劃時(shí)代的成果,是對(duì)傳統(tǒng)醫(yī)療手段和醫(yī)療觀念的一場(chǎng)重大革命。人類(lèi)寄希望于利用干細(xì)胞的分離和體外培養(yǎng),實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床疾病的治療。但是,對(duì)于干細(xì)胞制劑的制備技術(shù)尤為缺少。
[0004]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明的目的是提供了一種多種動(dòng)物來(lái)源干細(xì)胞活性物質(zhì)制劑的制備方法。
[0005]上述的目的通過(guò)以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種干細(xì)胞制劑的制備方法,該方法包括如下步驟:
(1)從生物活性物質(zhì)組合來(lái)源中提取干細(xì)胞,對(duì)其生物活性物質(zhì)需進(jìn)行分離純化、培養(yǎng)擴(kuò)增;
(2)對(duì)從生物活性物質(zhì)組合中提取的干細(xì)胞進(jìn)行剌激分沁、濃縮,提取獲得細(xì)胞外活性物質(zhì)a ;
(3)收集并純化步驟(2)后,剩下的干細(xì)胞用溫和的物理法細(xì)胞破碎收集細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)b,再將細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)b濃縮;
(4)將所述的細(xì)胞外活性物質(zhì)a和所述的細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)b按a:b=l:3.5比例進(jìn)行混合得到干細(xì)胞制劑。
[0006]所述的干細(xì)胞制劑的制備方法,步驟(I)方法是,所述的生物活性物質(zhì)組合可從胎盤(pán)、臍帶、臍帶血、脂肪組織中分離的胎盤(pán)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞、高濃度血小板血漿PRP、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞中獲得;所述的胎盤(pán)干細(xì)胞分離、制備及培養(yǎng):將胎盤(pán)采集袋經(jīng)75%酒精消毒后放入生物安全柜中,將裝有胎盤(pán)的采集袋無(wú)菌操作打開(kāi),用一把鑷子將胎盤(pán)夾出放入一個(gè)滅菌后的保鮮盒內(nèi),用75%的酒精將胎盤(pán)浸沒(méi),浸泡5min ;浸泡結(jié)束后,用原來(lái)的鑷子將胎盤(pán)中央連接臍帶的部分剪下直徑約8-lOcm含有羊膜和絨毛膜的組織放入新的平皿中,剝離表面的羊膜,用生理鹽水清洗,清洗干凈后,換一把新的鑷子將胎盤(pán)夾入新的培養(yǎng)皿中,將肉眼可見(jiàn)的血管及局部淤血部位剪掉,在置于新的平皿中生理鹽水清洗,洗至最后上清為透明色;剪掉約6-8g左右的胎盤(pán)組織放入潔凈的50ml的潔凈離心管中,用眼科剪將胎盤(pán)剪碎至1-1.5mm3大小的組織塊,按1_1.5g胎盤(pán)組織塊接種I個(gè)T75培養(yǎng)瓶,每瓶補(bǔ)足Ilml培養(yǎng)基;將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),共培養(yǎng)21天,每5天更換一次培養(yǎng)液;30天后,棄上清液,用生理鹽水清洗I次,再用0.05%胰酶消化細(xì)胞3min,終止消化后收集細(xì)胞懸液于50ml離心管中,用1300rpm離心6min,收集細(xì)胞;將細(xì)胞用5ml培養(yǎng)基重懸,取10ul細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù),將細(xì)胞密度調(diào)整至4*104/ml,將細(xì)胞重新接種在T75培養(yǎng)瓶中繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),直至細(xì)胞傳至第3代,即可進(jìn)行干細(xì)胞制劑制備。
[0007]所述的干細(xì)胞制劑的制備方法,所述的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離、制備及培養(yǎng):將臍帶采集瓶經(jīng)75%酒精消毒后放入生物安全柜中,將裝有臍帶的采集瓶無(wú)菌操作打開(kāi),用一把鑷子將臍帶夾出放入一新的培養(yǎng)皿內(nèi),用75%的酒精將臍帶完全浸泡浸泡2min,浸泡結(jié)束后,用原來(lái)的鑷子將臍帶放入一個(gè)新的培養(yǎng)皿中,用生理鹽水清洗。清洗干凈后,換一把新的鑷子,將臍帶放入一個(gè)新的培養(yǎng)皿內(nèi)。將待分離的臍帶結(jié)扎端用眼科剪去掉,在培養(yǎng)皿中倒入生理鹽水,用眼科剪和鑷子將分離的臍帶外的血潰洗凈,用眼科剪將其分成1-1.5cm的小段,用眼科剪和鑷子將臍動(dòng)脈和臍靜脈內(nèi)的血洗凈。將剪好的臍帶小段放入一新的培養(yǎng)皿,換一新的眼科剪和兩把新的鑷子,用眼科剪順著臍靜脈腔剪開(kāi),用兩把鑷子將臍靜脈和臍動(dòng)脈剝除,剝?nèi)∪A通氏膠,將剝好的華通氏膠放入一個(gè)盛有生理鹽水的新培養(yǎng)皿內(nèi)涮洗,將洗好的華通氏膠裝入一個(gè)新的離心管內(nèi),用一新的眼科剪將華通氏膠剪成1-4_3大小的組織塊,按0.5g華通氏膠加Iml培養(yǎng)液的比例混合,每0.5g華通氏膠接種I個(gè)T75瓶,每瓶再加入9ml培養(yǎng)液,將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),共培養(yǎng)14天,每5天更換一次培養(yǎng)液。14天后,棄上清液,用生理鹽水清洗I次,再用0.05%胰酶消化細(xì)胞3min,終止消化后收集細(xì)胞懸液于50ml離心管中,用1300rpm離心6min,收集細(xì)胞,將細(xì)胞用5ml培養(yǎng)基重懸,取10ul細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù),將細(xì)胞密度調(diào)整至4*104/ml,將細(xì)胞重新接種在T75培養(yǎng)瓶中繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),直至細(xì)胞傳至第3代,即可進(jìn)行干細(xì)胞制劑制備。
[0008]所述的干細(xì)胞制劑的制備方法,所述的臍帶血干細(xì)胞分離、制備及培養(yǎng):用臍血采集袋采集臍血約10ml其中包括20ml的抗凝劑,用75%的酒精對(duì)臍血采集袋進(jìn)行消毒后將采集袋放入生物安全柜中,將臍血分裝到4個(gè)50ml提前各加入15ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中,2000rpm離心,20min,離心結(jié)束后,輕輕拿出離心管,此時(shí)離心管分為四層,從下向上分別是:紅細(xì)胞層、分離液層、單核細(xì)胞層、血漿層。將單核細(xì)胞層收集到2個(gè)50ml離心管中,然后加滿生理鹽水,1600rpm離心lOmin。棄上清,沉淀細(xì)胞混勻后再加滿生理鹽水,1200rpm離心lOmin,用Iml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,將2個(gè)離心管的細(xì)胞懸液混合到I個(gè)管中,計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度為5*106/ml,將細(xì)胞接種到T75培養(yǎng)瓶中,每瓶接種1ml細(xì)胞懸液,第4天,半量換液,以后每3天換液一次,顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁及生長(zhǎng)情況,待細(xì)胞長(zhǎng)至70%融合度時(shí),傳代,棄上清液,用生理鹽水清洗I次,再用0.05%胰酶消化細(xì)胞3min,終止消化后收集細(xì)胞懸液于50ml離心管中,用1300rpm離心6min,收集細(xì)胞,將細(xì)胞用5ml培養(yǎng)基重懸,取10ul細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù),將細(xì)胞密度調(diào)整至4*104/ml,將細(xì)胞重新接種在T75培養(yǎng)瓶中繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),直至細(xì)胞傳至第3代,即可進(jìn)行干細(xì)胞制劑制備。
[0009]所述的干細(xì)胞制劑的制備方法,步驟(2)所述的刺激分沁方法是:照射刺激法、營(yíng)養(yǎng)缺乏刺激法、細(xì)胞機(jī)械摩擦刺激法、含有維生素的營(yíng)養(yǎng)液刺激法、低氧培養(yǎng)環(huán)境刺激法,所述的照射刺激法方法為采用UV照射是通過(guò)用具有波長(zhǎng)為300nm的UV光以100mJ/cm2的能量劑量照射300s ;所述的營(yíng)養(yǎng)缺乏刺激法方法為用含有0.2g/L的Ca2+和0.98g/L的Mg2+的PBS培養(yǎng)細(xì)胞4h ;所述的細(xì)胞機(jī)械摩擦刺激法方法為細(xì)胞接種24小時(shí)后,每天早晚對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行敲打,每次5min,直至細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶,不要用力過(guò)猛,使細(xì)胞脫落;所述的含有維生素的營(yíng)養(yǎng)液刺激法方法為培養(yǎng)基中含有維生素A的濃度為5um、培養(yǎng)基中含有維生素B的濃度為lOOum、培養(yǎng)基中含有維生素C的濃度為lOOum、培養(yǎng)基中含有維生素D的濃度為1um ;所述的低氧培養(yǎng)環(huán)境刺激法方法為37°C、5%CO 2、5%02培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞。用其中的任意一種刺激方法刺激細(xì)胞即可收集提取獲得細(xì)胞外活性物質(zhì)a。
[0010]所述的干細(xì)胞制劑的制備方法,步驟(2)所述的濃縮方法是,細(xì)胞外的活性物質(zhì)濃縮采用30HT50KD的中空纖維過(guò)濾柱過(guò)濾和濃縮所收集,干細(xì)胞分泌活性物質(zhì)濃縮液濃度為為1*106個(gè)細(xì)胞/mf 4*106個(gè)細(xì)胞/ml中的營(yíng)養(yǎng)液中。
[0011]所述的干細(xì)胞制劑的制備方法,步驟(3)方法是選用低糖DMEM/F12另含10%的高級(jí)胎牛血清或自體血清對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),然后通過(guò)磷酸緩沖鹽溶液PBS、生理鹽水或其它相應(yīng)的細(xì)胞等滲緩沖液進(jìn)行沖洗、用溫和的物理法細(xì)胞破碎、2000rpm離心lOmin,再用70unTl30um的過(guò)濾器過(guò)濾后,然后再采用0.22um的過(guò)濾器進(jìn)行無(wú)菌的過(guò)濾和濃縮或稀釋。干細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)濃縮液濃度為5*106飛?17個(gè)細(xì)胞/ml。
[0012]所述的干細(xì)胞制劑的制備方法,步驟(3)方法是,通過(guò)細(xì)超聲刺激、低溫冷凍刺激、滲透壓刺激對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激即可獲得細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)b,所述的超聲破碎法方法,將細(xì)胞收集于15ml離心管中,再用生理鹽水/PBS將細(xì)胞重懸,將離心管插入冰中,用15-25kHz超聲波振蕩器對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行超聲5次,每次3s,在5次超聲過(guò)程中,每次都要更換超聲位置,超聲完畢后,將細(xì)胞懸液用2000rpm離心lOmin,收集上清液;所述的低溫冷凍破碎法方法,將細(xì)胞收集于15ml離心管中,再用生理鹽水/PBS將細(xì)胞重懸,將15ml離心管放入_80°C低溫冰箱冷凍,24小時(shí)后,將離心管放入37°C水浴鍋中快速融化,將15ml離心管在渦旋混合儀上震蕩3次,每次5s,將細(xì)胞懸液用2000rpm離心lOmin,收集上清液;所述的滲透壓破碎法方法:將細(xì)胞收集于15ml離心管中,再用無(wú)菌的超純水重懸細(xì)胞,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)吹打5min,將細(xì)胞懸液用2000rpm離心1min,收集上清液。用其中的任意一種破碎方法即可收集提取獲得細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)b。
[0013]所述的干細(xì)胞制劑的制備方法,步驟(4)方法是,所述的細(xì)胞外活性物質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)按a:b=l:3.5比例進(jìn)行混合,混合液放置在棕色耐低溫玻璃瓶中4°C進(jìn)行臨時(shí)保存;所述的分離純化干細(xì)胞過(guò)程,嚴(yán)格在GMP環(huán)境要求下進(jìn)行、使用無(wú)安全風(fēng)險(xiǎn)的試劑和培養(yǎng)器皿進(jìn)行擴(kuò)增;所述干細(xì)胞選用3-8代以內(nèi)、細(xì)胞表面標(biāo)志檢測(cè)符合相關(guān)行業(yè)規(guī)范、細(xì)胞無(wú)變異、未發(fā)生分化、未發(fā)生衰老或凋亡。
[0014]有益效果:
1.本發(fā)明的活性物質(zhì)是通過(guò)從哺乳動(dòng)物的胎盤(pán)、臍帶、臍帶血、脂肪組織中分離出有效和活性和營(yíng)養(yǎng)成分或通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)和現(xiàn)代生物技術(shù)分離純化出其中的干細(xì)胞及其分泌的相關(guān)活性因子,其通過(guò)不同的方法應(yīng)用于人體,可用于治療哮喘、過(guò)敏性鼻炎、婦女更年期綜合癥、燒燙傷的修復(fù)、心腦血管疾病、免疫性疾病及抗衰老等,能活化機(jī)體干細(xì)胞,修復(fù)或替代受損、病變和衰老的細(xì)胞,具有調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞代謝功能,增強(qiáng)機(jī)體免疫力,延緩衰老等功效。
[0015]2.本發(fā)明的是通過(guò)物理方法等剌激細(xì)胞的活性物質(zhì)分泌、并通過(guò)無(wú)熱源的方法進(jìn)行活性物質(zhì)收集和濃縮。最終通過(guò)一定的純化方法去除掉易引起人體過(guò)敏的一些物質(zhì),使該種制劑的人群適用范圍更廣、安全性更高、獲得有效活性成分?jǐn)?shù)量更多。
[0016]【具體實(shí)施方式】:
實(shí)施例1: 一種干細(xì)胞制劑的制備方法,該方法包括如下步驟:
(1)從生物活性物質(zhì)組合來(lái)源中提取干細(xì)胞,對(duì)其生物活性物質(zhì)需進(jìn)行分離純化、培養(yǎng)擴(kuò)增;
(2)對(duì)從生物活性物質(zhì)組合中提取的干細(xì)胞進(jìn)行濃縮、剌激分沁,提取獲得細(xì)胞外活性物質(zhì)a ;
(3)收集并純化步驟(2)后,剩下的干細(xì)胞用溫和的物理法細(xì)胞破碎收集細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)b,再將細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)b濃縮;
(4)將所述的細(xì)胞外活性物質(zhì)a和所述的細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)b按a:b=l:3.5比例進(jìn)行混合得到干細(xì)胞制劑。
[0017]實(shí)施例2:
根據(jù)實(shí)施例1所述的干細(xì)胞制劑的制備方法,步驟(I)方法是,所述的生物活性物質(zhì)組合可從胎盤(pán)、臍帶、臍帶血、脂肪組織中分離的胎盤(pán)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞、高濃度血小板血漿PRP、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞中獲得;所述的胎盤(pán)干細(xì)胞分離、制備及培養(yǎng):將胎盤(pán)采集袋經(jīng)75%酒精消毒后放入生物安全柜中,將裝有胎盤(pán)的采集袋無(wú)菌操作打開(kāi),用一把鑷子將胎盤(pán)夾出放入一個(gè)滅菌后的保鮮盒內(nèi),用75%的酒精將胎盤(pán)浸沒(méi),浸泡5min ;浸泡結(jié)束后,用原來(lái)的鑷子將胎盤(pán)中央連接臍帶的部分剪下直徑約8-lOcm含有羊膜和絨毛膜的組織放入新的平皿中,剝離表面的羊膜,用生理鹽水清洗,清洗干凈后,換一把新的鑷子將胎盤(pán)夾入新的培養(yǎng)皿中,將肉眼可見(jiàn)的血管及局部淤血部位剪掉,在置于新的平皿中生理鹽水清洗,洗至最后上清為透明色;剪掉約6-8g左右的胎盤(pán)組織放入潔凈的50ml的潔凈離心管中,用眼科剪將胎盤(pán)剪碎至1-1.5mm3大小的組織塊,按1-1.5g胎盤(pán)組織塊接種I個(gè)T75培養(yǎng)瓶,每瓶補(bǔ)足Ilml培養(yǎng)基;將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),共培養(yǎng)21天,每5天更換一次培養(yǎng)液;30天后,棄上清液,用生理鹽水清洗I次,再用0.05%胰酶消化細(xì)胞3min,終止消化后收集細(xì)胞懸液于50ml離心管中,用1300rpm離心6min,收集細(xì)胞;將細(xì)胞用5ml培養(yǎng)基重懸,取10ul細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù),將細(xì)胞密度調(diào)整至4*104/ml,將細(xì)胞重新接種在T75培養(yǎng)瓶中繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),直至細(xì)胞傳至第3代,即可進(jìn)行干細(xì)胞制劑制備。
[0018]實(shí)施例3:
根據(jù)實(shí)施例1或2所述的干細(xì)胞制劑的制備方法,所述的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離、制備及培養(yǎng):將臍帶采集瓶經(jīng)75%酒精消毒后放入生物安全柜中,將裝有臍帶的采集瓶無(wú)菌操作打開(kāi),用一把鑷子將臍帶夾出放入一新的培養(yǎng)皿內(nèi),用75%的酒精將臍帶完全浸泡浸泡2min,浸泡結(jié)束后,用原來(lái)的鑷子將臍帶放入一個(gè)新的培養(yǎng)皿中,用生理鹽水清洗。清洗干凈后,換一把新的鑷子,將臍帶放入一個(gè)新的培養(yǎng)皿內(nèi)。將待分離的臍帶結(jié)扎端用眼科剪去掉,在培養(yǎng)皿中倒入生理鹽水,用眼科剪和鑷子將分離的臍帶外的血潰洗凈,用眼科剪將其分成1-1.5cm的小段,用眼科剪和鑷子將臍動(dòng)脈和臍靜脈內(nèi)的血洗凈。將剪好的臍帶小段放入一新的培養(yǎng)皿,換一新的眼科剪和兩把新的鑷子,用眼科剪順著臍靜脈腔剪開(kāi),用兩把鑷子將臍靜脈和臍動(dòng)脈剝除,剝?nèi)∪A通氏膠,將剝好的華通氏膠放入一個(gè)盛有生理鹽水的新培養(yǎng)皿內(nèi)涮洗,將洗好的華通氏膠裝入一個(gè)新的離心管內(nèi),用一新的眼科剪將華通氏膠剪成l_4mm3大小的組織塊,按0.5g華通氏膠加Iml培養(yǎng)液的比例混合,每0.5g華通氏膠接種I個(gè)T75瓶,每瓶再加入9ml培養(yǎng)液,將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),共培養(yǎng)14天,每5天更換一次培養(yǎng)液。14天后,棄上清液,用生理鹽水清洗I次,再用0.05%胰酶消化細(xì)胞3min,終止消化后收集細(xì)胞懸液于50ml離心管中,用1300rpm離心6min,收集細(xì)胞,將細(xì)胞用5ml培養(yǎng)基重懸,取10ul細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù),將細(xì)胞密度調(diào)整至4*104/ml,將細(xì)胞重新接種在T75培養(yǎng)瓶中繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),直至細(xì)胞傳至第3代,即可進(jìn)行干細(xì)胞制劑制備。
[0019]實(shí)施例4:
根據(jù)實(shí)施例1或2或3所述的干細(xì)胞制劑的制備方法,所述的臍帶血干細(xì)胞分離、制備及培養(yǎng):用臍血采集袋采集臍血約10ml其中包括20ml的抗凝劑,用75%的酒精對(duì)臍血采集袋進(jìn)行消毒后將采集袋放入生物安全柜中,將臍血分裝到4個(gè)50ml提前各加入15ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中,2000rpm離心,20min,離心結(jié)束后,輕輕拿出離心管,此時(shí)離心管分為四層,從下向上分別是:紅細(xì)胞層、分離液層、單核細(xì)胞層、血漿層。將單核細(xì)胞層收集到2個(gè)50ml離心管中,然后加滿生理鹽水,1600rpm離心1min。棄上清,沉淀細(xì)胞混勻后再加滿生理鹽水,1200rpm離心lOmin,用Iml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,將2個(gè)離心管的細(xì)胞懸液混合到I個(gè)管中,計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度為5*106/ml,將細(xì)胞接種到T75培養(yǎng)瓶中,每瓶接種1ml細(xì)胞懸液,第4天,半量換液,以后每3天換液一次,顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁及生長(zhǎng)情況,待細(xì)胞長(zhǎng)至70%融合度時(shí),傳代,棄上清液,用生理鹽水清洗I次,再用0.05%胰酶消化細(xì)胞3min,終止消化后收集細(xì)胞懸液于50ml離心管中,用1300rpm離心6min,收集細(xì)胞,將細(xì)胞用5ml培養(yǎng)基重懸,取10ul細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù),將細(xì)胞密度調(diào)整至4*104/ml,將細(xì)胞重新接種在T75培養(yǎng)瓶中繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),直至細(xì)胞傳至第3代,即可進(jìn)行干細(xì)胞制劑制備。
[0020]實(shí)施例5:
根據(jù)實(shí)施例1或2或3或4所述的干細(xì)胞制劑的制備方法,所述的高濃度血小板血漿PRP分離、制備:采用肝素抗凝的真空采血管采集臍帶血,將采血管經(jīng)75%酒精消毒后放入生物安全柜中,將臍帶血轉(zhuǎn)移至50ml離心管中,用200g離心lOmin,離心結(jié)束后,小心取出離心管;用移液管將PRP吸出,收集到另一只50ml離心管中,取1uIPRP用生理鹽水稀釋100倍,將稀釋后的PRP用血液計(jì)數(shù)儀計(jì)出血小板濃度,即可進(jìn)行干細(xì)胞制劑制備。
[0021]實(shí)施例6:
根據(jù)實(shí)施例1或2或3或4或5所述的干細(xì)胞制劑的制備方法,所述的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分離、制備及培養(yǎng):無(wú)菌打開(kāi)儲(chǔ)存瓶,鑷子夾出脂肪于新平皿中,倒入酒精消毒4min,兩側(cè)均消毒,再移入新的平皿中。將酒精消毒后的脂肪置于新平皿中,生理鹽水清洗兩遍,置于新的平皿中剝離掉結(jié)蹄組織和較大的血管。于新的平皿中加入生理鹽水浸沒(méi)于脂肪組織,清洗兩次,洗掉剝離引起后的血液,將清洗后的組織移入新的離心管中,剪碎至
0.5-lmm3,根據(jù)剪碎后的體積加入3倍體積的0.075%的I型膠原酶取7.5g膠原酶溶于10ml滅菌的去離子水中,0.22微米濾器過(guò)濾分裝于新的50ml離心管中,使用時(shí)100倍稀釋,混勻于37°C水浴鍋中,消化1.5-2h,每1min輕輕晃動(dòng)搖勻一次,消化結(jié)束后,加入1mlDMEM終止消化,1300r/min離心6min。棄上清,加入20ml生理鹽水重懸細(xì)胞,計(jì)數(shù)。然后1300 r/min離心6 min,加入DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,按每個(gè)T75培養(yǎng)瓶接種2.5-3.5xl06個(gè)細(xì)胞接種于T75瓶中,將培養(yǎng)瓶補(bǔ)足Ilml培養(yǎng)基后,置于37°C、5%的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到80%時(shí),細(xì)胞傳代。棄上清液,用生理鹽水清洗I次,再用0.05%胰酶消化細(xì)胞3min,終止消化后收集細(xì)胞懸液于50ml離心管中,用1300rpm離心6min,收集細(xì)胞,將細(xì)胞用5ml培養(yǎng)基重懸,取10ul細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù),將細(xì)胞密度調(diào)整至4*104/ml,將細(xì)胞重新接種在T75培養(yǎng)瓶中繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),直至細(xì)胞傳至第3代,即可進(jìn)行干細(xì)胞制劑制備。
[0022]實(shí)施例7:
根據(jù)實(shí)施例1或2或3或4或5或6所述的干細(xì)胞制劑的制備方法,步驟(2)方法是,細(xì)胞外的活性物質(zhì)濃縮采用30HT50KD的中空纖維過(guò)濾柱過(guò)濾和濃縮所收集,干細(xì)胞分泌活性物質(zhì)濃縮液濃度為為1*106個(gè)細(xì)胞/mf 4*106個(gè)細(xì)胞/ml中的營(yíng)養(yǎng)液中。
[0023]實(shí)施例8:
根據(jù)實(shí)施例1或2或3或4或5或6或7所述的干細(xì)胞制劑的制備方法,所述的刺激分沁方法是:照射刺激法、營(yíng)養(yǎng)缺乏刺激法、細(xì)胞機(jī)械摩擦刺激法、含有維生素的營(yíng)養(yǎng)液刺激法、低氧培養(yǎng)環(huán)境刺激法,所述的照射刺激法方法為采用UV照射是通過(guò)用具有波長(zhǎng)為300nm的UV光以100mJ/cm2的能量劑量照射300s ;所述的營(yíng)養(yǎng)缺乏刺激法方法為用含有
0.2g/L的Ca2+和0.98g/L的Mg2+的PBS培養(yǎng)細(xì)胞4h ;所述的細(xì)胞機(jī)械摩擦刺激法方法為細(xì)胞接種24小時(shí)后,每天早晚對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行敲打,每次5min,直至細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶,不要用力過(guò)猛,使細(xì)胞脫落;所述的含有維生素的營(yíng)養(yǎng)液刺激法方法為培養(yǎng)基中含有維生素A的濃度為5um、培養(yǎng)基中含有維生素B的濃度為lOOum、培養(yǎng)基中含有維生素C的濃度為lOOum、培養(yǎng)基中含有維生素D的濃度為1um ;所述的低氧培養(yǎng)環(huán)境刺激法方法為37°C、5%C0 2、5%02培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞。用其中的任意一種刺激方法刺激細(xì)胞即可收集提取獲得細(xì)胞外活性物質(zhì)a。
[0024]實(shí)施例9:
根據(jù)實(shí)施例1或2或3或4或5或6或7或8所述的干細(xì)胞制劑的制備方法,步驟(3)方法是,通過(guò)細(xì)超聲刺激、低溫冷凍刺激、滲透壓刺激對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激即可獲得細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)b,所述的超聲破碎法方法,將細(xì)胞收集于15ml離心管中,再用生理鹽水/PBS將細(xì)胞重懸,將離心管插入冰中,用15-25kHz超聲波振蕩器對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行超聲5次,每次3s,在5次超聲過(guò)程中,每次都要更換超聲位置,超聲完畢后,將細(xì)胞懸液用2000rpm離心lOmin,收集上清液;所述的低溫冷凍破碎法方法,將細(xì)胞收集于15ml離心管中,再用生理鹽水/PBS將細(xì)胞重懸,將15ml離心管放入_80°C低溫冰箱冷凍,24小時(shí)后,將離心管放入37°C水浴鍋中快速融化,將15ml離心管在渦旋混合儀上震蕩3次,每次5s,將細(xì)胞懸液用2000rpm離心lOmin,收集上清液;所述的滲透壓破碎法方法:將細(xì)胞收集于15ml離心管中,再用無(wú)菌的超純水重懸細(xì)胞,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)吹打5min,將細(xì)胞懸液用2000rpm離心1min,收集上清液。用其中的任意一種破碎方法即可收集提取獲得細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)b。
[0025]實(shí)施例10:
根據(jù)實(shí)施例1或2或3或4或5或6或7或8或9所述的干細(xì)胞制劑的制備方法,步驟(3)方法是干細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)濃縮液濃度為5*106飛?17個(gè)細(xì)胞/ml中,然后選用低糖DMEM/F12另含10%的高級(jí)胎牛血清或自體血清進(jìn)行培養(yǎng),其次通過(guò)磷酸緩沖鹽溶液PBS、生理鹽水或其它相應(yīng)的細(xì)胞等滲緩沖液進(jìn)行沖洗、用溫和的物理法細(xì)胞破碎、2000rpm離心1min,再用70unTl30um的過(guò)濾器過(guò)濾后,然后再采用0.22um的過(guò)濾器進(jìn)行無(wú)菌的過(guò)濾和濃縮或稀釋。
[0026]實(shí)施例11:
根據(jù)實(shí)施例1或2或3或4或5或6或7或8或9或10所述的干細(xì)胞制劑的制備方法,步驟(4)方法是,所述的細(xì)胞外活性物質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)按a:b=l:3.5比例進(jìn)行混合,混合液放置在棕色耐低溫玻璃瓶中4°C進(jìn)行臨時(shí)保存;所述的分離純化干細(xì)胞過(guò)程,嚴(yán)格在GMP環(huán)境要求下進(jìn)行、使用無(wú)安全風(fēng)險(xiǎn)的試劑和培養(yǎng)器皿進(jìn)行擴(kuò)增;所述干細(xì)胞選用3-8代以內(nèi)、細(xì)胞表面標(biāo)志檢測(cè)符合相關(guān)行業(yè)規(guī)范、細(xì)胞無(wú)變異、未發(fā)生分化、未發(fā)生衰老或凋亡。
【權(quán)利要求】
1.一種干細(xì)胞制劑的制備方法,其特征是:該方法包括如下步驟: (1)從生物活性物質(zhì)組合來(lái)源中提取干細(xì)胞,對(duì)其生物活性物質(zhì)需進(jìn)行分離純化、培養(yǎng)擴(kuò)增; (2)對(duì)從生物活性物質(zhì)組合中提取的干細(xì)胞進(jìn)行剌激分沁、濃縮,提取獲得細(xì)胞外活性物質(zhì)a ; (3)收集并純化步驟(2)后,剩下的干細(xì)胞用溫和的物理法細(xì)胞破碎收集細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)b,再將細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)b濃縮; (4)將所述的細(xì)胞外活性物質(zhì)a和所述的細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)b按a:b=l:3.5比例進(jìn)行混合得到干細(xì)胞制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞制劑的制備方法,其特征是:步驟(I)從生物活性物質(zhì)組合來(lái)源中提取干細(xì)胞,對(duì)其生物活性物質(zhì)需進(jìn)行分離純化、培養(yǎng)擴(kuò)增是,所述的生物活性物質(zhì)組合可從胎盤(pán)、臍帶、臍帶血、脂肪組織中分離的胎盤(pán)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞、高濃度血小板血漿PRP、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞中獲得;所述的胎盤(pán)干細(xì)胞分離、制備及培養(yǎng):將胎盤(pán)采集袋經(jīng)75%酒精消毒后放入生物安全柜中,將裝有胎盤(pán)的采集袋無(wú)菌操作打開(kāi),用一把鑷子將胎盤(pán)夾出放入一個(gè)滅菌后的保鮮盒內(nèi),用75%的酒精將胎盤(pán)浸沒(méi),浸泡5min ;浸泡結(jié)束后,用原來(lái)的鑷子將胎盤(pán)中央連接臍帶的部分剪下直徑約8-lOcm含有羊膜和絨毛膜的組織放入新的平皿中,剝離表面的羊膜,用生理鹽水清洗,清洗干凈后,換一把新的鑷子將胎盤(pán)夾入新的培養(yǎng)皿中,將肉眼可見(jiàn)的血管及局部淤血部位剪掉,在置于新的平皿中生理鹽水清洗,洗至最后上清為透明色;剪掉約6-8g左右的胎盤(pán)組織放入潔凈的50ml的潔凈離心管中,用眼科剪將胎盤(pán)剪碎至1-1.5mm3大小的組織塊,按1-1.5g胎盤(pán)組織塊接種I個(gè)T75培養(yǎng)瓶,每瓶補(bǔ)足Ilml培養(yǎng)基;將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),共培養(yǎng)21天,每5天更換一次培養(yǎng)液;30天后,棄上清液,用生理鹽水清洗I次,再用0.05%胰酶消化細(xì)胞3min,終止消化后收集細(xì)胞懸液于50ml離心管中,用1300rpm離心6min,收集細(xì)胞;將細(xì)胞用5ml培養(yǎng)基重懸,取10ul細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù),將細(xì)胞密度調(diào)整至4*104/ml,將細(xì)胞重新接種在T75培養(yǎng)瓶中繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),直至細(xì)胞傳至第3代,即可進(jìn)行干細(xì)胞制劑制備。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的干細(xì)胞制劑的制備方法,其特征是:所述的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離、制備及培養(yǎng):將臍帶采集瓶經(jīng)75%酒精消毒后放入生物安全柜中,將裝有臍帶的采集瓶無(wú)菌操作打開(kāi),用一把鑷子將臍帶夾出放入一新的培養(yǎng)皿內(nèi),用75%的酒精將臍帶完全浸泡浸泡2min,浸泡結(jié)束后,用原來(lái)的鑷子將臍帶放入一個(gè)新的培養(yǎng)皿中,用生理鹽水清洗,清洗干凈后,換一把新的鑷子,將臍帶放入一個(gè)新的培養(yǎng)皿內(nèi),將待分離的臍帶結(jié)扎端用眼科剪去掉,在培養(yǎng)皿中倒入生理鹽水,用眼科剪和鑷子將分離的臍帶外的血潰洗凈,用眼科剪將其分成1-1.5cm的小段,用眼科剪和鑷子將臍動(dòng)脈和臍靜脈內(nèi)的血洗凈,將剪好的臍帶小段放入一新的培養(yǎng)皿,換一新的眼科剪和兩把新的鑷子,用眼科剪順著臍靜脈腔剪開(kāi),用兩把鑷子將臍靜脈和臍動(dòng)脈剝除,剝?nèi)∪A通氏膠,將剝好的華通氏膠放入一個(gè)盛有生理鹽水的新培養(yǎng)皿內(nèi)涮洗,將洗好的華通氏膠裝入一個(gè)新的離心管內(nèi),用一新的眼科剪將華通氏膠剪成l_4mm3大小的組織塊,按0.5g華通氏膠加Iml培養(yǎng)液的比例混合,每0.5g華通氏膠接種I個(gè)T75瓶,每瓶再加入9ml培養(yǎng)液,將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),共培養(yǎng)14天,每5天更換一次培養(yǎng)液14天后,棄上清液,用生理鹽水清洗I次,再用0.05%胰酶消化細(xì)胞3min,終止消化后收集細(xì)胞懸液于50ml離心管中,用1300rpm離心6min,收集細(xì)胞,將細(xì)胞用5ml培養(yǎng)基重懸,取10ul細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù),將細(xì)胞密度調(diào)整至4*104/ml,將細(xì)胞重新接種在T75培養(yǎng)瓶中繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),直至細(xì)胞傳至第3代,即可進(jìn)行干細(xì)胞制劑制備。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的干細(xì)胞制劑的制備方法,其特征是:所述的臍帶血干細(xì)胞分離、制備及培養(yǎng):用臍血采集袋采集臍血約10ml其中包括20ml的抗凝劑,用75%的酒精對(duì)臍血采集袋進(jìn)行消毒后將采集袋放入生物安全柜中,將臍血分裝到4個(gè)50ml提前各加入15ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中,2000rpm離心,20min,離心結(jié)束后,輕輕拿出離心管,此時(shí)離心管分為四層,從下向上分別是:紅細(xì)胞層、分離液層、單核細(xì)胞層、血漿層,將單核細(xì)胞層收集到2個(gè)50ml離心管中,然后加滿生理鹽水,1600rpm離心lOmin,棄上清,沉淀細(xì)胞混勻后再加滿生理鹽水,1200rpm離心lOmin,用Iml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,將2個(gè)離心管的細(xì)胞懸液混合到I個(gè)管中,計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度為5*106/ml,將細(xì)胞接種到T75培養(yǎng)瓶中,每瓶接種1ml細(xì)胞懸液,第4天,半量換液,以后每3天換液一次,顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁及生長(zhǎng)情況,待細(xì)胞長(zhǎng)至70%融合度時(shí),傳代,棄上清液,用生理鹽水清洗I次,再用0.05%胰酶消化細(xì)胞3min,終止消化后收集細(xì)胞懸液于50ml離心管中,用1300rpm離心6min,收集細(xì)胞,將細(xì)胞用5ml培養(yǎng)基重懸,取10ul細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù),將細(xì)胞密度調(diào)整至4*104/ml,將細(xì)胞重新接種在T75培養(yǎng)瓶中繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),直至細(xì)胞傳至第3代,即可進(jìn)行干細(xì)胞制劑制備。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的干細(xì)胞制劑的制備方法,其特征是:步驟(2)所述的刺激分沁方法是:照射刺激法、營(yíng)養(yǎng)缺乏刺激法、細(xì)胞機(jī)械摩擦刺激法、含有維生素的營(yíng)養(yǎng)液刺激法、低氧培養(yǎng)環(huán)境刺激法,所述的照射刺激法方法為采用UV照射是通過(guò)用具有波長(zhǎng)為300nm的UV光以100mJ/cm2的能量劑量照射300s ;所述的營(yíng)養(yǎng)缺乏刺激法方法為用含有0.2g/L的Ca2+和0.98g/L的Mg2+的PBS培養(yǎng)細(xì)胞4h ;所述的細(xì)胞機(jī)械摩擦刺激法方法為細(xì)胞接種24小時(shí)后,每天早晚對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行敲打,每次5min,直至細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶,不要用力過(guò)猛,使細(xì)胞脫落;所述的含有維生素的營(yíng)養(yǎng)液刺激法方法為培養(yǎng)基中含有維生素A的濃度為5um、培養(yǎng)基中含有維生素B的濃度為lOOum、培養(yǎng)基中含有維生素C的濃度為lOOum、培養(yǎng)基中含有維生素D的濃度為1um ;所述的低氧培養(yǎng)環(huán)境刺激法方法為370C、5%C0 2、5%02培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞,用其中的任意一種刺激方法刺激細(xì)胞即可收集提取獲得細(xì)胞外活性物質(zhì)a。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5所述的干細(xì)胞制劑的制備方法,其特征是:步驟(2)所述的濃縮方法是,細(xì)胞外的活性物質(zhì)濃縮采用30HT50KD的中空纖維過(guò)濾柱過(guò)濾和濃縮所收集,干細(xì)胞分泌活性物質(zhì)濃縮液濃度為為1*106個(gè)細(xì)胞/mf4*106個(gè)細(xì)胞/ml中的營(yíng)養(yǎng)液中。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5或6所述的干細(xì)胞制劑的制備方法,其特征是:步驟(3)方法是選用低糖DMEM/F12另含10%的高級(jí)胎牛血清或自體血清對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),然后通過(guò)磷酸緩沖鹽溶液PBS、生理鹽水或其它相應(yīng)的細(xì)胞等滲緩沖液進(jìn)行沖洗、用溫和的物理法細(xì)胞破碎、2000rpm離心lOmin,再用70unTl30um的過(guò)濾器過(guò)濾后,然后再采用0.22um的過(guò)濾器進(jìn)行無(wú)菌的過(guò)濾和濃縮或稀釋,干細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)濃縮液濃度為5*106?5?17個(gè)細(xì)胞/ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5或6或7所述的干細(xì)胞制劑的制備方法,其特征是:步驟(3)方法是,通過(guò)細(xì)超聲刺激、低溫冷凍刺激、滲透壓刺激對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激即可獲得細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)b,所述的超聲破碎法方法,將細(xì)胞收集于15ml離心管中,再用生理鹽水/PBS將細(xì)胞重懸,將離心管插入冰中,用15-25kHz超聲波振蕩器對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行超聲5次,每次3s,在5次超聲過(guò)程中,每次都要更換超聲位置,超聲完畢后,將細(xì)胞懸液用2000rpm離心lOmin,收集上清液;所述的低溫冷凍破碎法方法,將細(xì)胞收集于15ml離心管中,再用生理鹽水/PBS將細(xì)胞重懸,將15ml離心管放入_80°C低溫冰箱冷凍,24小時(shí)后,將離心管放入37°C水浴鍋中快速融化,將15ml離心管在渦旋混合儀上震蕩3次,每次5s,將細(xì)胞懸液用2000rpm離心1min,收集上清液;所述的滲透壓破碎法方法:將細(xì)胞收集于15ml離心管中,再用無(wú)菌的超純水重懸細(xì)胞,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)吹打5min,將細(xì)胞懸液用2000rpm離心lOmin,收集上清液,用其中的任意一種破碎方法即可收集提取獲得細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)b。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5或6或7或8所述的干細(xì)胞制劑的制備方法,其特征是:步驟(4)方法是,所述的細(xì)胞外活性物質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)按a:b=l:3.5比例進(jìn)行混合,混合液放置在棕色耐低溫玻璃瓶中4°C進(jìn)行臨時(shí)保存;所述的分離純化干細(xì)胞過(guò)程,嚴(yán)格在GMP環(huán)境要求下進(jìn)行、使用無(wú)安全風(fēng)險(xiǎn)的試劑和培養(yǎng)器皿進(jìn)行擴(kuò)增;所述干細(xì)胞選用3-8代以內(nèi)、細(xì)胞表面標(biāo)志檢測(cè)符合相關(guān)行業(yè)規(guī)范、細(xì)胞無(wú)變異、未發(fā)生分化、未發(fā)生衰老或凋亡。
【文檔編號(hào)】A61P39/06GK104224841SQ201410463644
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年9月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月13日
【發(fā)明者】張怡, 蘆慧穎, 王靈娟, 梁麗潮, 王浩宇, 王博昊 申請(qǐng)人:黑龍江天晴干細(xì)胞有限公司