多葉越南槐中總生物堿的提取方法、檢測(cè)方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了多葉越南槐中總生物堿的提取方法、檢測(cè)方法及其應(yīng)用，其中提取方法分為兩種：①將多葉越南槐藥材用70-95%乙醇加熱回流提取得到流浸膏，經(jīng)過加水混懸和調(diào)酸處理后用氯仿萃取，最終得到總生物堿；②先將多葉越南槐藥材滲漉提取，經(jīng)732陽離子交換樹脂洗脫提取，最后對(duì)樹脂進(jìn)行氯仿洗脫處理得到總生物堿。所得總生物堿通過薄層色譜法進(jìn)行檢測(cè)，使用三氯甲烷-甲醇-濃氨試液（4:1:0.1）為展開劑，以苦參堿、氧化苦參堿和氧化槐果堿作為總生物堿中定性成分，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。本發(fā)明中提取方法過程簡(jiǎn)單，所得總生物堿具有抗胃潰瘍，抗凝血，抗腦缺血，抗血栓和降血脂等藥理作用，具有較大的市場(chǎng)開發(fā)前景。
【專利說明】多葉越南槐中總生物堿的提取方法、檢測(cè)方法及其應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明屬于藥液提取【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種多葉越南槐中總生物堿的提取方 法、檢測(cè)方法及其應(yīng)用。 【背景技術(shù)】
[0002] 多葉越南槐 Gagnep. Z. Huang et Z. C. Zhou為豆科槐屬植物，與常用中藥材山豆根[學(xué)名：越南槐 Gagnep]是同科同屬同種的根，是越南槐的一個(gè)變種。生長(zhǎng)于石山區(qū)，分布于廣西、廣東、 云南、貴州和江西等省，在廣西主要分布于紅水河流域，如都安、馬山、忻城、武鳴等地。其 性寒，味苦，具有清熱解毒、消腫利咽之功效，常用于火毒蘊(yùn)結(jié)，咽喉腫痛，齒齦腫痛，肺熱咳 嗽，肝炎等疾患的治療。
[0003] 有關(guān)多葉越南槐藥物成分目前有了一些研究： 1、盧文杰、牙啟康在《廣西科學(xué)》2011年第四期發(fā)表了"多葉越南槐脂溶性成分 研究"的文章，采用索氏提取法提取多葉越南槐?ο?/--?/75·Υ5· Gagnep. var. Z. Huang et Z. C. Zhou)的脂溶性成分，甲酯化后，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 (GC-MS)進(jìn)行分析，計(jì)算機(jī)檢索結(jié)合人工解析進(jìn)行成分分析和鑒定，共分離得到41個(gè)峰， 鑒定了其中32種成分。多葉越南槐脂溶性成分主要含長(zhǎng)鏈脂肪酸。所有成分均首次在該 植物中鑒定。
[0004] 2、盧文杰、陸國(guó)壽、譚曉、陳家源、黃周鋒在《中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志》2014年第20卷 第8期發(fā)表了"多葉越南槐生物堿類成分的研究"的文章，采用Sephadex LH-20柱色譜、硅 膠柱色譜、重結(jié)晶等方法分離和純化多葉越南槐的生物堿成分，綜合運(yùn)用紅外光譜、質(zhì)譜、 核磁共振等技術(shù)和理化方法進(jìn)行分析，并確定分離得到的生物堿結(jié)構(gòu)。結(jié)果：根據(jù)理化性 質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)，鑒定了各化合物的結(jié)構(gòu)分別是：槐果堿，苦參堿，槐花醇，9 α -羥基苦參堿， 12 α -羥基槐果堿，氧化槐果堿，氧化苦參堿，金雀花堿。結(jié)論：化合物1?8均為首次從多 葉越南槐中分離得到。
[0005] 多葉越南槐與山豆根具有相同的藥用功效，廣西民間常把多葉越南槐當(dāng)作山豆根 藥材來使用，《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)，1990版》也將多葉越南槐作為山豆根藥材的植物來源之一 收載。據(jù)分析，多葉越南槐與山豆根一樣含有苦參堿，槐果堿，槐花醇，9 α -輕基苦參堿， 12α -羥基槐果堿，氧化苦參堿，氧化槐果堿，金雀花堿等多種生物堿成分。目前市場(chǎng)上山豆 根面臨日益枯竭的現(xiàn)狀，因此，對(duì)多葉越南槐中總生物堿進(jìn)行提取開發(fā)，探索多葉越南槐藥 材能否作為山豆根的代用品，為資源利用和臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，顯得尤為重要。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對(duì)目前市場(chǎng)山豆根資源逐漸減少的問題，提供一種多葉越南槐 中總生物堿的提取方法、檢測(cè)方法及其應(yīng)用，以此探索多葉越南槐藥材能否作為山豆根的 代用品，為資源利用和臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的： 本發(fā)明多葉越南槐中總生物堿的提取方法分為兩種： 第一種方法為：將多葉越南槐藥材用70-95%乙醇加熱回流提取得到流浸膏，經(jīng)過加水 混懸和調(diào)酸處理后用氯仿萃取，最終得到總生物堿。
[0008] 具體步驟為：（1)將多葉越南槐藥材粉碎成20-80目粗粉，用70-95%乙醇在 80-90°C下回流提取3-5次，每次1-3小時(shí)，趁熱過濾，回收溶劑，得60-70°C下相對(duì)密度為 1. 10-1. 20的流浸膏；（2)將流浸膏加水混懸，滴加濃硫酸至pH值為3 ; (3)用氯仿萃取至 氯仿顏色變淺，酸水層加碳酸鉀至pH值為11，用氯仿萃取至氯仿液蒸干無生物堿反應(yīng)，回 收氯仿得氯仿提取物，即得總生物堿。
[0009] 第二種方法為：先將多葉越南槐藥材滲漉提取，經(jīng)732陽離子交換樹脂洗脫提取， 最后對(duì)樹脂進(jìn)行氯仿洗脫處理得到總生物堿。
[〇〇1〇] 具體步驟為：（1)將多葉越南槐藥材粉碎成20-80目粗粉，用多葉越南槐藥材質(zhì)量 的8-20倍的1%鹽酸水溶液滲漉提取1-7天，收集滲漉液；（2)滲漉液通過預(yù)先處理好的 732陽離子交換樹脂柱，用水洗脫樹脂柱至水液無色；（3)將樹脂倒入敞開的器皿中，晾干， 用氨水捏溶，用氯仿回流提取2-5次，至氯仿提取液蒸干檢查無生物堿反應(yīng)，回收氯仿提取 液得氯仿提取物，即得總生物堿。
[0011] 732陽離子交換樹脂為強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂，是一種磺酸化苯乙烯系 凝膠型強(qiáng)酸陽離子交換樹脂，具有交換容量高、交換速度快、機(jī)械強(qiáng)度高的特點(diǎn)，在多葉越 南槐中提取總生物堿過程中較為合適，經(jīng)發(fā)明人多次驗(yàn)證，使用該樹脂洗脫提取總生物堿 具有較高的收率。另外，732陽離子交換樹脂柱預(yù)處理方法為：將樹脂置于潔凈的容器中， 用清水漂洗，直到排水清晰為止。用水浸泡樹脂12~24小時(shí)，使樹脂充分膨脹。如為干樹脂， 應(yīng)先用飽和氯化鈉溶液浸泡，再逐步稀釋氯化鈉溶液，以免樹脂突然急劇膨脹而破碎。用樹 脂體積2倍量的2~5%HC1溶液浸泡樹脂2~4小時(shí)，并不時(shí)攪拌。然后用低純水洗滌樹脂，直 至溶液pH接近于4,再用2~5%Na0H溶液處理，處理后用水洗至中性。
[0012] 為更好的控制多葉越南槐中總生物堿的質(zhì)量，發(fā)明人還對(duì)從多葉越南槐中提取出 的總生物堿進(jìn)行反復(fù)探索和研究，制定了其檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，具體檢測(cè)方法為： 采用總生物堿的薄層色譜進(jìn)行定性鑒別，取多葉越南槐總生物堿l〇mg，置10ml容量瓶 中，加三氯甲烷至刻度，搖勻，作為供試品溶液；取多葉越南槐藥材粉末〇. 5g，加三氯甲烷 l〇ml，濃氨試液0. 2ml，振搖15分鐘，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?. 5ml三氯甲烷使溶解，作為 對(duì)照藥材溶液；另取苦參堿對(duì)照品，氧化苦參堿對(duì)照品，氧化槐果堿對(duì)照品加三氯甲烷制成 每lml各含lmg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液，照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品溶液，對(duì)照 藥材溶液各廣2 μ 1，對(duì)照品溶液Γ6 μ 1，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲 醇-濃氨試液（4:1:0. 1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液，供試品色譜中， 在與對(duì)照藥材，對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙黃色斑點(diǎn)。
[0013] 本發(fā)明多葉越南槐中總生物堿，在制備抗胃潰瘍，抗凝血，抗腦缺血，抗血栓和降 血脂藥物中的應(yīng)用。經(jīng)過發(fā)明人再三驗(yàn)證，多葉越南槐總生物堿高劑量與山豆根總生物堿 高劑量均能減輕小鼠胃潰瘍指數(shù)，延長(zhǎng)小鼠凝血時(shí)間，延長(zhǎng)小鼠腦缺血呼吸時(shí)間，降低大鼠 靜脈血栓重量，降低高脂血癥小鼠血脂水平，兩者作用相當(dāng)；多葉越南槐總生物堿中劑量 能減輕小鼠胃潰瘍指數(shù)，延長(zhǎng)小鼠腦缺血呼吸時(shí)間，降低大鼠靜脈血栓重量；急性毒性結(jié) 果表明，多葉越南槐總生物堿的半數(shù)致死量（LD5CI)為55. 30g. kg4，95%可信限為48. 15? 64. 37g. kg ^
[0014] 本發(fā)明的多葉越南槐中總生物堿的提取方法、檢測(cè)方法及其應(yīng)用具有以下顯著進(jìn) 步和優(yōu)點(diǎn)： 一、本發(fā)明的多葉越南槐中總生物堿的提取方法，可以使用乙醇回流提取得到流浸膏， 然后進(jìn)行氯仿萃取的方法，還可以使用鹽酸水溶液滲漉提取后，經(jīng)過732陽離子交換樹脂 柱洗脫，最后由氯仿提取的方法，以上兩種提取方法均無需高溫、高壓環(huán)境，提取過程簡(jiǎn)單、 易操作、易控制，較易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，對(duì)于多葉越南槐中總生物堿的批量提取提供了詳 實(shí)、可靠的數(shù)據(jù)資料。
[0015] 二、本發(fā)明的多葉越南槐中總生物堿的檢測(cè)方法，通過薄層色譜法定性總生物堿 中苦參堿，氧化苦參堿和氧化槐果堿來控制總生物堿的質(zhì)量，較為準(zhǔn)確。因?yàn)榭偵飰A中苦 參堿、氧化苦參堿和氧化槐果堿是其中的主要成分，在其應(yīng)用中起著主要作用。經(jīng)發(fā)明人多 次驗(yàn)證，以三氯甲烷-甲醇-濃氨試液（4:1:0. 1)為展開劑對(duì)于定性總生物堿中的主要成 分準(zhǔn)確、可靠，同時(shí)使用薄層色譜法流程簡(jiǎn)單，重復(fù)性高，適合作為多葉越南槐中總生物堿 的生產(chǎn)在線控制及出廠控制標(biāo)準(zhǔn)方法。
[0016] 三、本發(fā)明的多葉越南槐中總生物堿的提取方法提取的總生物堿含量較高，經(jīng)發(fā) 明人對(duì)其藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，多葉越南槐總生物堿高劑量與山豆根總生物堿高劑量均能減輕 小鼠胃潰瘍指數(shù)，延長(zhǎng)小鼠凝血時(shí)間，延長(zhǎng)小鼠腦缺血呼吸時(shí)間，降低大鼠靜脈血栓重量， 降低高脂血癥小鼠血脂水平，兩者作用相當(dāng)，多葉越南槐總生物堿具有一定的抗胃潰瘍，抗 凝血，抗腦缺血，抗血栓和降血脂作用，其毒性較低。
[0017] 【具體實(shí)施方式】 實(shí)施例1多葉越南槐中總生物堿提取方法(方法一） 1- 1將多葉越南槐藥材粉碎成20目粗粉，用70%乙醇在90°C下回流提取5次，每次1 小時(shí)，趁熱過濾，回收溶劑，得到60°C下相對(duì)密度為1. 20的流浸膏；將流浸膏加水混懸，滴 加濃硫酸至pH值為3 ;用氯仿萃取至氯仿顏色變淺，酸水層加碳酸鉀至pH值為11，用氯仿 萃取至氯仿液蒸干無生物堿反應(yīng)，回收氯仿得氯仿提取物，即得總生物堿。
[0018] 1-2將多葉越南槐藥材粉碎成80目粗粉，用75-90%乙醇在85°C下回流提取4次， 每次2小時(shí)，趁熱過濾，回收溶劑，得到65°C時(shí)相對(duì)密度為1. 15的流浸膏；將流浸膏加水混 懸，滴加濃硫酸至pH值為3 ;用氯仿萃取至氯仿顏色變淺，酸水層加碳酸鉀至pH值為11，用 氯仿萃取至氯仿液蒸干無生物堿反應(yīng)，回收氯仿得氯仿提取物，即得總生物堿。
[0019] 1-3將多葉越南槐藥材粉碎成50目粗粉，用95%乙醇在80°C下回流提取3次，每次 3小時(shí)，趁熱過濾，回收溶劑，得到70°C時(shí)相對(duì)密度為1. 10的流浸膏；將流浸膏加水混懸，滴 加濃硫酸至pH值為3 ;用氯仿萃取至氯仿顏色變淺，酸水層加碳酸鉀至pH值為11，用氯仿 萃取至氯仿液蒸干無生物堿反應(yīng)，回收氯仿得氯仿提取物，即得總生物堿。
[0020] 實(shí)施例2多葉越南槐中總生物堿提取方法(方法二） 2- 1將20公斤多葉越南槐藥材粉碎成粗粉，過20目篩，放入滲漉器中，層層壓實(shí)，然后 用配制好的1%鹽酸水溶液160公斤放入滲漉器，密閉，提取7天，滲漉過程中不攪動(dòng)，收集 滲漉液；將滲漉液通過預(yù)先處理好的732陽離子交換樹脂柱，然后用水洗脫樹脂柱至水液 無色；將樹脂倒入敞開的容器中，晾干或在55-65°C下烘干，用氨水捏溶，用氯仿回流提取5 次，至氯仿提取液蒸干檢查無生物堿反應(yīng)，回收氯仿提取液得氯仿提取物，即得總堿。
[0021] 2-2將15公斤多葉越南槐藥材粉碎成粗粉，過20目篩，放入滲漉器中，層層壓 實(shí)，然后用配制好的1%鹽酸水溶液300公斤放入滲漉器，密閉，提取1天，滲漉過程中不攪 動(dòng)，收集滲漉液；將滲漉液通過預(yù)先處理好的732陽離子交換樹脂柱，然后用水洗脫樹脂柱 至水液無色；將樹脂倒入敞開的容器中，晾干或在55-65°C下烘干，用氨水捏溶，用氯仿回 流提取2次，至氯仿提取液蒸干檢查無生物堿反應(yīng)，回收氯仿提取液得氯仿提取物，即得總 堿。
[0022] 2-3將30公斤多葉越南槐藥材粉碎成粗粉，過20目篩，放入滲漉器中，層層壓實(shí)， 然后用配制好的1%鹽酸水溶液450公斤放入滲漉器，密閉，提取3-5天，滲漉過程中不攪 動(dòng)，收集滲漉液；將滲漉液通過預(yù)先處理好的732陽離子交換樹脂柱，然后用水洗脫樹脂柱 至水液無色；將樹脂倒入敞開的容器中，晾干或在55-65°C下烘干，用氨水捏溶，用氯仿回 流提取3-4次，至氯仿提取液蒸干檢查無生物堿反應(yīng)，回收氯仿提取液得氯仿提取物，即得 總喊。
[0023] 上述提取方法中732陽離子交換樹脂柱預(yù)處理方法為：將樹脂置于潔凈的容器 中，用清水漂洗，直到排水清晰為止。用水浸泡樹脂15小時(shí)，使樹脂充分膨脹。用樹脂體積 2倍量的5%HC1溶液浸泡樹脂4小時(shí)，并不時(shí)攪拌，然后用低純水洗滌樹脂，直至溶液pH接 近于4,再用5%Na0H溶液處理，處理后用水洗至中性。
[0024] 732陽離子交換樹脂規(guī)格型號(hào)如下：
【權(quán)利要求】
1. 一種多葉越南槐中總生物堿的提取方法，其特征在于：包括以下步驟： (1) 將多葉越南槐藥材粉碎成20-80目粗粉，用70-95%乙醇在80-90°C下回流提取3-5 次，每次1-3小時(shí)，趁熱過濾，回收溶劑，得到60-70°C下相對(duì)密度為1. 10-1. 20的流浸膏； (2) 將流浸膏加水混懸，滴加濃硫酸至pH值為3 ; (3) 用氯仿萃取至氯仿顏色變淺，酸水層加碳酸鉀至pH值為11，用氯仿萃取至氯仿液 蒸干無生物堿反應(yīng)，回收氯仿得氯仿提取物，即得總生物堿。
2. -種多葉越南槐中總生物堿的提取方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將多葉越南槐藥材粉碎成20-80目粗粉，用1%鹽酸水溶液滲漉提取1-7天，收集滲 漉液； (2) 滲漉液通過預(yù)先處理好的732陽離子交換樹脂柱，用水洗脫樹脂柱至水液無色； (3) 將樹脂倒入敞開的器皿中，晾干，用氨水捏溶，用氯仿回流提取，至氯仿提取液蒸干 檢查無生物堿反應(yīng)，回收氯仿提取液得氯仿提取物，即得總生物堿。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的多葉越南槐中總生物堿的提取方法，其特征在于：所述滲漉 提取中加入1%鹽酸水溶液為多葉越南槐藥材質(zhì)量的8-20倍。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的多葉越南槐中總生物堿的提取方法，其特征在于：步驟（3)中 所述氯仿回流提取2-5次。
5. 權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的提取方法得到的多葉越南槐總生物堿的檢測(cè)方法，其特 征在于：采用薄層色譜進(jìn)行定性鑒別，具體步驟為： (1) 取多葉越南槐總生物堿l〇mg，置10ml容量瓶中，加三氯甲烷至刻度，搖勻，作為供 試品溶液； (2) 取多葉越南槐藥材粉末0. 5g，加三氯甲烷10ml，濃氨試液0. 2ml，振搖15分鐘，濾 過，濾液蒸干，殘?jiān)萤? 5ml三氯甲烷使溶解，作為對(duì)照藥材溶液； (3) 另取苦參喊對(duì)照品，氧化苦參喊對(duì)照品，氧化槐果喊對(duì)照品加二氯甲燒制成每lml 各含lmg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液； (4) 吸取供試品溶液，對(duì)照藥材溶液各廣2 μ 1，對(duì)照品溶液4~6 μ 1，分別點(diǎn)于同一硅 膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-濃氨試液（4:1:0. 1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以 稀碘化鉍鉀試液，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材，對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙黃 色斑點(diǎn)。
6. 權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的提取方法得到的多葉越南槐總生物堿，在制備抗胃潰 瘍，抗凝血，抗腦缺血，抗血栓和降血脂藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P7/02GK104095907SQ201410371787
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月31日
【發(fā)明者】盧文杰, 陳家源, 陸國(guó)壽, 譚曉, 黃建猷, 黃周鋒, 何開家, 李燕婧, 鐘正賢 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院