一種可吸收復(fù)合界面的螺釘及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種可吸收復(fù)合界面的螺釘，由螺釘帽、螺桿、螺釘頭連接件、基因薄層構(gòu)成，螺桿外緣設(shè)有自攻螺紋，基因薄層覆蓋在螺紋表面?；虮佑蓺ぞ厶堑幕讓蛹坝蓛?nèi)向外依次間隔覆有透明質(zhì)酸層和脂質(zhì)體-2000包裹的pEGFP-COMP質(zhì)粒層形成的活化層。本發(fā)明利用殼聚糖、透明質(zhì)酸、脂質(zhì)體的靜電作用使質(zhì)粒pEGFP-COMP在界面螺釘表面逐層沉積。本發(fā)明具有良好的生物相容性和骨誘導(dǎo)性，能有效調(diào)控COMP基因的釋放以增強(qiáng)促鈣化纖維軟骨效應(yīng)，提高宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染率，誘導(dǎo)韌帶植入后骨-韌帶界面良好愈合，可實現(xiàn)關(guān)節(jié)內(nèi)韌帶重建手術(shù)聯(lián)合基因治療。本發(fā)明設(shè)計合理，操作便捷且成本低廉，具有極強(qiáng)的可行性，適合用于產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。
【專利說明】一種可吸收復(fù)合界面的螺釘及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬關(guān)節(jié)內(nèi)韌帶重建術(shù)中界面螺釘?shù)闹圃欤唧w涉及一種COMP基因薄層組裝的可吸收復(fù)合界面螺釘及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]關(guān)節(jié)鏡下韌帶重建術(shù)是目前治療關(guān)節(jié)內(nèi)韌帶損傷、恢復(fù)關(guān)節(jié)穩(wěn)定性及功能有效的外科治療手段，據(jù)美國骨科運動醫(yī)學(xué)學(xué)會(AOSSM)統(tǒng)計，全球每年至少60萬人進(jìn)行關(guān)節(jié)內(nèi)韌帶重建術(shù)，占關(guān)節(jié)手術(shù)的21.6%。盡管該技術(shù)臨床上取得了巨大的療效，但是骨-韌帶界面愈合難題仍然困擾著廣大臨床工作者，一旦韌帶-骨界面愈合不良，很有可能導(dǎo)致整個手術(shù)失敗。因此如何提高韌帶-骨愈合是決定手術(shù)遠(yuǎn)期療效和預(yù)防術(shù)后并發(fā)癥的關(guān)鍵因素。
[0003]目前，臨床常用的韌帶固定方法是經(jīng)骨髓道可吸收界面螺釘固定。界面螺釘多由左旋聚乳酸(poly L-1actic acid, PLLA)構(gòu)成。PLLA具有良好的生物相容性和適宜的降解速度，隨著自身材料的吸收，骨組織同步的填充整個隧道，使植入韌帶與隧道形成良好的愈合。
[0004]然而，單純的PLLA沒有骨誘導(dǎo)功能，可因隧道內(nèi)成骨速度與PLLA吸收程度不匹配而使隧道擴(kuò)大，韌帶固定不穩(wěn)。臨床上當(dāng)前運用復(fù)合羥基磷灰石(hydroxyapatite, HAP)的可吸收螺釘在誘導(dǎo)成骨方面有一定程度改善，然而，由于人工合成HAP與人體骨骼中HAP存在尺寸差異，導(dǎo)致成骨效果依舊不佳。因此，通過構(gòu)建近似于人體HAP的20納米HAP與PLLA制備可吸收界面螺釘可改進(jìn)其誘導(dǎo)成骨活性。
[0005]同時，相關(guān)研究指出，人體正常韌帶-骨連接結(jié)構(gòu)中的鈣化纖維軟骨層是連接韌帶和骨組織的主要過渡結(jié)構(gòu)。鈣化纖維軟骨主要由大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix, ECM)包繞少量肥大軟骨細(xì)胞構(gòu)成。非膠原蛋白作為ECM中的主要組成部分，其中軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(cartilage oligomeric matrix protein, COMP)具有誘導(dǎo)基質(zhì)干細(xì)胞粘附、軟骨分化、參與調(diào)控ECM與骨組織見的構(gòu)建，維持鈣化軟骨過渡結(jié)構(gòu)的作用。
[0006]殼聚糖、透明質(zhì)酸均具有良好的生物相容性和可降解性，廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域。脂質(zhì)體因其良好的脂溶性常作為細(xì)胞轉(zhuǎn)染的工具，通過構(gòu)建pEGFP-COMP重組質(zhì)粒，并利用脂質(zhì)體進(jìn)行包裹可以有效提高重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率，并方便借助綠色熒光蛋白監(jiān)控轉(zhuǎn)染效率。借助層層靜電自組裝技術(shù)，利用殼聚糖、透明質(zhì)酸、脂質(zhì)體所帶電荷的正負(fù)性，將pEGFP-COMP組裝至可吸收界面螺釘表面，在生理條件下促使基因薄層降解并長時間釋放質(zhì)粒DNA，利用基因治療手段促進(jìn)鈣化纖維軟骨形成以促進(jìn)骨-韌帶愈合。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的之一是提供一種可吸收復(fù)合界面的螺釘，是一種軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP)基因薄層組裝的可吸收復(fù)合界面螺釘，該界面螺釘具有良好的生物相容性和骨誘導(dǎo)性，最重要的是能夠 有效的調(diào)控COMP基因的釋放以增強(qiáng)促鈣化纖維軟骨效應(yīng)，提高宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染率，誘導(dǎo)韌帶植入后骨-韌帶界面良好愈合，為關(guān)節(jié)內(nèi)韌帶重建手術(shù)聯(lián)合基因治療提供全新思路。
[0008]本發(fā)明所述的一種可吸收復(fù)合界面的螺釘，由螺釘帽1、螺桿2、螺釘頭3、連接件
4、基因薄層5構(gòu)成，螺釘帽I與螺桿2通過連接件4固定連接，螺釘頭3設(shè)置在螺桿2頭端，螺釘帽I上端設(shè)有與安裝螺釘扭力扳手相對應(yīng)的凹槽6，螺桿2外緣設(shè)有自攻螺紋7，基因薄層5覆蓋在螺桿螺紋表面。
[0009]所述基因薄層5由殼聚糖的基底層及由內(nèi)向外依次間隔覆有透明質(zhì)酸層和脂質(zhì)體-2000包裹的pEGFP-COMP質(zhì)粒層形成的活化層。殼聚糖基底層為I層，所述活化層中脂質(zhì)體包裹的pEGFP-COMP質(zhì)粒層和透明質(zhì)酸層總層數(shù)為4-24層。
[0010]本發(fā)明的目的之二是提供所述的可吸收復(fù)合界面的螺釘?shù)闹苽浞椒?，通過以下步驟:
(1)左旋聚乳酸(PLLA)以0.2g mr1的濃度溶解于I，4-環(huán)氧六環(huán)溶液中，然后加入20羥基磷灰石(HAP)粉末，上述兩者質(zhì)量比為2:8進(jìn)行混合； (2)將直徑為280-450um的NaCl顆粒加入直徑為4mm的螺釘模型中緊密填充，置于70°C飽和水蒸氣的環(huán)境中1.5h，室溫冷卻后，將步驟(1)所得的PLLA/20HAP混合物緩慢加入其中，在0.07-0.08Mpa條件下抽真空除去氣泡，在_40°C冰箱中預(yù)凍3小時后進(jìn)行冷凍24h,作為樣品；
(3)將步驟(2)中制得的樣品浸泡在蒸餾水中24h，除去NaCl，再次冷凍干燥制得PLLA/20HAP可吸收復(fù)合界面螺釘；
(4)將步驟(3)中制得的PLLA/20HAP可吸收復(fù)合界面螺釘浸于殼聚糖溶液中30分鐘后，用opt1-DMEM培養(yǎng)液浸洗2-3次，每次1_2分鐘；
(5)將步驟(4)中制得的PLLA/20HAP可吸收復(fù)合界面螺釘浸于透明質(zhì)酸溶液中10-15分鐘后，用去離子水浸洗2-3次，每次1-2分鐘；
(6)將步驟(5)中制得的PLLA/20HAP可吸收復(fù)合界面螺釘浸于脂質(zhì)體包裹的pEGFP-COMP質(zhì)粒的opt1-DMEM培養(yǎng)液中10-15分鐘后，用去離子水浸洗2_3次，每次1_2分鐘；
(7)依次重復(fù)步驟(5)和步驟(6)，直至得到所需的COMP基因薄層組裝的可吸收復(fù)合界面螺釘。
[0011]所述的殼聚糖溶液的濃度為5mg/ml ;所述的透明質(zhì)酸溶液濃度為0.5mg/ml。
[0012]所述的脂質(zhì)體包裹的pEGFP-COMP質(zhì)粒的opt1-DMEM培養(yǎng)液中，將200ul脂質(zhì)體-2000與IOOug質(zhì)?；旌希囵B(yǎng)液的pH值為7.4。
[0013]本發(fā)明的有益效果是:
1、本發(fā)明具有良好的生物相容性和骨誘導(dǎo)性，最重要的是能夠有效的調(diào)控COMP基因的釋放以增強(qiáng)促鈣化纖維軟骨效應(yīng)，提高宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染率，誘導(dǎo)韌帶植入后骨-韌帶界面良好愈合，具有廣闊的臨床運用前景。
[0014]2、本發(fā)明突破了傳統(tǒng)手術(shù)治療關(guān)節(jié)內(nèi)韌帶損傷的模式，運用手術(shù)治療結(jié)合基因治療，將促進(jìn)鈣化纖維軟骨形成的COMP基因直接組裝在螺釘表面并有效控制其釋放到局部組織發(fā)揮效應(yīng)，為關(guān)節(jié)內(nèi)韌帶損傷的治療提供全新思路。
[0015]3、本發(fā)明所述的制造方法中利用脂質(zhì)體包裹pEGFP-COMP，充分發(fā)揮脂質(zhì)體的脂溶性及其與細(xì)胞膜的親和力，可有效的增加單一質(zhì)粒層的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，更好地發(fā)揮基因治療的效力。
[0016]4、本發(fā)明所述的制造方法利用殼聚糖、透明質(zhì)酸、脂質(zhì)體的靜電作用使質(zhì)粒pEGFP-COMP在界面螺釘表面逐層沉積，不僅操作便捷而且成本低廉，具有極強(qiáng)的可行性，適合用于產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為本發(fā)明主視結(jié)構(gòu)示意圖。
[0018]圖2為本發(fā)明橫斷面基因薄層組裝示意圖。
[0019]圖3為本發(fā)明基因薄層表面樣貌的掃描電鏡照片。
[0020]圖4為本發(fā)明隨組裝基因薄層層數(shù)增加表面接觸角變化趨勢。
[0021]圖5為本發(fā)明隨組裝基因薄層層數(shù)增加260nm紫外吸光度變化趨勢。
[0022]圖6為不同層數(shù)的基因薄層轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)48h熒光顯微鏡照片。
[0023]圖7為不同層數(shù)的基因薄層轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)48hGFP熒光強(qiáng)度變化趨勢。
【具體實施方式】
[0024]本發(fā)明結(jié)合附圖和實施例作進(jìn)一步的說明。
[0025]實施例1
參見圖1、圖2，本發(fā)明所述的一種可吸收復(fù)合界面的螺釘，由螺釘帽1、螺桿2、螺釘頭
3、連接件4、基因薄層5構(gòu)成，螺釘帽I與螺桿2通過連接件4固定連接，螺釘頭3設(shè)置在螺桿2頭端，螺釘帽I上端設(shè)有與安裝螺釘扭力扳手相對應(yīng)的凹槽6，螺桿2外緣設(shè)有自攻螺紋7，基因薄層5覆蓋在螺桿螺紋表面。
[0026]實施例2C0MP基因薄層組裝的可吸收復(fù)合界面螺釘制造并表征檢測
(1)PLLA以0.2g ml-1的濃度溶解于1，4-環(huán)氧六環(huán)溶液中，然后加入20HAP粉末，上述兩者質(zhì)量比為2:8進(jìn)行混合；
(2)將直徑為280-450um的NaCl顆粒加入直徑為4mm的螺釘模型中緊密填充，置于70°C飽和水蒸氣的環(huán)境中1.5h，室溫冷卻后，將步驟(1)所得的PLLA/20HAP混合物緩慢加入其中，在0.07-0.08Mpa條件下抽真空除去氣泡。在_40°C冰箱中預(yù)凍3小時后進(jìn)行冷凍24h ；
(3)將步驟(2)中制得的樣品浸泡在蒸餾水中24h，除去NaCl，再次冷凍干燥制得PLLA/20HAP可吸收復(fù)合界面螺釘；
(4)將步驟(3)中制得的PLLA/20HAP可吸收復(fù)合界面螺釘浸于5mg/ml殼聚糖溶液中30分鐘后，用opt1-DMEM培養(yǎng)液浸洗2次，每次I分鐘；
(5)將步驟(4)中制得的PLLA/20HAP可吸收復(fù)合界面螺釘浸于0.5mg/ml透明質(zhì)酸溶液中10分鐘后，用去離子水浸洗2次，每次I分鐘；
(6)將步驟(5)中制得的PLLA/20HAP可吸收復(fù)合界面螺釘浸于脂質(zhì)體包裹的pEGFP-COMP質(zhì)粒的pH為7.4的opt1-DMEM培養(yǎng)液中10分鐘后，用去離子水浸洗2次，每次1-2分鐘；
(7)依次重復(fù)步驟(5)和步驟(6)，直至得到所需的COMP基因薄層組裝的可吸收復(fù)合界面螺釘。
[0027]所述的脂質(zhì)體包裹的pEGFP-COMP質(zhì)粒的opt1-DMEM培養(yǎng)液中，將200ul脂質(zhì)體-2000與IOOug質(zhì)粒混合，培養(yǎng)液的pH值為7.4。
[0028]通過場發(fā)射掃描電子顯微鏡檢測本發(fā)明基因薄層表面樣貌。通過靜滴接觸角測量儀檢測基因薄層組裝過程中依次組裝各層的表面接觸角。通過紫外分光光度計檢測基因薄層組裝過程中依次組裝一組透明質(zhì)酸+pEGFP-COMP質(zhì)粒層的260nm紫外吸光度。
[0029]本實例中，透明質(zhì)酸層和pEGFP-COMP質(zhì)粒層總層數(shù)不低于4層可維持界面螺釘表面較穩(wěn)定的基因薄層結(jié)構(gòu)，通過增加基因薄層層數(shù)以達(dá)到調(diào)控界面螺釘轉(zhuǎn)載基因量的目的?？倢訑?shù)以4-24層最佳，從而實現(xiàn)特定時間內(nèi)質(zhì)粒DNA保證一定濃度持續(xù)釋放，同時避免過多層數(shù)所導(dǎo)致質(zhì)粒DNA短時間釋放難以控制或過量。
[0030]本實例中，界面螺釘在殼聚糖溶液中可浸泡30分鐘，但并不代表本發(fā)明將其局限于30分鐘，浸泡的目的在于使殼聚糖層能夠借助其所帶的正電荷充分吸附界面螺釘表面，浸泡時間長殼聚糖聚陽離子層的充分形成，為隨后的基因薄層組裝打下聚陽離子薄層基礎(chǔ)。因此浸泡時間以殼聚糖層充分形成為宜。
[0031]本實例中，界面螺釘在透明質(zhì)酸及opt1-DMEM培養(yǎng)液中可浸泡10_15分鐘，但并不代表本發(fā)明將其局限于10-15分鐘，浸泡的目的在于使透明質(zhì)酸層及脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒層能夠借助層層靜電自組裝的原理依次間隔附于界面螺釘表面，浸泡時間長更利于聚陰離子或聚陽離子層的充分形成，使其在界面螺釘覆蓋更完整，單層更加平整。因此浸泡時間以各層達(dá)到最佳覆蓋效果為宜。
[0032]本實例中，界面螺釘在各溶液中浸泡結(jié)束后，均需要用去離子水進(jìn)行浸泡洗滌，各個過程中去離子水浸洗次數(shù)為2-3次，每次1-2分鐘為宜。原因在于浸洗的主要目的是去除在同一層中可能形成的雙層或多層聚陰、陽離子，以免導(dǎo)致隨后的組裝結(jié)構(gòu)失去穩(wěn)定，同時浸洗時間過長易導(dǎo)致已組裝的多層結(jié)構(gòu)發(fā)生解離。
[0033]參見圖3，結(jié)果顯示，隨組裝基因薄層層數(shù)增加表面粗糙程度逐漸增加，說明組裝過程中界面螺釘表面活性物質(zhì)持續(xù)增加。
[0034]參見圖4，結(jié)果顯示，隨組裝基因薄層層數(shù)增加表面接觸角呈波動性變化。說明組裝過程中界面螺釘表面呈兩種物質(zhì)交替性組裝。
[0035]參見圖5，結(jié)果顯示，隨組裝基因薄層質(zhì)粒層數(shù)增加260nm紫外吸光度增加。說明隨組裝層數(shù)的增加，基因數(shù)量逐漸增加。
[0036]實施例3不同層數(shù)的基因薄層對間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染的效率探究。
[0037]采用例I的制造方法，分別制造0、4、8和12層的COMP基因薄層組裝的可吸收復(fù)合界面螺釘。采用密度梯度離心法和差時貼壁法培養(yǎng)SD大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞，將間充質(zhì)干細(xì)胞接種到六孔板與不同層數(shù)的界面螺釘共培養(yǎng)，細(xì)胞接種密度為40000cells/cm2。用DMEM培養(yǎng)基加10%胎牛血清進(jìn)行培養(yǎng)。48h后用熒光顯微鏡觀察不同層數(shù)的各組中GFP熒光以檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況，通過IPP6.0軟件計算各組中GFP熒光強(qiáng)度。
[0038]參見圖6、7，結(jié)果顯示，隨界面螺釘基因薄層層數(shù)增加，GFP熒光強(qiáng)度增加。說明界面螺釘上的基因薄層有效釋放基因，并隨基因數(shù)量增加轉(zhuǎn)染效率逐漸提高。
[0039]實施例4不同層數(shù)的基因薄層對間充質(zhì)干細(xì)胞成纖維軟骨影響 采用例I的制造方法，分別制造0、4、8和12層的COMP基因薄層組裝的可吸收復(fù)合界面螺釘。采用密度梯度離心法和差時貼壁法培養(yǎng)SD大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞，將間充質(zhì)干細(xì)胞接種到六孔板與不同層數(shù)的界面螺釘共培養(yǎng)，細(xì)胞接種密度為20000cells/cm2。用DMEM培養(yǎng)基加10%胎牛血清進(jìn)行培養(yǎng)，每隔2天換液一次。5d后以0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞，用TRIzol裂解細(xì)胞，提RNA后行RT-PCR，檢測不同層數(shù)的各組中II型膠原纖維的表達(dá)量。[0040]無需進(jìn)一步詳細(xì)闡述，相信采用前面所公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可最大限度地應(yīng)用本發(fā)明。因此，前面的實施方案應(yīng)理解為僅是舉例說明，而并非以任何方式限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。所以本發(fā)明的主要范圍將由附屬的權(quán)利要求及其等同體來確定。
【權(quán)利要求】
1.一種可吸收復(fù)合界面的螺釘，其特征在于，由螺釘帽(I)、螺桿(2)、螺釘頭(3)、連接件(4)、基因薄層(5 )構(gòu)成，螺釘帽(I)與螺桿(2 )通過連接件(4)固定連接，螺釘頭(3 )設(shè)置在螺桿(2)頭端，螺釘帽(I)上端設(shè)有與安裝螺釘扭力扳手相對應(yīng)的凹槽(6)，螺桿(2)外緣設(shè)有自攻螺紋(7 )，基因薄層(5 )覆蓋在螺桿螺紋表面。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種可吸收復(fù)合界面的螺釘，其特征在于，基因薄層(5)由殼聚糖的基底層及由內(nèi)向外依次間隔覆有透明質(zhì)酸層和脂質(zhì)體-2000包裹的pEGFP-COMP質(zhì)粒層形成的活化層，殼聚糖基底層為I層，所述活化層中脂質(zhì)體包裹的pEGFP-COMP質(zhì)粒層和透明質(zhì)酸層總層數(shù)為4-24層。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種可吸收復(fù)合界面的螺釘?shù)闹苽浞椒?，其特征在于，通過以下步驟: (1)左旋聚乳酸以0.2g mr1的濃度溶解于1，4_環(huán)氧六環(huán)溶液中，然后加入20HAP粉末，上述兩者質(zhì)量比為2:8進(jìn)行混合； (2)將直徑為280-450um的NaCl顆粒加入直徑為4mm的螺釘模型中緊密填充，置于70°C飽和水蒸氣的環(huán)境中1.5h，室溫冷卻后，將步驟(1)所得的PLLA/20HAP混合物緩慢加入其中，在0.07-0.08Mpa條件下抽真空除去氣泡，在_40°C冰箱中預(yù)凍3小時后進(jìn)行冷凍24h,作為樣品； (3)將步驟(2)中制得的樣品浸泡在蒸餾水中24h，除去NaCl，再次冷凍干燥制得PLLA/20HAP可吸收復(fù)合界面螺釘； (4)將步驟(3)中 制得的PLLA/20HAP可吸收復(fù)合界面螺釘浸于殼聚糖溶液中30分鐘后，用opt1-DMEM培養(yǎng)液浸洗2-3次，每次1_2分鐘； (5)將步驟(4)中制得的PLLA/20HAP可吸收復(fù)合界面螺釘浸于透明質(zhì)酸溶液中10-15分鐘后，用去離子水浸洗2-3次，每次1-2分鐘； (6)將步驟(5)中制得的PLLA/20HAP可吸收復(fù)合界面螺釘浸于脂質(zhì)體包裹的pEGFP-COMP質(zhì)粒的opt1-DMEM培養(yǎng)液中10-15分鐘后，用去離子水浸洗2_3次，每次1_2分鐘； (7)依次重復(fù)步驟(5)和步驟(6)，直至得到所需的COMP基因薄層組裝的可吸收復(fù)合界面螺釘。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種可吸收復(fù)合界面的螺釘?shù)闹苽浞椒ǎ涮卣髟谟?，殼聚糖溶液的濃度?mg/ml,透明質(zhì)酸溶液濃度為0.5mg/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種可吸收復(fù)合界面的螺釘?shù)闹苽浞椒ǎ涮卣髟谟?，脂質(zhì)體包裹的pEGFP-COMP質(zhì)粒的opt1-DMEM培養(yǎng)液中，將200ul脂質(zhì)體-2000與IOOug質(zhì)?；旌?，培養(yǎng)液的pH值為7.4。
【文檔編號】A61L31/08GK103893836SQ201410128124
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月1日
【發(fā)明者】嚴(yán)世貴, 吳浩波, 師鐘麗, 劉安 申請人:浙江大學(xué)